Oncologie

La production d'anticorps destinés à des partenaires de recherche passe ici par l'immunisation de rats sur une période de 88 à 365 jours. 60 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tués en fin de projet par exsanguination sous anesthésie pour obtenir le maximum de sérum et prélever des organes. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 12, 15 puis 10 injections selon les voies et subir jusqu'à 20 prélèvements sanguins, avec des boules inflammatoires sous-cutanées de moins de six millimètres dans une partie des cas. Le porteur présente ces anticorps comme des outils "essentiels" pour la recherche et le développement, et met en avant les centaines de publications de ses partenaires qu'ils ont alimentées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de générer des anticorps à partir de rat. L’immunisation des rate est réalisées par voie sous-cutanée, intra-veineuse ou par intra-musculaire sur une période de 88 à 365 jours. Cette immunisation va nous permettre de générer des anticorps spécifiques de l’antigène d’intérêt. Ces nouveaux anticorps ainsi produit sont des outils essentiels pour le monde de la recherche et développement. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés que nous avons générés ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la création de nouveaux anticorps monoclonaux et polyclonaux. Les anticorps jouent un rôle crucial dans la recherche scientifique et les applications thérapeutiques. Recherche Scientifique 1- Détection des protéines : Les anticorps permettent d’identifier et de mesurer certaines protéines dans des échantillons biologiques. 2- Analyse des cellules : Grâce à un marquage, les anticorps aident à reconnaître et à trier différents types de cellules. 3- Observation au microscope : Ils sont utilisés pour repérer des structures cellulaires. 4- Purification des protéines : Les anticorps permettent d’isoler des protéines d’intérêt à partir d’un mélange complexe. Applications Thérapeutiques 1- Traitements avec des anticorps monoclonaux : Utilisés contre le cancer, les maladies auto-immunes et certaines infections. 2- Thérapies ciblées : Les anticorps peuvent transporter des médicaments directement vers les cellules malades. 3- Neutralisation des micro-organisme : Ils peuvent bloquer l’action de virus ou de toxines bactériennes pour protéger l’organisme. 4- Stimulation du système immunitaire : Les anticorps peuvent renforcer ou réguler la défense immunitaire pour traiter certaines maladies, notamment le cancer. 5- Outils de diagnostic : Présents dans de nombreux tests médicaux, ils permettent la détection de différentes maladies. 1. . Les anticorps sont des outils puissants en recherche et en thérapeutique en raison de leur spécificité et de leur capacité à se lier à des cibles moléculaires précises. Leur utilisation continue de se développer, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour la recherche fondamentale et pour le traitement de maladies.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 12 injections. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 20 seconde, maximum 10 injections. Exsanguination sous anesthésie, sans réveil.

Impact sur les animaux

Il existe plusieurs effets indésirables pouvant toucher les rats au cours de ces programmes de recherche : La préhension de l’animal lors des prélèvements et des injections pouvant entraîner un léger stress. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une petite boule inflammatoire dont le diamètre ne dépasse pas 6 mm au maximum dans moins de 50% des cas l’apparition Pour les injections intra-musculaires, une très légère douleur pourrait avoir lieu lors de l’injection avec un adjuvant, une analgésie sera mise en place dans ce cas

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

À ce jour, il n'est pas envisageable de remplacer le modèle in vivo chez le rat pour la génération des anticorps. En effet, la réponse immunitaire est un phénomène complexe qui implique la coopération de multiples types cellulaires, pour lequel il n'existe pas d'équivalent in vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, elles ne permettent pas d'obtenir des anticorps de qualité équivalente (propriétés et fonctions). Ces technologies de développement d'anticorps in vitro ne sont pas encore matures. Elles nécessitent un équipement spécifique et des réactifs adaptés et les chances de succès sont limitées, comme le démontre le faible nombre d'anticorps cliniques généré par ces approches alternatives.

