Système endocrinien

Des souris sont isolées de leurs congénères 96 heures pour mesurer leur dépense énergétique, d'autres placées au froid seules jusqu'à cinq heures ou ensemble pendant sept jours. 3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récolter des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de caractériser deux mutants d'une protéine du tissu adipeux brun créés par Crispr-Cas9, chez des souris soumises à des régimes obésogènes et à plusieurs températures d'hébergement, avec des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline de 150 minutes. Le porteur écrit que les mesures de dépense énergétique "nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux" et que les mises au froid provoquent "sûrement le plus grand stress", tout en indiquant que les classes de gravité employées "ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d'animaux".

Objectifs

CCe projet a pour objectif de caractériser les effets potentiels de mutants d’une protéine dans la physiologie et la pathologie, notamment dans la prévention du diabète associé l’obésité, autrement appelé Diabésité. Cette protéine est la protéine majoritairement présente dans le tissu adipeux brun des rongeurs, tissu véritable régulateur du métabolisme énergétique, notamment grâce à la présence en abondance de mitochondries. Cette protéine est localisée dans la membrane interne de ces organites, véritable usine énergétique des cellules. Elle est également retrouvée dans des dépôts adipeux humains sous certaines conditions et notamment chez des volontaires sains plongés dans des eaux froides de manières aigue ou chronique (à 17°C durant 2h ou pendant 6 semaines par exemple). Elle intervient donc dans la chaîne de production de l’énergie. Récemment, des études ont mis en évidence l’importance de mutants de cette protéine, grâce à un modèle de sphéroplastes de levure. Ces premiers résultats in vitro ont permis de sélectionner des mutants de cette protéine qui seront créés par la technologie Crispr-Cas9 (plus communément connue sous le terme de ciseaux moléculaires) puis analysés dans des modèles cellulaires puis murins transgéniques. Ces analyses comprendront divers tests de tolérance à différentes molécules, des mesures de composition corporelle et de dépense énergétique, sur des animaux hébergés à plusieurs températures et dans des conditions nutritionnelles standard ou obésogènes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle in vivo d’une protéine thermogénique majeure du tissu adipeux brun dans la régulation du métabolisme énergétique à travers l’analyse de mutants. Ces modèles murins trangéniques pourraient également servir à cribler des molécules d’intérêt dans le traitement de la « Diabésité » chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux, quelles que soient les procédures réalisées dans l’EU-0549 subiront : 1. des tests in vivo d’une durée de 150 min chacun avec administration de glucose ou d’insuline par voie orale ou par voie intrapéritonéale; 2. des mesures de composition corporelle en début, moitié et fin de protocole, soit 3 x 2 min par animal. Des animaux seront isolés de leurs congénères pour mesure de leur dépense énergétique à trois températures différentes durant une période de 96h. D’autres animaux seront mis au froid isolés pendant une durée maximale de 5h (test aigu) ou gardés ensemble pendant 7 jours (test chronique). Enfin, il est possible que des animaux soient traités de manière aigue ou chronique, selon la nature de la molécule administrée, les traitements sont généralement réalisés de manière quotidienne. Si une chirurgie devait être pratiquée, elle serait unique et durerait environ 1h par animal, de l’administration d’un antalgique en pré-opératoire au réveil. Les tests de sensibilité à l'insuline et de transport du glucose réalisés le jour des nécropsies et nécessitant l'utilisation de molécules radiomarquées seront menés dans l'EU2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées aux expérimentations incluent : les effets liés au régime alimentaire enrichis en lipides, entraînant un risque d’inconfort de l’animal avec une prise de poids qui ne limitera cependant pas sa mobilité ; les prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale lors des tests in vivo provoquent un stress modéré chez les souris; les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant environ 2 minutes seulement ; les gavages peuvent également induire un inconfort voire un léger stress ; les mesures de dépense énergétique nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux ; les mises au froid lors des tests de tolérance ou lors des mesures de calorimétrie indirecte génère sûrement le plus grand stress, le réveil post-chirurgie peut s’avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés, enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre peut entraîner de l’inconfort même si la distance est restreinte et sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt.

Remplacement

Les approches de remplacement ont été soigneusement considérées dans le cadre de ce projet. Les résultats in silico de modélisation de nombreux mutants de notre protéine d’intérêt ont donné lieu à une parution abondante en 2023. Certains de ces mutants ont été testés in vitro dans des sphéroplastes de levure ou après reconstitution de liposomes. Nous allons ainsi nous focaliser sur deux d’entre eux. Comme ces modèles restent insuffisants pour analyser l’importance des mutants de notre protéine d’intérêt dans un contexte physiologique ou pathologique nous allons créer des animaux génétiquement modifiés par la technique « des ciseaux moléculaires » et déclencher par une mise en régime enrichi en lipides et/ou par un hébergement à thermoneutralité des conditions pathologiques.

Réduction

Le principe de réduction a été appliqué dans ce projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des résultats. Le nombre d’animaux par groupe a été basé sur des données existantes de la littérature et des études menées par l’équipe sur d’autres sujets. Une taille de groupe de 32 animaux (16 mâles et 16 femelles répartis dans les deux génotypes d’intérêt) a été retenue pour garantir une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires. Des approches complémentaires ont été mises en œuvre pour réduire encore davantage le recours aux animaux. Par exemple, des analyses bio-informatiques ont été utilisées en amont pour rationnaliser le choix des mutants et orienter les expérimentations in vivo. En cas d’effets imprévus ou de résultats statistiquement concluants obtenus avec un sous-groupe, les expériences seront immédiatement réévaluées pour affiner le nombre d’animaux encore à utiliser.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront regroupés au moment du sevrage de manière à éviter d’avoir un animal isolé durant la durée de la procédure. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements, dont le choix est fait en accord avec la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) des sites (feuille d’essuie-mains, coton, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest, igloo). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet ; ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les injections ou gavages seront réalisées par des personnes formées et compétentes. Enfin, le transport inter-sites n’excèdera pas 10 minutes, les deux sites étant distants d’environ 100 m et sera réalisé selon la charte de transport mise en place par les deux établissements utilisateurs et signée par les expérimentateurs. Les animaux seront transportés dans leur cage d’origine dans des sacs exclusivement prévus à cet effet afin de minimiser leur stress durant cette période.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte grâce à l’utilisation de divers régimes alimentaires, températures d’hébergement, âges et sexes. À travers l’utilisation du modèle Souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une ou des modifications pour le/les gène(s) d’intérêt et en analyser les conséquences phénotypiques. Les souris seront étudiées entres les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure. Les souris seront majoritairement étudiées entre les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure.

