Oncologie

Des souris sont rendues obèses, diabétiques et atteintes de stéatose du foie par des régimes riches en graisses et en sucre, pour que des chercheurs testent sur elles des candidats médicaments, dans une offre dont l'effectif suit un plan commercial. 990 souris, dont certaines dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisés, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées en fin d'étude, aux points limites ou à la demande du vétérinaire, 30 d'entre elles étant déclarées réutilisables dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Selon les études, elles subissent des tests de résistance à l'insuline et au glucose de 6 h 30 à 8 h 30 avec mise à jeun, des prises de sang répétées et des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires dans les minutes suivantes. Sous des signes "pouvant entraîner un inconfort", le porteur liste des accidents vasculaires cérébraux, des crises cardiaques, une encéphalopathie hépatique et des vomissements de sang. L'effectif couvre 33 études de quatre groupes de 5 à 10 souris, et selon lui "Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d'études ou pour le nombre total d'animaux dans le projet".

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.

Bénéfices attendus

En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun. Durée totale du test entre [MODIFICATION] 6h30 et 8h30. L’administration de traitements ou de cellules pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. [MODIFICATION] Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.

Impact sur les animaux

Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie (besoin excessif de manger), polyurie (trouble urinaire) , polydipsie (sensation de soif exagérée), troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). -Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. [MODIFICATION] Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.

Réduction

Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 a 10 animaux par groupe. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sans réveil sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire et du foie chez des lignées de souris spécifiques. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. [MODIFICATION] Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines correspondant au délai nécessaire pour obtenir une prise de greffe hépatique suffisante dans la majorité des souris.

Toutes biopsiées à l'oreille au poinçon ou aux ciseaux, et 320 d'entre elles gavées une fois par semaine jusqu'à seize fois, 1 536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des modifications génétiques qui leur font développer des tumeurs pulmonaires entre trois et quatre mois, et sont tuées au plus tard à cinq mois pour prélever des tissus, ou parce que le porteur les juge "inutilisables" pour le projet. L'objet est de savoir si les cellules sénescentes freinent ou favorisent le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que ces tumeurs sont indétectables à l'œil comme à la palpation et annonce un simple suivi hebdomadaire, sans dire comment il repérera la souffrance des souris chez lesquelles elles progressent.

Objectifs

Malgré les efforts considérables déployés pour lutter contre le cancer et trouver des traitements efficaces, cette maladie demeure l’une des principales causes de mortalité en France et dans le monde. Un des principaux défis des différentes approches anticancéreuses est leur incapacité à éliminer toutes les cellules tumorales. En effet, une petite proportion de ces cellules parvient à survivre aux traitements puis redonne naissance à des tumeurs. La nature de ces cellules cancéreuses résistantes reste largement méconnue et sujette à débat, néanmoins, il pourrait s'agir de cellules sénescentes (CS). La sénescence est un processus qui se déclenche lorsqu’une cellule est soumise à un stress susceptible de la rendre cancéreuse, entrainant un blocage définitif de sa capacité à se multiplier, et donc a créer des tumeurs. Néanmoins, certaines études suggèrent que les CS sont non seulement sont très résistantes aux traitements anticancéreux, mais pourraient contourner leur blocage et redevenir capable de se multiplier. Pire encore : ces traitements pourraient paradoxalement induire la sénescence par le stress qu’ils engendrent, et donc permettre a des cellules précancéreuses de survivre. Nous supposons donc que la sénescence n’est pas nécessairement une barrière définitive et qu’elle pourrait être contournée, permettant ainsi à des cellules potentiellement tumorales de survivre aux traitements et de compléter ultérieurement leur transformation en cellules cancéreuses, expliquant ainsi le retour du cancer chez les patients traités. Le but de ce projet est de comprendre comment les cellules pulmonaires sénescentes influencent le développement du cancer en utilisant un modèle murin développant des tumeurs pulmonaires associé à des systèmes génétiques et pharmacologiques permettant de marquer et d'éliminer les cellules sénescentes.