Réduction

Le nombre de rat utilisé pour chaque expérimentation est réduit à un minimum de 2 animaux. Pour les anticorps polyclonaux, la purification des anticorps requiert une quantité conséquente de sérum, c'est pourquoi nous utilisons généralement 2 rats par immunogène. Pour les anticorps monoclonaux, nous immunisons 2 rats par immunogène. La réponse immunitaire variant d'une rat à l'autre et selon la nature des immunogènes, plusieurs rats sont nécessaires pour générer des anticorps monoclonaux de qualité.

Raffinement

Les rats sont logés dans des cages standard, en groupe (2 par cage). Ils bénéficient d'un enrichissement sous forme de tunnels pour améliorer leur environnement. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des rats pour limiter le stress au maximum. De plus, ils sont anesthésiés à l'isoflurane 3% lors de chaque intervention pour minimiser la douleur et le stress.

Choix des espèces

Le rat montre une très bonne réponse immunitaire basée sur les anticorps. De plus de nombreux outils existent déjà pour l’utilisation des anticorps générés dans la recherche et le diagnostic. Nous utilisons des jeunes adultes (environ 7-8 semaines) car c'est à cet âge que la réponse immunitaire est optimale.

Dix ponctions sanguines mensuelles dans la veine temporale, de un mois à dix mois de vie : une partie des 876 souris de ce projet subira ce suivi, dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée. Toutes seront tuées, la majorité des analyses se faisant après la mort. Le porteur veut comprendre comment la baisse d'une protéine de recyclage des cellules sanguines, observée avec l'âge, favorise les maladies du sang. Les souris sont gardées jusqu'à 24 mois pour suivre ce vieillissement, et toute anomalie au point de ponction, abcès, gonflement ou perte de poils, entraîne une mise à mort immédiate.

Objectifs

Ce projet a pour objectifs d'étudier l'importance d’une protéine impliquée dans la dégradation et le système de recyclage des cellules sanguines. Ce recyclage est très important pour la fabrication des cellules du sang. Lors du vieillissement cette protéine diminue, et nous savons que les cellules du sang sont moins efficaces et moins bien renouvelées. C’est aussi au cours du vieillissement qu’apparaissent certains maladies du sang. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’importance de la dégradation et du recyclage dans l’apparition des maladies du sang.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont une meilleure compréhension des processus de fabrication des cellules sanguines au cours du vieillissement. Les connaissances acquises grâce à ces modèles de souris nous permettront à moyen terme une meilleure prise en charge des patients du diagnostic jusqu’au choix du traitement de la maladie sanguine.

Procédures

Une partie des animaux subit un prélèvement sanguin mensuel, de l’âge d’un mois à dix mois. Ce geste, réalisé avec une aiguille très fine, dure environ deux minutes, contention comprise, et permet de prélever un petit volume de sang. Une légère pression est appliquée sur le point de ponction pour arrêter le saignement.

Impact sur les animaux

La suppression de notre protéine d’intérêt dans les cellules du sang mime la perte d’expression de la protéine au cours du vieillissement chez l’Homme. Nous nous attendons à reproduire chez ces souris des désordres dans la composition du sang, telle que la diminution des globules rouges. Ces désordres se présentent chez les personnes âgées comme des maladies sans signes cliniques et/ou souffrance particulières. Le diagnostic se fait la plupart du temps au regard d’une prise de sang caractérisée par une diminution de certains types de cellules. De fait durant une grande partie de la vie des souris les effets indésirables attendus concernent 1. l'état des souris vieillissantes (aspect général, mobilité, qualité du poil). 2. Les prélèvements sanguins pour les souris en suivi ; avec une douleur brève et de faible intensité. 3.la fragilisation possible des souris pouvant favoriser l’apparition d’infections.

Devenir

La majorité des expériences seront réalisées sur les animaux après les avoir euthanasiés. Seule une faible partie de ces souris seront suivies pendant 10 mois grâce à des pesées, et des prélèvements pour l’analyse de leur sang.