Toute souris qui montre l'un des signes d'alerte définis est prise en charge puis tuée si son état l'exige. 8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie, cœur et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une inflammation chronique qui ramène leur survie moyenne à six mois environ, avec problèmes cardiaques, gêne respiratoire et pâleur des oreilles et des pattes. D'autres reçoivent pendant quatorze semaines des régimes enrichis en acides gras ou des traitements, avec injections, prélèvements de sept gouttes de sang sur deux heures, prises de température, ou une administration par voie aérienne chaque jour pendant trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en indiquant qu'un groupe de dix suffit à obtenir des résultats fiables et que "tous les animaux nés seront inclus dans les expériences", sans expliquer comment on parvient de là à 8 240.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)

Remplacement

Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.

Réduction

Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.

Choix des espèces

Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.

Douze semaines de régime riche en graisses pour les rendre obèses, douze prélèvements sanguins à la queue sur animal éveillé, sept séances de contention pour mesurer la composition corporelle, deux jeûnes de quatre heures suivis chacun de deux heures de mesures de glycémie. 240 souris sont utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue par prélèvement sanguin sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie chacune de ces atteintes de transitoire, gêne, inconfort, fatigue légère, et juge le rapport entre bénéfices et risques "favorable". Il écrit pourtant que les souris ne sont pas réutilisées car les interventions "ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être".

Objectifs

Le diabète de type 2 et l’obésité sont des maladies fréquentes caractérisées par une mauvaise utilisation du glucose par l’organisme, appelée insulino-résistance. Cette situation est en partie liée à une accumulation anormale de lipides dans certains organes comme le muscle et le foie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines modifications du métabolisme des lipides peuvent influencer la sensibilité à l’insuline et la régulation de la glycémie. Pour cela, le projet vise à étudier l’impact d’une intervention ciblée sur le métabolisme lipidique dans un modèle expérimental d’obésité. L’objectif est de déterminer si cette approche permet d’améliorer la réponse à l’insuline et de limiter les perturbations métaboliques associées à un excès de graisses alimentaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou améliorer les troubles métaboliques liés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Au regard des connaissances actuelles, l’insulino-résistance constitue un enjeu majeur de santé publique, impliqué dans le développement du diabète de type 2 et de ses complications. À l’échelle mondiale, le diabète touche plus de 500 millions de personnes, et sa prévalence est en constante augmentation. Le coût socio-économique du diabète et de ses complications est considérable, représentant plusieurs centaines de milliards d’euros par an à l’échelle mondiale, en raison des dépenses de santé directes et des pertes de productivité. Ce projet vise à mieux comprendre comment des modifications du métabolisme lipidique contribuent à l’altération de la sensibilité à l’insuline et de la régulation de la glycémie dans un contexte d’obésité. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’insulino-résistance, et pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Les contraintes imposées aux animaux sont classées comme modérées et seront encadrées par des mesures de raffinement visant à limiter la douleur, le stress et l’inconfort. Elles apparaissent proportionnées aux objectifs scientifiques poursuivis. Ainsi, les bénéfices attendus en termes de production de connaissances et d’identification de nouvelles pistes pour la prévention ou le traitement des troubles métaboliques justifient le recours à ce modèle animal. Le rapport bénéfices/risques est donc considéré comme favorable.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Administration d’une préparation biologique expérimentale destinée à modifier l’expression d’une protéine impliquée dans le métabolisme lipidique. Cette administration sera réalisée une seule fois, sous anesthésie générale, par voie systémique. La durée de l’administration sera de quelques secondes. Mise en place d’un régime alimentaire spécifique pendant 12 semaines. Une partie des animaux recevra un régime standard, tandis que l’autre recevra un régime riche en graisses afin d’induire une obésité et des altérations métaboliques. Ces régimes seront donnés à volonté, avec un accès libre à l’eau. Mesure de la composition corporelle par une méthode non invasive. Les animaux seront placés brièvement dans un dispositif de contention adapté, sans anesthésie. Cette mesure sera réalisée une fois toutes les deux semaines pendant les 12 semaines de régime, ainsi qu’en fin d’étude, soit au maximum 7 fois par animal. Chaque mesure durera moins de 2 minutes. Prélèvements sanguins de faible volume pour le suivi métabolique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux éveillés, au niveau de la queue, une fois par semaine pendant les 12 semaines de régime, soit 12 fois par animal. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Test de tolérance au glucose. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, après 12 semaines de régime. Il sera précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration orale de glucose et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Test de sensibilité à l’insuline. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, à distance du test de tolérance au glucose. Il sera également précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration d’insuline et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Prélèvement sanguin de fin d’étude. En fin de procédure, un prélèvement sanguin sera réalisé une seule fois, sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal, afin d’analyser certains paramètres biologiques circulants. Euthanasie. À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une sensation de faim transitoire lors des périodes de mise à jeun nécessaires aux tests métaboliques. Le régime riche en graisses entraînera une prise de poids progressive et des modifications du métabolisme pouvant altérer l’état physiologique des animaux. Les injections pourront provoquer une gêne ou un inconfort transitoire lié à la manipulation et à l’acte d’injection. Une irritation locale ou une infection au site d’injection est possible mais rare. Les anesthésies pourront entraîner un stress physiologique transitoire, notamment lors de l’induction et du réveil. Les prélèvements sanguins répétés de faible volume pourront provoquer une douleur légère et transitoire, un stress lié à la manipulation, un hématome, un saignement local ou, plus rarement, une infection au site de prélèvement. Une fatigue transitoire ou une déshydratation légère pourra également survenir en lien avec les mises à jeun et les prélèvements répétés. Les manipulations et la contention nécessaires aux différentes procédures, notamment lors de la mesure de la composition corporelle, pourront induire un stress transitoire.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés. L’euthanasie est nécessaire afin de permettre la réalisation de prélèvements de sang et de tissus, indispensables à l’analyse des paramètres biologiques étudiés. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées chez un animal maintenu en vie et sont essentielles pour comprendre les mécanismes impliqués dans les altérations métaboliques étudiées. Les animaux ne sont pas réutilisés après la procédure, car les interventions réalisées ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être ni leur inclusion dans d’autres protocoles expérimentaux. Ainsi, le recours à l’euthanasie est scientifiquement justifié par la nécessité d’obtenir des données fiables et complètes, tout en garantissant le respect du bien-être animal.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains déséquilibres du métabolisme des graisses peuvent perturber l’utilisation du glucose par l’organisme, un phénomène appelé insulino-résistance, impliqué dans le diabète de type 2. Des études préalables réalisées sur des cellules ont permis d’identifier certains mécanismes impliqués. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire le fonctionnement global de l’organisme, ni les interactions entre les différents organes, ni la régulation hormonale. Or, les paramètres étudiés dans ce projet, comme la capacité à réguler la glycémie ou à répondre à l’insuline, dépendent du fonctionnement coordonné de plusieurs organes et ne peuvent être évalués que chez un organisme entier. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions, ce qui justifie le recours à un modèle animal.