Bénéfices attendus

En déterminant la contribution des cellules sénescentes dans le développement tumoral, nous espérons pouvoir déterminer si elles inhibent ou au contraire promeuvent celui-ci. Dans ce dernier cas, nous aurons découvert une nouvelle cible pharmacologique dans la lutte contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Biopsie : La totalité des 1536 souris seront biospiées, par prélèvement d'un petit bout de tissu par punch ou avec des ciseaux (3 mm). Fait une seule fois dans la vie de l'animal pour une durée inférieur a 1 minute. Gavage : 320 souris seront gavées une fois par semaine à partir de l’âge d’un mois et jusqu’à leur mise à mort a l'age de 2 mois (4 gavages), 3 mois ( 8 gavages), 4 mois (12 gavages) et 5 mois (16 gavages). 80 souris seront traitées pour chaque âge. La procédure de gavage prend moins de 15 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle murin utilisé dans ce projet développe des tumeurs pulmonaires entre 3 et 4 mois au point d'impacter leurs bien-être à partir de 6 et de causer la mort a près de 7 mois. Néanmoins, ces souris seront mises à mort à 5 mois maximum, soit avant que des problèmes sanitaires n'apparaissent. Il est néanmoins possible que certaines d'entre elles développent des difficultés respiratoire mineures. De même, il existe une faible probabilité de voir apparaître des prolapsus rectal et des papillomes sur le corps de la souris. Les souris seront également maintenues en contention puis biospiées : elles devraient donc subir un stress et une douleur légère pour un court laps de temps. En ce qui concerne le gavage, les souris ne devraient alors ressentir qu'un léger et fugitif inconfort, peu de stress et aucune douleur.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure pour les raisons suivantes : soit les souris seront susceptibles de développer des tumeurs pulmonaires et doivent dont être mises à mort avant que cela ne se produise ; soit les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus aux temps impartie ; soit les souris seront inutilisables pour ce projet (mauvaise combinaison de gènes ou souris trop âgée).

Remplacement

L'étude de la senescence est un processus intégré impliquant une communication intra- et inter-cellulaire et tissulaire. Il est ainsi impossible de mimer in vitro ou in silico le développement tumoral au sein des poumons et son interaction avec des cellules sénescentes. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.

Réduction

Nous n’avons pas trouvé de système in vitro permettant de faire des analyses préliminaires susceptibles de diminuer le nombre de souris à utiliser. Des efforts seront faits pour limiter le nombre de souris nécessaires par groupe, par exemple en utilisant les règles statistiques adéquates et des logiciel dédiés. En se basant sur la littérature déjà existante et en prenant en compte les exigences de réduction, nous constituerons des groupes expérimentaux composés de 20 animaux. Pour cette étude, nous aurons besoin de souris sur 4 à 5 ans. Les effectifs ont été choisis en prenant en compte 2 paramètres : -(1)Le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats significatifs. –(2)Le taux de mortalité/échec associé au travail sur animaux et a la part d’incertitude, notre modèle murin cancéreux développant un phénotype dommageable.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par: 1) Un enrichissement permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, abris dans la cage...). 2) Un suivi sanitaire hebdomadaire par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnels techniques). Ce suivi permettra d’indiquer si la souris a atteint des points limite préalablement définis et imposera la prise de mesures adéquats. La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal. Le suivi permettra notamment d'identifier un développement tumoral non pulmonaire visible qui peut rarement se produire dans notre modèle murin. En ce qui concerne les tumeurs pulmonaires, il sera impossible de les détecter visuellement ou par palpation. Cependant, elles se traduisent par un affaiblissement de l'animal associé à un essoufflement marqué de la souris. De plus, le développement de cancers pulmonaires entre 3 et 4 mois n'aura qu'un impact mineur sur le bien-être des souris car nous les mettrons à mort à 5 mois maximum (le bien-être étant impacté à partir de 6 mois et la mort survenant à 7 mois)». Pour le gavage, nous utiliserons une sonde à bout rond et de longueur appropriée afin de limiter les risques d'irritation voire de blessures. Plusieurs mesures correctives seront faites suivant les problèmes sanitaires rencontrés : désinfection en cas de plaie, nourriture gélifiée+mesure du poids si la souris parait amaigrie, antalgique en cas de signe de souffrance de la souris, et enfin consultation du vétérinaire en cas de doute sur la conduite à tenir.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude exploratoire et innovante basée sur les modèles murins transgéniques qui ont déjà été utilisés dans le cadre d'études portant sur la sénescence. À notre connaissance, il n'existe pas d'autres organismes modèles transgéniques comparables et utilisables pour étudier la sénescence, tant au niveau de leur disponibilité, de la vitesse de leur vieillissement et de leur capacité a générer rapidement les animaux expérimentaux nécessaires. Nous aurons besoin d'animaux adultes à l'âge adulte, tant pour générer les animaux expérimentaux que pour mener nos expériences. En effet, nous suivrons le développement tumoral, lequel n'apparaît que chez les souris adultes. Pour des raisons scientifiques (d'étude de la croissance tumorale) et éthiques ,toutes les souris expérimentales seront mises à mort entre 2 et 5 mois.