Remplacement

C’est dans la moelle osseuse que se déroule la fabrication de l’ensemble des cellules composant le sang. C’est un processus très complexe impliquant divers types de cellules. La moelle osseuse constitue un environnement riche dans lequel ont lieu des interactions très complexes qu’il est aujourd’hui encore impossible de reproduire in vitro. Afin de démontrer que la diminution de notre protéine d’intérêt induit des désordres au niveau du sang, nous avons besoin d'avoir recours à des animaux. Grâce à ces animaux nous avons une chance de mimer le plus justement possible les désordres observés chez l’homme, et donc plus de chances de trouver de nouvelles alternatives thérapeutiques.

Réduction

Les analyses statistiques ont pour but de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaires à l'observation de l'effet que nous voulons démontrer dans le sang. Il est important de noter que les suivis sanguins mensuels sont menés sur les mêmes animaux prévues pour les expérimentations post-mortem (après la mort) de manière à utiliser le moins d’animaux possible dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Concernant les souris en suivi, seul un nombre limité de souris seront manipulées mensuellement, nous permettant de suivre l'évolution du poids de l'aspect et de la numération sanguine au cours des 10 premiers mois de vie. Ce suivi nous permettra de mettre en évidence des modifications précoces de paramètres sanguins susceptibles de varier au cours de l'apparition des désordres hématologiques induits par l'invalidation de notre protéine d'intérêt. L'objectif à terme étant d'adapter les points limites de nos modèles murins pour garantir un suivi exhaustif, prédictif et donc d'améliorer le bien-être des souris. Pour limiter le stress lors du suivi, et notamment lors du prélèvement ; la ponction s'effectue au niveau de la veine temporale, c'est un geste rapide ne nécessitant qu'une simple contention. Chaque mois avant le prélèvement la vérification de l’aspect du point de ponction est vérifié (absence d’abcès, de gonflement, perte de poils…), si la moindre anomalie est notée la souris sera automatiquement euthanasiée. Lorsqu'elles sont manipulées les souris sont soulevées à l'aide d'un support (igloo présent dans la cage) pour pallier aux blessures engendrées lors de leur manipulation par la queue uniquement. En termes d'élevage, les cages de plusieurs males seront régulièrement enrichies par des bâtonnets de bois pour diminuer l'agressivité.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris d'une souche largement employée en recherche biomédicale pour sa génétique bien caractérisée, sa grande homogénéité et sa disponibilité commerciale. Leur cycle de reproduction court et leur facilité d’élevage permettent de constituer rapidement des cohortes importantes et standardisées. Cette souche est bien documentée dans la littérature, ce qui facilite la comparaison avec d’autres études. Les animaux étudiés ont entre 3 et 24 mois, ce qui permet de suivre l’évolution du phénotype en lien avec le vieillissement. L’inclusion de souris âgées jusqu’à 24 mois est essentielle pour étudier les processus physiologiques et pathologiques associés à l’âge. Le gène d’intérêt étant localisé sur le chromosome X, les deux sexes sont inclus dans les protocoles.