Réduction

Un total de 240 animaux sera utilisé dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour répondre à la question scientifique. La taille des groupes a été établie à l’aide d’un calcul permettant d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Des tests statistiques seront ensuite utilisés afin d’interpréter correctement les résultats obtenus. Les animaux seront répartis en différents groupes expérimentaux incluant les mâles et les femelles, et l’étude sera réalisée sur plusieurs séries indépendantes afin de renforcer la fiabilité des résultats. Plusieurs mesures permettront de limiter le nombre total d’animaux utilisés : les mêmes animaux seront suivis au cours du temps, plusieurs tests non terminaux seront réalisés sur les mêmes individus, et les prélèvements biologiques permettront plusieurs analyses. Lorsque cela sera possible, les échantillons seront conservés pour des analyses complémentaires. L’ensemble de ces dispositions permet de limiter le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Les animaux proviendront d’un fournisseur extérieur agréé et bénéficieront, à leur arrivée à l’animalerie, d’une période d’acclimatation réglementaire minimale de 7 jours avant toute procédure expérimentale. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères, l’hébergement individuel étant limité au maximum, en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le milieu sera enrichi avec au minimum deux enrichissements adaptés, et les animaux seront vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Raffinements spécifiques au projet : une habituation préalable des animaux aux manipulations sera mise en place afin de réduire le stress lors des procédures expérimentales ; la durée de mise à jeun sera limitée au strict minimum, soit 4 heures, avec accès libre à l’eau, afin de réduire l’inconfort ; les manipulations, administrations de substances et prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté, avec une durée de contention limitée ; les animaux bénéficieront de périodes de récupération sans manipulation entre les différents tests ; lors des anesthésies, un gel ophtalmique sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire ; les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant pendant les procédures sous anesthésie afin de préserver leur température corporelle ; une alimentation facilitée, avec des croquettes déposées au sol, sera mise en place après intervention si nécessaire pour favoriser la reprise alimentaire ; une surveillance clinique quotidienne permettra de détecter précocement tout signe d’altération de l’état général ; des critères d’arrêt humanitaires précoces seront définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. Ainsi, la douleur et le stress seront limités par des soins adaptés, une surveillance attentive et des points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier, dans un organisme entier, les perturbations de la régulation du glucose observées dans l’obésité et l’insulino-résistance. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, lorsque leur métabolisme est stabilisé, afin d’éviter les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles, car les réponses métaboliques peuvent différer selon le sexe ; cela permet d’obtenir des résultats plus robustes et plus représentatifs.

Pour mesurer ce que deux versions mutées d'une protéine de la graisse brune changent au métabolisme, 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus. Elles sont soumises à des tests de 150 minutes avec administration de glucose ou d'insuline, à des mesures de composition corporelle en tube de contention, à un régime enrichi en lipides destiné à les rendre obèses, et à des séjours au froid, isolées jusqu'à cinq heures ou en groupe pendant sept jours. Le porteur reconnaît que l'isolement de 96 heures imposé par la mesure de dépense énergétique "va nuire au bien-être des animaux", que les mises au froid génèrent "sûrement le plus grand stress" et que le réveil après chirurgie "peut s'avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés". Face à ces atteintes, le bénéfice annoncé reste au conditionnel : ces souris "pourraient également servir à cribler des molécules d'intérêt" contre le diabète lié à l'obésité chez l'humain.