1 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 80 recevront trois injections dans le ventre par semaine pendant six à huit mois. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes. 970 subissent un prélèvement de peau à l'oreille et 570 une injection sous la peau, le porteur attendant douleur, perte de poids et mobilité réduite à mesure que les cancers cutanés se développent. Les retombées annoncées, de nouveaux marqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle d'une protéine dans la pigmentation de la peau.

Objectifs

Des données de plus en plus nombreuses indiquent que des protéines impliquées dans la croissance des cellules ont un rôle clé dans le fonctionnement de la cellule. Dans ce contexte, le but de notre projet est d’étudier les rôles d’une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau qui sont responsables de la pigmentation. Ces cellules sont également responsables du développement de certains cancers, et un second objectif de notre projet sera d’étudier le rôle de cette protéine dans le développement de ces cancers de la peau. Pour atteindre notre objectif, nous utiliserons différents modèles de souris génétiquement modifiées nous permettant d'inactiver notre protéine d’intérêt spécifiquement dans les mélanocytes et d'évaluer les conséquences sur la croissance de ces cellules et sur leur capacité à pigmenter.

Bénéfices attendus

A court terme, notre projet vise à comprendre le rôle d'une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau et le développement des cancers de la peau. Nos travaux permettraient ainsi de comprendre comment se forment ces cancers et identifier de nouveaux marqueurs prédictifs voir même de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ces cancers. De plus, il existe de nombreuses pathologies cutanées associées à des défauts de pigmentation de la peau, et à long terme nos travaux pourraient également avoir des retombées sur la compréhension de ces maladies dermatologiques.

Procédures

Sur les 1450 souris du projet : - 970 auront un prélèvement de peau à l’oreille (1 minute) - 80 recevront uniquement 3 injections dans le ventre (2 minutes par injection) – 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 2 semaines (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 1 mois (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 6 à 8 mois (2 minutes par injection) - 570 recevront une injection sous la peau (3 minutes par injection) dont 240 recevront en plus 3 injections dans le ventre par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur les animaux de notre projet sont notamment des effets associés au prélèvement à l’oreille, aux injections dans le ventre, à la manipulation des animaux et au développement des cancers de la peau, à savoir de la douleur, une perte de poids, une mobilité réduite et du stress. Nous n’attendons pas d’effet secondaire des différents traitements proposés sur la base de travaux déjà publiés dans la littérature.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes pour la réalisation d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vivo s’appuie sur nos résultats expérimentaux obtenus à partir de lignées cellulaires en culture. En effet, nous montrons dans ces modèles que la perte de notre protéine conduit à une forte diminution des facteurs qui régulent la pigmentation. Certains de ces acteurs étant également essentiels au développement des cancers de la peau, nous émettons l’hypothèse que la perte de notre protéine aura un impact majeur sur la croissance de ces tumeurs. Etant donné que ces travaux ne nous permettent pas d’aborder les différentes questions liées à l’initiation et au développement tumoral, nous souhaitons aborder ces questions dans des modèles intégrés in vivo, et notamment les modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Nous générerons plusieurs groupes expérimentaux contenant 10 animaux chacun et le nombre d'individus par groupe a été déterminé à partir de tests statistiques. Par ailleurs, nous avons intégré une étude préliminaire afin de minimiser notre nombre d'animaux.