Un à deux mois de restriction d'eau, la tête maintenue par une barre en titane vissée sur le crâne pendant des séances quotidiennes d'une heure : 750 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope où les virus ont été injectés. Toutes reçoivent une injection virale dans le cerveau, 250 une fenêtre crânienne, 500 un implant, puis sont transportées vers un second établissement. L'objet est fondamental, comprendre comment le cortex moteur secondaire arbitre entre exploiter ce que l'animal sait déjà et explorer autre chose. Le porteur décrit la pose de l'implant comme "non invasive et non douloureuse" tout en la réalisant sous anesthésie générale avec couverture antalgique.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un noeud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs vise donc à éclairer le rôle du le cortex moteur secondaire pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants.Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux comme la schizophrénie, les troubles de l’attention et de l’hyperactivité et la depression. En conséquence, ces patients ont moins de flexibilité d’apprentissage, ils s’adaptent moins aux nouveaux environnements, utilisent des strategies habituelles et présentent une extinction plus rapide des apprentissages. Notre projet permet d’étudier ces paramètres chez l’animal lors d’une tâche comportementale pour comprendre le rôle des régions cérébrales impliquées.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 semaines. Puis les animaux seront soumis à une chirurgie avec injection d’un virus puis pose d’une fenêtre crânienne ou pose d’un implant. Ces chirurgies se feront sous anesthésie, tous les animaux auront une injection de virus, 250 animaux auront une chirurgie avec pose d’une fenêtre crânienne et 500 animaux la pose d’un implant. Après 3 à 4 semaines de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 7 jours. Ensuite, les animaux auront une anesthésie pour permettre la pose d’une barre en titane nécessaire au comportement qui se fait en « tête restreinte», ils seront soumis à contrôle hydrique qui durera entre 1 et 2 mois. Pendant cette période, les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (7 jours), l’apprentissage (10 jours) et le contrôle (au minimum 1 mois). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 20 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront au maximum une session d’une heure par jour. Les chirurgies pour l'injection du virus puis la pose d'une fenêtre cranienne ou la pose d'un implant se feront dans le premier établissement utilisateur. La pose de la barre en titane, le contrôle hydrique ainsi que le comportement auront lieu dans le second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux : ● Le risque de douleur durant la chirurgie● Le risque de douleur aiguë liée à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le contrôle hydrique ● Contention "tête restreinte"

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certaines tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groups expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique grâce à la buprénorphine injectée avant et après la chirurgie. Une injection de Mélloxicam en sous cutanée sera réalisée après la chirurgie pour augmenter la durée de la couverture analgésique. La couverture antalgique agira dès le réveil de l’animal et sera maintenue avec une injection de Buprénorphine et de Méloxicam 24h post chirurgie. Si l’animal montre des signes de souffrance de nouvelles injections seront réalisées toutes les 24h. La procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase sombre, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après le contrôle hydrique. Les animaux sont transférés entre les deux EU qui sont situés dans le même bâtiments dans leurs cages d'hébergement avec des chariots spécifiques. Les cages sont placées dans des sacs en kraft pour les isoler de la lumière et de tout contact visuel. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Jeûnes répétés jusqu'à douze heures, six tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, 72 à 120 heures enfermés seuls en cage de calorimétrie : 600 souris et 300 rats vont subir ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, tous tués ensuite pour prélèvement d'organes. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis reçoivent des molécules par gavage, par injection intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique. Le porteur ramène l'effet de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité en cage. Le laboratoire est un organisme de recherche contractuelle qui teste ici les molécules de ses clients, et le résumé ne nomme ni les composés ni le nombre de prélèvements sanguins prévus.

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé, qui, par l’ajout d’un établissement utilisateur (EU), devient multisite (EU 2/2 et EU 1/2).

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ) (EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Les souris et les rats seront hébergés en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal. Le transport des souris entre les établissements se fera avec une société spécialisé, et se déroulera selon les mesures de raffinement suivantes: Personnel qualifié aux bonnes pratiques de manutention animale et de transport inter-établissements seront mobilisés.Distance du trajet maîtrisée : le transport couvrira une distance d’environ 9 km entre les établissements, ce trajet étant court pour minimiser le stress et la fatigue liés au déplacement.Conditions de transport optimisées : caisses homologuées dotées d’un environnement stable — aérées, obscurité partielle, température contrôlée. Enrichissement et confort : maintien des repères olfactifs grâce à une litière propre et du matériel de nidification issu de leur cage d’origine. Hydratation adaptée : dispositif d’accès à l’eau valide pour le transport (gel hydratant) pour éviter le jeûne prolongé. Minimisation de la durée : en plus d’une courte distance, le trajet sera rendu le plus rapide possible, y compris au niveau de la planification logistique (horaires, conditions de circulation). Suivi avant/après transport : observation systématique de l’état des animaux au départ et à l’arrivée pour détecter tout signe de désordre physiologique ou comportemental.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

Dépourvues de système immunitaire fonctionnel, des souris nude sont utilisées pour qu'elles acceptent une lignée de cancer du poumon humain. 1 008 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements et dosages. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le poumon gauche sous anesthésie, puis jusqu'à dix séances d'imagerie de trente minutes espacées d'une semaine, et pour certaines deux à trois anesthésies supplémentaires pour la nébulisation des nanothérapies. Le porteur ramène les effets indésirables attendus au stress des manipulations, qu'il juge comparable à celui d'un change de cage, sans revenir sur la tumeur pulmonaire qui se développe pendant ces dix semaines.