Objectifs

CCe projet a pour objectif de caractériser les effets potentiels de mutants d’une protéine dans la physiologie et la pathologie, notamment dans la prévention du diabète associé l’obésité, autrement appelé Diabésité. Cette protéine est la protéine majoritairement présente dans le tissu adipeux brun des rongeurs, tissu véritable régulateur du métabolisme énergétique, notamment grâce à la présence en abondance de mitochondries. Cette protéine est localisée dans la membrane interne de ces organites, véritable usine énergétique des cellules. Elle est également retrouvée dans des dépôts adipeux humains sous certaines conditions et notamment chez des volontaires sains plongés dans des eaux froides de manières aigue ou chronique (à 17°C durant 2h ou pendant 6 semaines par exemple). Elle intervient donc dans la chaîne de production de l’énergie. Récemment, des études ont mis en évidence l’importance de mutants de cette protéine, grâce à un modèle de sphéroplastes de levure. Ces premiers résultats in vitro ont permis de sélectionner des mutants de cette protéine qui seront créés par la technologie Crispr-Cas9 (plus communément connue sous le terme de ciseaux moléculaires) puis analysés dans des modèles cellulaires puis murins transgéniques. Ces analyses comprendront divers tests de tolérance à différentes molécules, des mesures de composition corporelle et de dépense énergétique, sur des animaux hébergés à plusieurs températures et dans des conditions nutritionnelles standard ou obésogènes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle in vivo d’une protéine thermogénique majeure du tissu adipeux brun dans la régulation du métabolisme énergétique à travers l’analyse de mutants. Ces modèles murins trangéniques pourraient également servir à cribler des molécules d’intérêt dans le traitement de la « Diabésité » chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux, quelles que soient les procédures réalisées dans l’EU-0549 subiront : 1. des tests in vivo d’une durée de 150 min chacun avec administration de glucose ou d’insuline par voie orale ou par voie intrapéritonéale; 2. des mesures de composition corporelle en début, moitié et fin de protocole, soit 3 x 2 min par animal. Des animaux seront isolés de leurs congénères pour mesure de leur dépense énergétique à trois températures différentes durant une période de 96h. D’autres animaux seront mis au froid isolés pendant une durée maximale de 5h (test aigu) ou gardés ensemble pendant 7 jours (test chronique). Enfin, il est possible que des animaux soient traités de manière aigue ou chronique, selon la nature de la molécule administrée, les traitements sont généralement réalisés de manière quotidienne. Si une chirurgie devait être pratiquée, elle serait unique et durerait environ 1h par animal, de l’administration d’un antalgique en pré-opératoire au réveil. Les tests de sensibilité à l'insuline et de transport du glucose réalisés le jour des nécropsies et nécessitant l'utilisation de molécules radiomarquées seront menés dans l'EU2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées aux expérimentations incluent : les effets liés au régime alimentaire enrichis en lipides, entraînant un risque d’inconfort de l’animal avec une prise de poids qui ne limitera cependant pas sa mobilité ; les prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale lors des tests in vivo provoquent un stress modéré chez les souris; les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant environ 2 minutes seulement ; les gavages peuvent également induire un inconfort voire un léger stress ; les mesures de dépense énergétique nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux ; les mises au froid lors des tests de tolérance ou lors des mesures de calorimétrie indirecte génère sûrement le plus grand stress, le réveil post-chirurgie peut s’avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés, enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre peut entraîner de l’inconfort même si la distance est restreinte et sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt.

Remplacement

Les approches de remplacement ont été soigneusement considérées dans le cadre de ce projet. Les résultats in silico de modélisation de nombreux mutants de notre protéine d’intérêt ont donné lieu à une parution abondante en 2023. Certains de ces mutants ont été testés in vitro dans des sphéroplastes de levure ou après reconstitution de liposomes. Nous allons ainsi nous focaliser sur deux d’entre eux. Comme ces modèles restent insuffisants pour analyser l’importance des mutants de notre protéine d’intérêt dans un contexte physiologique ou pathologique nous allons créer des animaux génétiquement modifiés par la technique « des ciseaux moléculaires » et déclencher par une mise en régime enrichi en lipides et/ou par un hébergement à thermoneutralité des conditions pathologiques.

Réduction

Le principe de réduction a été appliqué dans ce projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des résultats. Le nombre d’animaux par groupe a été basé sur des données existantes de la littérature et des études menées par l’équipe sur d’autres sujets. Une taille de groupe de 32 animaux (16 mâles et 16 femelles répartis dans les deux génotypes d’intérêt) a été retenue pour garantir une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires. Des approches complémentaires ont été mises en œuvre pour réduire encore davantage le recours aux animaux. Par exemple, des analyses bio-informatiques ont été utilisées en amont pour rationnaliser le choix des mutants et orienter les expérimentations in vivo. En cas d’effets imprévus ou de résultats statistiquement concluants obtenus avec un sous-groupe, les expériences seront immédiatement réévaluées pour affiner le nombre d’animaux encore à utiliser.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront regroupés au moment du sevrage de manière à éviter d’avoir un animal isolé durant la durée de la procédure. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements, dont le choix est fait en accord avec la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) des sites (feuille d’essuie-mains, coton, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest, igloo). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet ; ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les injections ou gavages seront réalisées par des personnes formées et compétentes. Enfin, le transport inter-sites n’excèdera pas 10 minutes, les deux sites étant distants d’environ 100 m et sera réalisé selon la charte de transport mise en place par les deux établissements utilisateurs et signée par les expérimentateurs. Les animaux seront transportés dans leur cage d’origine dans des sacs exclusivement prévus à cet effet afin de minimiser leur stress durant cette période.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte grâce à l’utilisation de divers régimes alimentaires, températures d’hébergement, âges et sexes. À travers l’utilisation du modèle Souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une ou des modifications pour le/les gène(s) d’intérêt et en analyser les conséquences phénotypiques. Les souris seront étudiées entres les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure. Les souris seront majoritairement étudiées entre les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure.

Cinq jours de gavage quotidien, puis une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour y provoquer une lésion musculaire : 2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. S'y ajoutent deux tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prélèvements de sang à la queue, un régime enrichi en lipides dont le porteur indique que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines", et des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. L'objectif déclaré est d'établir un lien de cause à effet entre la graisse logée dans le muscle et deux mécanismes, la régulation du glucose et la régénération musculaire, chez des souris tuées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois selon les groupes. Le porteur justifie le recours à Mus musculus en le décrivant comme "le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature", ce qui permettrait "de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats".