Raffinement

Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. La sévérité des signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins éventuels (administration d’anti-douleurs) ou conduira à l’euthanasie des animaux. Enfin, les conditions d’hébergement sur des portoirs adaptés ainsi que le suivi du statut sanitaire des animaux immunodéprimés permettent de les protéger.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour nos études in vivo car c'est la seule espèce dans laquelle nos gènes d'intérêts ont déjà été modifiés, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux à générer pour notre étude. Nous estimons que les conclusions de ces études réalisées chez la souris pourront être étendues à d'autres mammifères, dont l'homme. Des similarités sont observées entre nos lignées de souris génétiquement modifiées et les patients atteints de cancer de la peau ce qui nous laisse penser que ce modèle animal est un excellent modèle d'étude de la pathologie humaine et qu'il permettra, à terme, d'établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ce cancer de la peau. Selon les expériences, certaines souris seront utilisées à 18 jours, correspondant à la première pousse du poil adulte chez la souris et d'autres à 6 semaines.

Deux injections dans le sinus situé derrière l'œil, dix prises de sang à la queue et une ponction cardiaque finale attendent chacune des 144 souris du projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et résistantes à l'insuline, elles reçoivent un virus qui modifie une enzyme du foie, pour faire monter leur cholestérol et favoriser des dépôts dans les artères. Le porteur affirme que ce changement reste "sans signes visibles ni douleur pour l'animal", tout en rangeant les injections rétro-orbitales et les prises de sang bimensuelles parmi les effets indésirables attendus. La mise à mort sert à prélever le foie et le tissu adipeux.

Objectifs

Nous allons étudier l'impact d'une modification d'une enzyme du foie sur des souris obèses et résistantes à l'insuline. Pour cela, nous utiliserons une version particulière de cette enzyme et rendrons les souris plus sensibles aux déséquilibres des graisses dans le sang en modifiant une autre protéine. Nous analyserons ensuite la quantité de graisses présentes dans le sang et vérifierons si ces changements favorisent la formation de plaques dans les artères, un facteur clé des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Nos recherches ont montré qu’une forme particulière de la lipase hépatique, plus active que la normale, permet de faire baisser le taux de cholestérol dans le sang, chez la souris comme chez l’homme. Or, le cholestérol LDL (souvent appelé "mauvais cholestérol") est l’un des principaux facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. En s’accumulant dans les artères, il peut former des dépôts qui les rétrécissent et gênent la circulation du sang. Ce projet cherche à savoir si cette forme modifiée de la lipase hépatique peut protéger des souris obèses, avec un taux de sucre élevé dans le sang et une sensibilité réduite à l’insuline, contre ce type de problèmes dans les artères.

Procédures

Chaque souris recevra deux injections d’un virus (durée de 5/10 secondes), subira dix prises de sang (durée 5/15 secondes) et une ponction cardiaque avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris auront un taux de cholestérol élevé et seront plus susceptibles de développer des dépôts de graisses dans les artères. Cependant, ce changement reste sans signes visibles ni douleur pour l’animal. Contrairement à l’humain, les souris ne développent pas de maladies graves comme les crises cardiaques ou les accidents vasculaires cérébraux : les plaques qui se forment dans leurs artères restent stables. Les effets indésirables possibles concernent surtout les deux injections dans le sinus rétro-orbital et les prises de sang régulières réalisées au niveau de la queue toutes les deux semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, conformément aux objectifs expérimentaux. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre le recueil des organes et tissus d’intérêt (par exemple le foie, le tissu adipeux ou d’autres prélèvements), indispensables aux analyses biologiques et histologiques prévues dans le protocole.

Remplacement

Ce projet comprend plusieurs volets : des analyses génétiques menées sur une cohorte humaine et des études en laboratoire sur des cellules hépatiques. Les données déjà obtenus ont confirmé l’intérêt de la cible étudiée. Les maladies cardio-métaboliques résultent de mécanismes complexes impliquant plusieurs organes qui communiquent entre eux. Actuellement, ces interactions ne peuvent pas être reproduites en laboratoire avec des modèles cellulaires. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux reste essentielle.