Objectifs

Avec presque 30000 décès par an en France, le cancer du poumon est le cancer le plus mortel. Les options thérapeutiques actuelles ne sont pas encore optimales et nécessitent de proposer de nouvelles options. Notre objectif est donc d’évaluer dans un modèle murin de tumeurs pulmonaires de nouveaux nanosystèmes permettant l’administration optimisée de chimiothérapies par adressage avec des peptides ayant une action positive sur la pénétration intracellulaire des vecteurs.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de documenter l’apport de nanovecteurs porteur de peptides pénétrant sur la limitation de la croissance de tumeurs pulmonaire implantées chez la souris.

Procédures

Tous les animaux de cette étude recevront une injection de cellules tumorales au niveau du poumon gauche. Ce geste sera réalisé sous anesthésie qui ne durera pas plus de 5 minutes. Pour les animaux traités par nébulisation ou par injection intraveineuse, 2 ou 3 anesthésies gazeuses supplémentaires, d’une durée de 10 min maximum seront réalisées. Concernant les imageries, elles seront également réalisées sous anesthésie et seront au nombre de 10 maximum, espacées d'une semaine, et d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au stress induit par les manutentions lors de la piqure pour l’injection des cellules tumorales, de la nébulisation des thérapies ou du contrôle IRM. Le niveau de stress généré par ces gestes sera comparable à celui induit par les changes.

Devenir

A la fin de chacune des procédures les animaux sont euthanasiés pour prélèvements et dosages.

Remplacement

Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les nanothérapies que nous allons évaluer. Les objectifs du projet étant d’évaluer leur efficacité thérapeutique dans un contexte complexe où le devenir des nanomédicaments peut être impacté par le microenvironnement de l’hôte, l’utilisation d’animaux est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante pour valider les résultats expérimentaux.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie (système de chauffage asservi à la température rectale) pendant toutes les procédures avec une attention particulière lors des examens IRM - où un accès visuel à l'animal n'est pas possible – par un suivi complémentaire du rythme respiratoire afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Afin de réduire l’inconfort de l’animal un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué à chaque phase des protocoles.

Choix des espèces

La lignée tumorale de cancer du poumon étant humaine, des souris nude (mâle et femelle) seront utilisées, cette espèce est retenue car le modèle ainsi obtenu est un modèle de référence. Les animaux inclus dans l’étude sont des animaux adultes âgés de 8-10 semaines ayant attient la maturité sexuelle.

Élevées vingt-huit jours dans une eau dont la teneur en oxygène est abaissée à 60 % de la normale, des truites arc-en-ciel de 30 grammes sont pêchées par lots à six, douze, vingt-quatre, quarante-huit et soixante-douze heures, puis à quatorze et vingt-huit jours, anesthésiées et tuées pour prélever branchies, cerveau, foie, intestin et muscles. 270 poissons vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une léthargie passagère et affirme que le taux d'oxygène restera dans des normes comparables à celles d'un élevage de production à forte densité. Les 174 truites qui ne sont pas prélevées retournent dans le circuit d'élevage traditionnel, donc vers la filière alimentaire.