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

312 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, deux prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie et des tests métaboliques de deux heures avec cinq prises de sang. Une partie reçoit du chlorure de lithium dans l'eau de boisson, à 600 mg/L pour les jeunes de cinq semaines et 1 200 mg/L pour les adultes de trois mois, avec des effets secondaires attendus sur le poids et le comportement. Pour 32 d'entre eux, les prélèvements sanguins répétés peuvent entraîner une perte de sang incontrôlée, une anémie ou une détresse respiratoire, risques que le porteur énonce lui-même. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement des tissus, dont les îlots pancréatiques destinés à des expériences menées hors des rats.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui représente aujourd’hui un important problème de santé dans le monde. Elle apparaît lorsque le pancréas, un organe qui aide à contrôler le taux de sucre dans le sang grâce à une hormone appelée insuline, ne fonctionne plus correctement. Cette maladie touche des centaines de millions de personnes et peut entraîner de graves conséquences pour la santé, notamment des problèmes au niveau du cœur, des reins ou de la vue. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement permettant de guérir définitivement le diabète de type 2. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment cette maladie se développe afin de trouver de nouvelles solutions pour la traiter. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2, le pancréas est soumis à une inflammation chronique, c’est-à-dire une réaction de défense du corps qui dure trop longtemps et finit par endommager l’organe. Cette inflammation semble être provoquée par une présence excessive de cellules immunitaires, les cellules chargées normalement de défendre l’organisme contre les infections. Cependant, nous ne savons pas encore précisément d’où viennent ces cellules immunitaires. Nous pensons qu’elles pourraient être produites en grande quantité par la moelle osseuse, le tissu situé à l’intérieur des os qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire. Notre laboratoire a déjà montré que, dans le diabète, la moelle osseuse produit davantage de cellules immunitaires favorisant l’inflammation. Nous faisons donc l’hypothèse que réduire cette inflammation dans la moelle osseuse pourrait aussi diminuer l’inflammation du pancréas et ralentir sa dégradation. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’inflammation dans le pancréas et dans la moelle osseuse à l’aide de modèles de la maladie. Il vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques pour voir si elles permettent de limiter cette inflammation et de préserver le bon fonctionnement du pancréas. Cette étude sera réalisée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique peut améliorer l'état inflammatoire dans les deux sexes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes inflammatoires impliqués dans le diabète et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Une partie des animaux de la procédure 1 et 2 seront traités au chloride de lithium (LiCl) dans l’eau de boisson à une dose de 600mg/L (rattons de 5 semaines) et 1200mg/L (rats adultes de 3 mois). Les animaux de la procédure 1 et 2 (312 rats) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mes mesurer leur glycémie chaque semaine. Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, les rats subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute). Une fois, avant le début du traitement, et, une fois, à la fin du traitement, nous prélèverons une petite quantité de moelle osseuse chez les mêmes rats. Cette opération sera effectuée sous anesthésie générale et un anti-douleur sera injecté avant et après la procédure pour limiter au maximum la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer leur état. Certains animaux de la procédure 2 (32 rats) subiront plusieurs prélèvements d'un petit volume sanguin pour isoler leurs cellules immunitaires qui serviront à des analyses en dehors de l’animal. Ce prélèvement est réalisé sous anesthésie et dure quelques minutes. Dans cette procédure, nous prélevons du sang 2 fois au cours de toute la durée de vie de l’animal et chaque prélèvement sera espacé d’une semaine pour leur laisser le temps de se remettre totalement du geste.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 et 2, les nuisances attendues sont les potentiels effets secondaires liés au traitement (perte de poids, comportement modifié…etc.). Nous prévoyons de contrôler chaque semaine le poids, la glycémie et le comportement des animaux. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection aux cours des tests métaboliques, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. Le prélèvement de moelle osseuse peut également générer des douleurs post-opératoires. Nous utiliserons un anti-douleur pour limiter ces effets. Dans la procédure 2, les potentielles nuisances sont liées aux effets secondaires possibles lors du prélèvement de sang. Cela peut entrainer une perte de sang incontrôlée, une anémie ou encore détresse respiratoire. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés tout au long de la procédure. Nous prélèverons un petit volume sanguin et un point de compression sera réalisé jusqu’à l’arrêt du saignement. De plus, les animaux seront surveillés pendant et après la réalisation du geste pour s’assurer de leur bien-être.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque nous souhaitons étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (moelle osseuse, circulation sanguine et pancréas), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. De plus, les animaux utilisés pour les prélèvements sanguins sont les mêmes animaux utilisés pour les prélèvements d’îlots pancréatiques au vu des expériences ex vivo, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux total utilisé. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 10 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (matériel de nidification, abris), dans des conditions contrôlées de température, d’humidité et de cycle lumineux. Un suivi hebdomadaire sera assuré afin d’évaluer leur état général (poids, glycémie, comportement, aspect du pelage, posture, mobilité). Des points limites prédéfinis permettront d’interrompre rapidement une procédure en cas de signe de souffrance excessive. De plus, une anesthésie et/ou une analgésie adaptée sera utilisée chaque fois que nécessaire. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Les rats que nous utilisons dans ce projet développent une maladie proche du diabète de type 2 observé chez l’Homme. Ils permettent d’étudier en même temps le fonctionnement du pancréas, du système immunitaire et du métabolisme, ce qui n’est pas possible avec des cellules cultivées seules. Les animaux utilisés seront de jeunes rats de 5 semaines, pas encore totalement diabétiques ainsi que des adultes de 3 mois ayant déjà bien développé le diabète. Cela nous permettra d’étudier la manière dont évolue la maladie au cours du temps et de déterminer les effets du traitement en effet préventif (avant que le diabète ne s’installe totalement) et curatif (effet du traitement sur la maladie déjà déclarée).