Réduction

Ce projet a été conçu dans le respect de la règle des "3R" (Remplacement, Réduction, Raffinement). Seules les expériences strictement nécessaires à la réussite du projet seront réalisées.Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé avec rigueur, en s’appuyant à la fois sur notre expérience passée et sur un logiciel d’analyse statistique permettant d’optimiser la taille des échantillons. De plus, nous avons sélectionné les lignées de souris les plus adaptées afin de maximiser la pertinence des résultats tout en limitant le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal en mettant en place une surveillance quotidienne assurée par des zootechniciens formés, afin de détecter tout signe de stress ou de souffrance. De plus, un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Pour limiter la douleur et le stress des animaux, des mesures adaptées seront mises en place. Les injections dans le sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec l’application d’un collyre anesthésiant pour une analgésie locale. Une analgésie appropriée sera également administrée avant la mise à mort. Par ailleurs, une sédation légère sera utilisée lors des prises de sang au niveau de la queue pour réduire le stress des animaux . Des critères précis ont été établis pour définir des seuils au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, garantissant ainsi une prise en charge éthique et responsable. Enfin, les souris seront hébergées dans des conditions optimales : elles disposeront de cages équipées de litières et d’enrichissements (frisottis, igloo ou tube en polycarbonate). Elles seront également restreintes en nombre dans chaque cage en fonction de leur poids, afin d’assurer leur confort. Les animaux seront maintenus en groupes pour préserver leur bien-être social.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, il offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d'obtenir des données fiables. Nous avons choisi des souris qui sont naturellement obèses et moins sensibles à l’insuline. Pour les rendre plus à risque de développer des plaques dans les artères (athérosclérose), nous modifions une protéine, ce qui augmente leur taux de cholestérol. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 5 semaines d’âge (randomisation) car il est nécessaire de débuter avant la mise en place de l’insulino-résistance qui s’établit entre 6 et 12 semaines.

Quatre loups vont être capturés au piège à patte ou par fléchette anesthésique, chacun immobilisé environ 45 minutes, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Pendant ce laps de temps, l'animal est pesé, mesuré, prélevé de sang et d'ADN, perforé aux deux oreilles pour y fixer une étiquette et équipé d'un collier GPS. Le porteur énumère les risques de la capture, du stress aux blessures superficielles jusqu'aux luxations, fractures des os longs et myopathie de capture, et rappelle que l'anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire. Les quatre loups sont relâchés immédiatement après la manipulation puis suivis douze à vingt-quatre mois, le temps de la batterie du collier.