Objectifs

La croissance démographique mondiale, qui devrait porter la population à 9,7 milliards d’habitants d’ici 2050, pose un défi majeur pour garantir un approvisionnement alimentaire durable. L'aquaculture, qui fournit déjà 56% des poissons consommés dans le monde, jouera très certainement un rôle clé dans la réponse à ce défi. Cependant, le changement climatique menace la durabilité de ce secteur, confronté à des phénomènes tels que la hausse des températures, l’acidification et la baisse d’oxygène (appelée hypoxie) des milieux d’élevage. Dans ce contexte, il s'avère essentiel de mieux comprendre comment les poissons réagissent à ces situations de stress. Notre projet s’intéresse à un mécanisme naturel que possèdent les cellules des poissons pour faire face à des conditions défavorables, notamment quand il y a peu d’oxygène dans l’eau. Ce mécanisme, appelé « autophagie médiée par les chaperonnes », aide les cellules à se protéger et à fonctionner correctement. En étudiant ce processus chez la truite arc-en-ciel (le poisson le plus élevé en France), nous espérons mieux comprendre comment elle réagit au manque d’oxygène, quels organes sont les plus sensibles, et si ce mécanisme peut être renforcé. Ces connaissances pourraient ensuite aider à adapter les pratiques d’élevage (alimentation, sélection des poissons, gestion des bassins) pour rendre les poissons plus résistants aux variations de leur environnement. En résumé, ce projet vise à améliorer la santé et la robustesse des poissons d’élevage pour assurer une production durable, dans un monde où le climat change rapidement.

Bénéfices attendus

Les baisses brusques et temporaires du niveau d’oxygène dans l’eau sont difficiles à éviter et peuvent entraîner des épisodes de mortalité massive dans les élevages, un phénomène qui risque de s’intensifier avec la hausse des températures extrêmes induites par le changement climatique. Contraints par leur environnement d’élevage, les poissons n’ont aucune possibilité d’échapper à ces conditions défavorables, ce qui compromet à la fois leur bien-être et leur croissance. Dans ce contexte, il s'avère essentiel de mieux comprendre comment les poissons réagissent à ces situations de stress, afin de développer de nouvelles stratégies d’élevage permettant d’accroitre la robustesse des animaux et garantir une production stable et plus prévisible. Notre projet s’intéresse à un mécanisme naturel que possèdent les cellules des poissons pour faire face à des conditions défavorables, notamment quand il y a peu d’oxygène dans l’eau. Ce mécanisme, appelé « autophagie médiée par les chaperonnes », aide les cellules à se protéger et à fonctionner correctement. En étudiant ce processus chez la truite arc-en-ciel (le poisson le plus élevé en France), nous espérons mieux comprendre comment elle réagit au manque d’oxygène, quels organes sont les plus sensibles, et si ce mécanisme peut être renforcé. Ces connaissances pourraient ensuite aider à adapter les pratiques d’élevage (alimentation, sélection des poissons, gestion des bassins) pour rendre les poissons plus résistants aux variations de leur environnement. En comprenant mieux les capacités naturelles d’adaptation des poissons, ce projet pourrait ouvrir la voie à des méthodes d’élevage plus efficaces et durables, mieux adaptées aux défis climatiques de demain.

Procédures

Les truites de 30 g seront soumises à deux conditions expérimentales distinctes : (i) Une condition standard avec un niveau d’oxygène dissous couvrant les besoins physiologiques des truites et (ii) une condition test dans laquelle la teneur en oxygène sera réduite à 60 % de la condition standard. L’expérimentation se déroulera en deux phases : Lors de la première expérience, les poissons seront élevés pendant 28 jours dans l’une des deux conditions mentionnées. Chaque condition sera testée dans trois bassins indépendants, contenant chacun 60 truites, soit un total de 360 poissons. Les paramètres de survie et de croissance seront suivis tout au long de l’expérience. Pour évaluer la réponse à court et long terme à l’hypoxie, des échantillonnages seront réalisés à différents temps (6, 12, 24, 48 et 72 heures après le début de l’expérience, ainsi que 14 et 28 jours après le début de l’expérience). Lors de chaque prélèvement, 4 poissons par bac seront euthanasiés (soit 12 poissons par condition et par temps de prélèvement), puis des prélèvements seront réalisés sur les branchies, cerveau, foie, intestin et muscles. Lors de la seconde expérience, les truites seront élevées dans les mêmes conditions expérimentales que précédemment. Chaque condition sera testée dans trois bassins indépendants, contenant 30 truites par bassin, soit un total de 180 poissons. À un temps de prélèvement défini sur la base des résultats de la première expérience, 12 poissons par condition (4 par bac) seront euthanasiés afin de procéder au prélèvement du ou des tissus le(s) plus pertinent(s).