La souris sylvestre est un rongeur nocturne dont la reproduction varie avec la durée du jour, ce qui vaut à cette espèce d'être retenue pour un projet sur la pollution lumineuse. 312 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux groupes sont exposés sept semaines durant à des LED allumées la nuit, avec une prise de sang par semaine sur souris consciente, soit sept prélèvements par individu. Une partie des cerveaux sera prélevée pour des études ultérieures, et le porteur annonce que les corps des souris surnuméraires et de celles n'ayant subi que des prises de sang seront congelés puis mis à disposition des enseignants et des responsables d'animalerie de l'université pour des travaux pratiques d'anatomie comparée.

Objectifs

Chez tous les organismes, dont les mammifères, c’est l’horloge biologique interne qui contrôle les rythmes de nombreuses fonctions (sommeil, reproduction, etc.) selon un cycle d’environ 24 heures. Cette horloge est principalement synchronisée par l’alternance naturelle du jour et de la nuit grâce à la lumière, qui influence notamment la production de mélatonine, une hormone impliquée dans le rythme veille-sommeil. Lorsque l’environnement nocturne est éclairé artificiellement, comme avec l’éclairage public, ce signal naturel peut être perturbé. Cette pollution lumineuse risque alors de dérégler l’horloge biologique et d’avoir des conséquences sur la santé et le fonctionnement de l’organisme. Dans ce contexte, le projet a pour objectif de reproduire une exposition à la pollution lumineuse pendant la nuit (LAN) chez un mammifère nocturne particulièrement sensible à la durée du jour et de la nuit, la souris Sylvestre, en s’appuyant sur des protocoles expérimentaux réalisés en conditions contrôlées. Plus précisément, il vise à explorer les conséquences d’une exposition nocturne à deux types de lumières LED, l’une majoritairement utilisée dans l'éclairage public nocturne, qui stimule fortement les mécanismes contrôlant l’horloge biologique, et l’autre émettant dans une gamme de longueur d’onde plus élevée, qui pourrait être moins perturbatrice. Le projet a pour objectifs d’évaluer l’impact de la LAN sur : 1) les régions du cerveau qui contrôlent la reproduction ; 2) la production d’hormones liées à la reproduction. Les analyses seront réalisées sur des individus mâles et femelles de la génération F0 exposés ou non, ainsi que chez des individus mâles et femelles de la génération F1 afin de voir si les effets peuvent se transmettre à la génération suivante. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension des effets de la pollution lumineuse et permettront d'élaborer des stratégies d’éclairage respectueuses de la biodiversité pour une meilleure gestion environnementale de la pollution lumineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de 4 ordres principaux. 1/ Les résultats obtenus contribueront à mieux informer les décideurs sur les conséquences écologiques de la pollution lumineuse. En effet, les pouvoirs publics pourront s’appuyer sur les données scientifiques précises obtenues à l’issue de ce projet pour établir des recommandations visant à limiter l’exposition aux LED. Ces recommandations pourraient inclure une meilleure régulation de l’usage des LED en fonction de leur spectre lumineux, en privilégiant des spectres moins perturbateurs pour la biodiversité. 2/ Les mécanismes moléculaires et les systèmes neuroendocriniens sous-jacents au fonctionnement de l’horloge circadienne sont communs à une vaste majorité de vertébrés. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet seront donc susceptibles de concerner d'autres taxons et participeront à la compréhension du rôle de la lumière artificielle la nuit dans la contribution au déclin ou à l'extinction des populations d'espèces. 3/ Au-delà des aspects applicatifs et réglementaires, ce projet aura également un impact sociétal en sensibilisant le grand public aux effets des LED sur la biodiversité. 4/ Ce projet contribuera également à élargir nos connaissances sur les effets de la LAN sur la santé humaine, en particulier sur les rythmes circadiens et les régulations neuroendocriniennes. Les données scientifiques issues de ce projet pourront fournir des éléments contribuant au reclassement de la pollution lumineuse nocturne comme un agent physique à effet perturbateur endocrinien.

Procédures

Deux groupes de souris seront exposées à un traitement luminaux nocturne chacun durant 7 semaines. Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements/souris (vigile) au total. Chaque prélèvement dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables attendus sont les suivants : - Une exposition à des traitements lumineux nocturnes peut entrainer des perturbations comportementales et physiologiques, ce qui constitue l’objet de notre étude ; - Une douleur transitoire hebdomadaire suite à l’introduction de l’aiguille lors des prélèvements de sang ; - Un stress aigu de quelques dizaines de secondes n’induisant pas d’effet à long terme peut être généré dû à la manipulation des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort et pour une partie d’entre eux les cerveaux seront prélevés pour des études ultérieures. Nous congelerons des animaux surnuméraires ainsi que ceux n’ayant subit que des prises de sang et les mettrons à disposition des enseignants chercheurs ainsi des responsables d'animalerie de l’Université pour des TP d'anatomie comparée sur cadavres.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou in silico) ne peut être utilisée pour ce projet qui étudie l’effet d’une exposition à la LAN sur les systèmes neuroendocriniens. Il est donc impératif d’utiliser l’animal entier pour en comprendre les effets et étudier les mécanismes altérés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Afin de limiter le nombre de naissances et d'éviter la production d'animaux surnuméraires, une gestion rigoureuse des accouplements sera mise en place en adoptant une stratégie d'accouplements discontinus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux (3 à 5 souris par cage) en présence de plusieurs enrichissements (abris cartonnés avec matériel de nidification et jouets en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. La surveillance des souris sera accrue lors de leur première semaine d'exposition à la lumière artificielle nocturne. Suite à la prise de sang hebdomadaire, l’animal sera placé dans une cage sans congénère pour récupération et jusqu’à l’arrêt complet du saignement (1-2 min). Un petit morceau de cookie lui sera donné en récompense. Il sera ensuite replacé avec ses congénères. Une grille de score d'évaluation du comportement des souris sera mise en place afin d'identifier précocement d'éventuels points limites adaptés. Un arbre décisionnel guidera la décision de retrait des animaux du protocole lorsque les critères prédéfinis seront atteints afin d'interrompre toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos recherches portent sur les effets d’une exposition à la lumière artificielle nocturne sur les systèmes neuroendocriniens contrôlant la fonction de reproduction chez les mammifères nocturnes. La souris Sylvestre est un excellent modèle animal de référence puisqu’elle est photosensible et présente des variations saisonnières de ses fonctions de reproduction, physiologiques et comportementales. Ces caractéristiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux mâles et des femelles adultes qui seront âgés de 6 à 16 semaines au début des expériences.