Objectifs

Un certain nombre d’études ont été menées à travers le monde sur le loup et son rôle sur les populations proies et les écosystèmes. En effet, en tant que prédateur, le loup a un impact potentiellement important sur les populations de proies, en particulier les ongulés sauvages, en termes de densité et de comportement en modifiant la distribution, la sélection des habitats, le régime alimentaire et la démographie des grands herbivores sauvages, avec des effets sur les écosystèmes associés. Ces effets sont toutefois très peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, tel qu’on peut en trouver en France et en Europe. Or, en tant que super-prédateur, l’humain et ses activités impactent l’ensemble des interactions entre les espèces et leur environnement. Alors que le loup recolonise rapidement le territoire européen et français, il devient nécessaire de mieux évaluer son comportement dans des écosystèmes dominés par les activités humaines et les effets de son expansion sur ceux-ci, en particulier sur des territoires à protection forte. Ce projet vise à combler ces lacunes en étudiant le comportement et l’utilisation de l’espace d’une meute de loups vis-à-vis des activités humaines et de ses interactions avec les autres espèces sauvages, et ainsi nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Du fait des nombreux suivis qu’elle réalise sur la faune sauvage, la flore et les habitats naturels depuis de nombreuses années, et de son rôle majeur dans la conservation de la biodiversité, une Réserve naturelle nationale abritant depuis peu une meute de loup, représente un site d’étude idéal pour étudier ces questionnements. Les objectifs d’une telle étude sont : Étudier le comportement d’une meute de loup sur leur territoire en fonction de la saisonnalité et des activités humaines; Définir le régime alimentaire des loups dans un contexte d’abondance forte de cervidés sauvages et une dominance de l’élevage bovin ; Évaluer les impacts sur la densité, la distribution et le comportement des ongulés sauvages, notamment du Cerf élaphe, et les effets indirects à plus ou moins long terme sur les écosystèmes forestiers utilisés par ces derniers. L'intérêt global est l'acquisition de données comportementales sur le loup en tant que nouvel acteur dans un écosystème à protection forte afin de pouvoir assurer sa conservation ainsi qu'une coexistence optimale de cette espèce avec les différentes activités humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de concrétiser des études et suivis de loups dans un territoire multi-usages et multi-acteurs, typique des paysages montagnards confrontés au retour de ce grand prédateur ces dernières décennies en France et en Europe. Via l’acquisition de données par GPS sur cette espèce très discrète, sur un site d’étude protégé et très suivi (faune, flore et habitats) par ailleurs sur le long terme, ce projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur le comportement des loups, le fonctionnement d’une meute dans un contexte local à usages multiples et leurs rôles dans les socio-écosystèmes de montagne. Des connaissances importantes seront également acquises sur les impacts directs et indirects des loups sur la faune sauvage à l’instar des ongulés sauvages, mais aussi sur d’autres espèces à enjeu telles le Grand tétras, la Gélinotte des bois et le Lynx, ainsi que sur les écosystèmes associés (notamment forestiers). Bénéficiant de paysages contrastés, le projet permettra également d’acquérir des connaissances sur les potentiels points de contacts entre loups et humains et sur les déplacements de loup dans un paysage dynamique en termes de dérangements anthropiques en fonction des secteurs et de la saisonnalité. À plus long terme, le projet permettra de mettre en évidence les effets indirects du loup sur les écosystèmes forestiers et le rôle bénéfique qu’il pourrait jouer via la réduction des impacts des herbivores sur les forêts exploitées. Les connaissances acquises serviront à une conciliation des usages entre les activités d’exploitation forestières et de chasse tout en assurant le maintien de la biodiversité sur les milieux forestiers. Enfin, le suivi des loups et l’étude de leurs interactions avec les activités humaines et la faune sauvage, nous permettra d’avoir une meilleure compréhension de l’espèce et de son rôle dans les écosystèmes. En local, afin de maintenir l’intégrité des loups équipés et le bon fonctionnement de la meute suivie, la Réserve naturelle coordonnant ce projet a proposé en parallèle, pour les zones en dehors de son territoire (le tir létal dans la Réserve naturelle étant interdit), des alternatives aux tirs létaux de défense (ex. surveillance troupeau par agent de la réserve ou bénévole, aide berger, tir d’effarouchement, etc), ce qui assurerait la protection des individus concernés.

Procédures

Les loups seront capturés avec des pièges à patte ou par téléanesthésie (flèche anesthésique projetée par un fusil alimenté au CO2). Ils seront manipulés sous anesthésie générale. Sur une bâche de manipulation, ils seront équipés d’un collier GPS puis un ensemble de mesures corporelles (poids, mensuration), une prise de sang (analyses sanguines) et un frotti buccal (prélèvement ADN) seront effectués avant que l’animal soit relâché. Un marquage auriculaire sera également réalisé par perforation sur chaque oreille à l’aide d’une pince et d’une étiquette en plastique spécifique et adaptée. L’ensemble des manipulations est réalisé en 45 minutes environ (de l’anesthésie générale au relâcher). Après leur relâcher, les déplacements des animaux seront suivis pendant 12 à 24 mois (durée de batterie du collier). Une fois le suivi terminé le collier sera décroché automatiquement ou à distance.

Impact sur les animaux

La capture peut occasionner du stress, des troubles locomoteurs légers en réponse à un stress musculaire, des changements hiérarchiques au sein de la meute, des blessures superficielles en cas de traction sur le piège ou de morsure du câble, des blessures sévères (rares : boiterie du membre entravé, luxation des articulations, fractures des os longs), une myopathie de capture, un risque de mortalité (très faible: aucun cas de mortalité n’a été rapporté avec ce protocole par les partenaires internationaux du projet). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont : hypoventilation, hypotension, anomalies du rythme cardiaque, perturbations de la température corporelle, troubles neurologiques, nausées, vomissements, déficit de la circulation sanguine, ulcères de la cornée de l’œil, arrêt cardio-respiratoire dans de très rares cas. Des protocoles seront mis en place tout au long de l’anesthésie pour prévenir ou contrecarrer ces effets.