Impact sur les animaux

La baisse d’oxygène est susceptible d’induire un stress modéré. Ce stress pourrait entraîner une légère léthargie au début, le temps que les poissons s'habituent, mais cette gêne sera temporaire. Toutefois, le taux d'oxygénation en condition hypoxique sera maintenu dans des normes acceptables et similaires à celles pouvant exister en élevage de production à forte densité.

Devenir

Première expérience : Un total de 12 poissons par condition et par temps de prélèvement seront prélevés et euthanasiés afin de procéder aux analyses prévues sur les différents tissus et atteindre l’objectif de l’expérience. En fin d’expérimentation, les poissons restants seront remis dans le circuit d’élevage traditionnel. Seconde expérience : Un nombre réduit de poissons sera prélevé pour des analyses ciblées (douze poissons par condition, soit quatre par bac), afin de procéder aux analyses prévues sur les différents tissus et atteindre l’objectif de cette seconde expérience Comme pour la première expérience, les poissons non utilisés seront remis dans le circuit d’élevage traditionnel.

Remplacement

La finalité de cette étude est la production de connaissances concernant l'amélioration des conditions d’élevage des poissons dans un contexte de changement climatique. Elle ne peut donc pas être étudiée avec des cellules ou des modèles mathématiques.

Réduction

La réduction est un objectif réel, le nombre de poissons par bassin est calculé à minima, compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans les expériences antérieures, tout en maintenant des conditions d’élevage optimales pour les poissons avec une densité adaptée tout au long de l’essai. En effet, nous devons respecter un nombre minimal de poissons pour assurer le bien-être des animaux et éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Compte-tenu de ces éléments, le nombre de poissons par bassin pour l’expérience 1 est de 60. Ce nombre tient compte des prélèvements successifs nécessaires tout au long de l’expérimentation et du risque, possible bien que non attendu ou prévisible, que certains poissons présentant un comportement ou un état jugé anormal soient exclus de l’analyse au cours de l’expérience. Pour l’expérience 2, le nombre de poissons par bassin (n=30/bassin) est inférieur à celui de la première expérimentation car un seul prélèvement sera réalisé. Toutefois, afin de garantir une densité d’élevage optimale et d’éviter tout impact sur le bien-être et les performances des poissons, ce nombre a été évalué au minimum requis.

Raffinement

Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et, pour la situation contrôle, niveau d’oxygène couvrant les besoins physiologiques des truites. La taille et le type de bassins seront adaptées à la taille des poissons. La densité des truites sera optimale et un nettoyage des bassins sera effectué régulièrement lors de chaque pesée toutes les 2 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle deux fois par jour. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Au-delà d’un seuil critique déterminé dans la grille d’évaluation, l’animal sera euthanasié via les procédures réglementaires. Pour les échantillonnages, les poissons seront pêchés dans chaque bassin par du personnel habilité et expérimenté, puis anesthésiés, et mis à mort avant la pesée et le prélèvement des tissus. Lors du stress hypoxique, le comportement des poissons sera étroitement surveillé et des points-limites définis pour éviter toute souffrance grave et stopper le test le cas échéant. Aucun signe de stress grave ne devrait être observé à 5 ppm, considéré comme un stress modéré.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique pour l’étude des mécanismes de réponse au stress cellulaire. Animaux au stade juvénile. Le but est de se placer dans des conditions de croissance optimales mais aussi de pouvoir récupérer différents tissus en quantité suffisante pour les analyses, ce qui justifie cette période et le poids moyen initial de 30 grammes permettant d'atteindre un poids moyen final d'environ 100 grammes au bout de 4 semaines d’élevage.