Jusqu'à neuf gavages sur animal éveillé et huit prélèvements de fèces, chacun précédé de cinq minutes seule dans un pot transparent : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte d'organes et de tissus. Le projet doit vérifier si des mélanges de bactéries intestinales mis au point par un partenaire industriel s'implantent dans l'intestin de la souris et y produisent les métabolites attendus. Le porteur décrit la souris comme un "modèle établi" pour la recherche sur le microbiote intestinal, d'une "pertinence démontrée pour la situation humaine", et retient des adultes de 8 à 12 semaines. Il ne retient comme atteintes que le stress des gavages et des prélèvements de fèces, plus une légère douleur à l'injection de l'anesthésique, pour un projet qu'il classe en souffrance modérée.

Objectifs

Ce projet vise le développement de technologies permettant d’accéder à l’ensemble de la diversité des bactéries intestinales en vue de concevoir un ensemble de souches bactériennes fonctionnelles pour des patients atteints de maladie métabolique et inflammatoire. Il cherche à traiter les déséquilibres des relations entre le microbiote et l’organisme de ces patients. L’objectif du projet est de vérifier l’implantation des bactéries dans le système intestinal de la souris et d’en évaluer la production métabolique

Bénéfices attendus

Les avancées scientifiques ont souligné le rôle des bactéries intestinales dans diverses maladies humaines. L'introduction de grandes quantités de bactéries intestinales non caractérisées chez des individus malades comporte des risques significatifs, soulignant l'urgence de développer des produits davantage définis, contrôlés et fonctionnels. Des mélanges de bactéries, soigneusement étudiés en laboratoire pour ressembler à une flore intestinale saine, pourraient aider à rééquilibrer un intestin perturbé et ouvrir la voie à des traitements efficaces et accessibles contre plusieurs maladies du système digestif. Pour comprendre comment y parvenir, des expériences sont nécessaires pour transposer nos résultats de laboratoire dans un modèle animal plus complexe. Les résultats de ce projet permettront de vérifier si les mélanges bactériens mis au point par le partenaire industriel remplissent leur fonction. A long terme, les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de maladie métabolique ou inflammatoire de l’intestin.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - Gavage (1 à 2 minutes) sur animal vigile, 9 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Prélèvement de fèces (5 minutes) sur animal vigile, 8 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Pesée des animaux (5 minutes), 4 fois au cours de l’expérimentation - Injection (1 minute) sur animal vigile, 1 seule injection pour anesthésier les animaux - Injection (1 minute) sur animal anesthésié, 1 seule injection pour l’analgésique local - Deux prélèvements sanguins (1 à 2 minutes) sur animal anesthésié, 1 seule fois

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour dans le pot transparent). De plus, les animaux subiront un léger stress et une légère douleur lors de l’injection des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte d’organes et de tissus pour des analyses métaboliques.

Remplacement

Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le système intestinal et en évaluer les effets sur les différents organes. Par contre, les données cliniques recueillies dans ce projet serviront à créer des modèles informatiques du système digestif et des microbes qui y vivent (modélisation in silico). Les microbes étudiés sont d’abord analysés en détail en laboratoire, ce qui permet de mieux comprendre comment ils interagissent entre eux et ce qui se passe lorsqu’on les associe différemment. Grâce à ces informations, les expériences sur les animaux peuvent être mieux préparées et le nombre de souris utilisées est ainsi réduit.

Réduction

Le nombre d'animaux requis a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation des résultats. Étant donné que ces expériences testent des effets encore peu documentés, elles comportent un niveau d'incertitude. Pour contrer cela, les calculs s'appuient sur des données publiées, permettant d'estimer les effets attendus. Pour les groupes témoins, le nombre de souris testées lors de ces expériences a été diminué et les données seront regroupées afin d’avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales. Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur de leur cage, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Les animaux seront dans des cages standards à couvercle filtrant par groupe de 3 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des abris en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Des points limites ont été déterminés dans ce projet et seront mis en place si besoin. De plus, avant les prélèvements sanguins en phase terminale, les souris seront placées sous anesthésie profonde. Des points limites adaptés sont définis et seront appliqués en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgés de 8 à 12 semaines. En effet, l’utilisation de souris à l’âge adulte garantit qu’elles ont dépassé les phases critiques du développement et que leurs systèmes immunitaire et hormonal sont relativement stables et matures, ce qui constitue une condition préalable à l’étude des différences liées au traitement.