Devenir

Tous les animaux sont relâchés dans le milieu naturel immédiatement après leur manipulation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative satisfaisante aujourd’hui au suivi des grands prédateurs en milieu naturel, constat établi récemment par le conseil scientifique du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage. En effet, les études écologiques et comportementales impliquant le suivi de ces espèces sont essentielles pour comprendre leurs interactions avec les activités humaines, la faune sauvage ainsi que les effets en cascade sur la végétation forestière notamment. Cet état des connaissances est d'autant plus important dans un contexte montagnard qui est sensible au retour du loup de par sa fragilité intrinsèque, mais aussi par la présence de multiples activités humaines, dont le pastoralisme. Cependant, les données apportées par ce type de suivi permettront d’ouvrir la voie à la modélisation informatique de l’utilisation de l’espace par les loups et de leurs interférences avec la faune sauvage et les activités humaines, ce qui pourrait autoriser à l’avenir un remplacement des suivis en nature pour répondre à certaines questions scientifiques et/ou de gestion (par exemple caractérisation des facteurs orientant la prédation sur des animaux domestiques).

Réduction

Pour obtenir des données généralisables à d’autres contextes, en prenant en compte les différences intrinsèques liés à l’individu, son rôle social au sein de la meute, les variations de cultures de meute, etc, il faut compiler des données sur un certain nombre d’animaux. Dans un premier temps, nous avons pour ambition de commencer par la capture de 4 loups, qui permettront de construire la capacité et les connaissances de terrain sur les captures, et commenceront à produire des données exploitables (dès la première capture). Capturer plusieurs individus d’une même meute est envisagé afin d’obtenir des informations sur la dispersion d’individus isolés d’une part, et pour assurer une redondance en cas de tir/collision avec un véhicule ou autre mortalité d’un individu suivi d’autre part. Ce suivi de plusieurs loups par collier GPS en milieu de moyenne montagne bénéficiera à de nombreux partenaires scientifiques en France et en Europe. En effet, les données sur l’écologie spatiale du loup seront mises à disposition dans le cadre d’un réseau scientifique européen sur les mouvements des mammifères et, plus globalement, dans une dynamique mondiale de partage de ce type de données. Les données collectées lors de notre projet, uniques en France, seront combinées à celles d'autres projets européens (dans des contextes socio-écologiques différents) impliquant des captures de loups et s'intéressant à des questions similaires. Une collaboration nationale et internationale est déjà établie dans ce sens avec les équipes partenaires travaillant sur ce sujet en France et en Europe.

Raffinement

1/ Piégeage : *Choix des sites et moments de capture priorisant la sécurité des animaux (pas de capture en été et dans conditions météo non favorables) *Ajout de ressorts et d'articulations (pivots) à la longe afin de garantir un bon niveau d'absorption pour limiter les risques de blessures *Ajout de bourrelets en tissus sur le lacet coulant pour assurer la circulation sanguine dans la patte *Alerte de déclenchement pour une intervention rapide (

Choix des espèces

Dans des territoires sauvages, il a été montré que le loup peut substantiellement modifier la densité, la distribution et le comportement des grands herbivores sauvages (ses proies privilégiées) avec des conséquences en cascade sur les écosystèmes associés. Le comportement du loup, ses interactions avec les autres espèces et son impact sur les écosystèmes sont toutefois peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, qui peuvent impacter l’ensemble des interactions entre les espèces. Ainsi, les connaissances sur l'écologie du loup demeurent encore insuffisantes pour appréhender et prédire ses effets sur un territoire. Ce projet vise donc à combler ces lacunes et à nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Pour répondre à cette problématique le recours au suivi de loups équipés de collier GPS est l’option la plus pertinente (cf. rapport du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage). Les équipements seront déployés uniquement sur des individus subadultes et adultes d’au moins 23 kilogrammes, qui sont jugés comme suffisamment développés pour pouvoir supporter un équipement par collier GPS, d’après les retours d’expérience des projets européens portant sur le loup. Les périodes ciblées de capture permettront d’éviter de capturer des femelles dans le dernier tiers de gestation ou des jeunes.