Rendues obèses par un régime riche en graisses maintenu jusqu'à vingt-deux semaines, des souris reçoivent ensuite une implantation de tumeur mammaire, puis jusqu'à trente administrations de molécules en trente jours. 1 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec quinze prélèvements sanguins répartis sur deux journées. Le porteur écrit que "seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet", après avoir compté cette même température parmi les sources de stress et d'altération de la thermorégulation des souris. Les tumeurs, la rate et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, ainsi que le tissu adipeux, l'intestin et le foie, destinés à d'autres projets.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l’alimentation et la perte de poids influencent le système immunitaire dans un contexte d’obésité. Des souris rendues obèses par un régime riche en graisses seront utilisées pour comparer deux approches : une amélioration de l’alimentation (vitamines et prébiotiques) et une perte de poids par retour à un régime normal. Leur impact sera évalué sur le développement d’un cancer du sein et sur la réponse immunitaire. Le microbiote intestinal des animaux sous différents régimes sera également analysé, afin de mieux comprendre les interrelations possibles entre la flore intestinale, l’alimentation et l’immunité. Certaines molécules seront également testées pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. L’objectif est de déterminer si ces approches peuvent améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale chez des individus en situation d’obésité. Si ces résultats sont confirmés, ils pourraient contribuer à développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et thérapeutiques pour améliorer la réponse immunitaire et la prise en charge des cancers chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des interactions entre alimentation, obésité, système immunitaire et développement du cancer du sein. Cette première étude permettra d’explorer les mécanismes immunitaires et métaboliques impliqués, notamment au sein du micro-environnement tumoral, et d’identifier des cibles potentielles grâce à des analyses globales et quantitatives. Elle vise également à évaluer l’intérêt d’approches nutritionnelles, seules ou en combinaison avec des immunothérapies, pour améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale. Cette étude constitue une preuve de concept qui pourrait ouvrir la voie à des études précliniques et cliniques chez des patients en situation d’obésité, afin d’évaluer l’efficacité de stratégies nutritionnelles innovantes, notamment via l’alimentation et le microbiote, dans la prévention et la prise en charge du cancer du sein.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en thermoneutralité à 30 degrés (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Des animaux pouront être sous régime alimentaire obésogène (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Une partie changera ensuite en passant avec une alimentation contrôle ou sous régime avec supplémentation (animal vigile, 14 semaines maximum en continu). Des challenges métaboliques seront effectués : un test de tolérance au glucose (animal vigile, 1 fois, 2 heures) et un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 1 fois, 2 heures). Ces tests nécessiteront une administration (animal vigile, 4 fois, 1 minute) et des prélèvements sanguins répétés de faible volume (une goutte) (animal vigile, 15 prélèvements au total : 7 sur une journée, 6 sur une autre, l'acte dure quelques secondes). Certains animaux auront une implantation tumorale (animal anesthésié, 1 fois, 10 minutes) combinée ou non avec l'administration de molécules (animal vigile ou anesthésié, 30 fois maximum sur 30 jours, durée 1 minute). En fin de procédure un dernier prélèvement sanguin sera effectué (animal anesthésié, 1 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Le régime alimentaire riche en gras pourra entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires. 3) Les différentes températures d'hébergement pourront entrainer un stress chez les animaux et une altération de leur thermorégulation. 4) L'anesthésie pourra engendrer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de rares cas. 5) La pousse tumorale pourra induire une gène et une douleur modérée. 6) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids. 7) Les différentes administrations peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections répétées peuvent induire risque de péritonite ou une irritation à la zone d'injection. 8) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo ou une hyperglycémie durant quelques heures. Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun. 9) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car les tumeurs, la rate, les ganglions doivent être prélevés pour analyse dans le cadre de ce projet. D’autres prélèvements seront réalisés (tissus adipeux, intestin, foie…) pour faire bénéficier des résultats pour d’autres projets.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de l’alimentation et de l’obésité sur la réponse immunitaire et le développement tumoral. Ces mécanismes impliquent des interactions complexes entre différents organes (tissu adipeux, système immunitaire, tumeur, microbiote) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles in vitro ou in silico. L’étude de la réponse immunitaire dans un contexte d’obésité, ainsi que son influence sur la progression tumorale, nécessite donc une approche intégrée à l’échelle de l’organisme. L’utilisation de modèles murins est particulièrement adaptée, notamment grâce à la possibilité de reproduire des situations physiopathologiques pertinentes (obésité induite par régime, modèles de cancer) et d’étudier finement le micro-environnement tumoral et les réponses immunitaires associées. Toutefois, dans une démarche de réduction de l’utilisation animale, des approches complémentaires in vitro seront utilisées en amont lorsque cela est possible, afin de sélectionner et de valider certaines hypothèses avant leur exploration in vivo.

Réduction

Cette étude nécessitera 1225 souris. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude. Pour l’analyse statistique, les groupes seront comparés avec des tests statistiques classiques. A la fin du projet, différents organes seront prélevés pour analyse afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux. De plus, nous optimiserons les groupes expérimentaux en partageant les témoins entre protocoles compatibles afin de limiter le nombre total de souris utilisées. Toutes les analyses seront réalisées par des experts en bio-informatique et en biostatistiques au sein du laboratoire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en armoire thermostatée avec biberon et un accès ad libitum à l'eau et la nourriture. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Quand cela est nécessaire pour limiter la douleur et le stress des animaux, les actes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. La durée des administrations sera réduite au maximum et quand cela sera possible. Les volumes injectés seront également toujours réduit au maximum. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris permet de reproduire de manière fiable des situations physiopathologiques humaines, notamment l’obésité induite par un régime riche en graisses ainsi que des modèles de cancer du sein orthotopiques, dans lesquels la tumeur se développe dans un environnement proche de celui observé chez l’homme. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier finement tous les mécanismes qui rentrent en jeu dasn ces situations. Par ailleurs, les interventions nutritionnelles et pharmacologiques peuvent être contrôlées de manière précise et reproductible. Ainsi, le modèle murin constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour répondre aux objectifs du projet. Des souris âgées de 5 semaines seront utilisées. Après une semaine d’acclimatation, les animaux entrent dans le protocole expérimental. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes présentant un système immunitaire fonctionnel et stable, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires et métaboliques. Ce choix est également justifié par la durée du protocole, qui s’étend sur plusieurs mois. L’utilisation de jeunes adultes permet ainsi de mener l’ensemble des expérimentations sur une période prolongée tout en limitant les effets liés au vieillissement.