Système endocrinien

Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

Aucun animal porteur du phénotype dommageable n'est gardé au-delà de vingt semaines, et tout individu atteignant un point limite est tué aussitôt. 2 880 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignées à inflammation chronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Le phénotype produit une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires, et les souris qui ne l'expriment pas rejoignent les groupes témoins. L'élevage alimente un projet sur le métabolisme des lipides dans le syndrome d'Aicardi-Goutières, et le porteur écrit que les animaux développeront une inflammation chronique vers vingt semaines tout en affirmant que les conditions d'élevage seront adaptées pour qu'ils ne développent pas de symptômes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Les animaux développeront aux alentours de 20 semaines d'âge une inflammation chronique liée à leur phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

3 648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections abdominales sur animal vigile pour déclencher la modification génétique, puis des glucocorticoïdes ou des régimes obésogènes pendant quatre jours à vingt semaines, avec des jeûnes de cinq à quinze heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures. Elles passent aussi deux minutes immobilisées dans un tube pour la mesure de leur masse grasse et dix minutes dans un test d'anxiété dont le protocole n'est pas nommé. L'objet est de décrire les effets d'un excès de glucocorticoïdes sur la graisse, le foie et le comportement, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit "la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les glucocorticoïdes sont des outils thérapeutiques amplement utilisés dans un large panel de maladies chroniques inflammatoires. Néanmoins chez certains patients, l’utilisation à long terme et à fortes doses peut entrainer des maladies telles que le diabète, des maladies du foie et des anomalies de répartition des dépôts adipeux, présentant des altérations fonctionnelles. Ces altérations peuvent également impacter le comportement des animaux et favoriser des troubles de l’anxiété à différents âges. Ce projet de recherche vise à décrire l’impact d’un excès de glucocorticoïdes sur la physiologie des tissus adipeux et les conséquences métaboliques sur d’autres tissus sensibles à l’action de l’insuline tels que le foie et le muscle squelettique ainsi que les conséquences sur l’activité cognitive. De plus, les expériences décrites dans ce projet permettront d’étudier le rôle des glucocorticoïdes dans un contexte d’obésité induite par des régimes obésogènes, sur les maladies hépatiques, la fonctionnalité des organes sensibles à l’insuline et dans l’équilibre glycémique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement et la morphologie des tissus graisseux, notamment lors de traitements de longue durée. Plus largement, nous examinerons aussi les conséquences de leur action des glucocorticoïdes sur les maladies du foie (par exemple, l'accumulation de graisse dans le foie, l'inflammation, la fibrose ou la cirrhose), induites par des régimes riches en graisses. À terme, ces recherches pourraient montrer que bloquer l'action de ces hormones au niveau des tissus graisseux pourrait devenir une solution pour réduire les effets négatifs de ces traitements ou de ces régimes sur le métabolisme.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à différents traitements via des régimes alimentaires spécifiques et/ou l’eau de boisson durant 4 jours à 20 semaines selon les groupes. Les animaux seront impliqués dans une mesure de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests pour évaluer soit la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon les actes), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen ou par voie orale et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Des souris adultes et âgées seront également soumises à des tests de comportement pour mesurer l’anxiété des souris traitées ou non (1 fois, 10 minutes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Les modèles transgéniques inductibles subiront des injections pour induire l’invalidation du gène d’intérêt. Les administrations entrainent une contrainte/stress liée à la contention, à la piqure qui sont légers et de courte durée. Une partie des animaux subiront des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés pendant plusieurs semaines à des régimes obésogènes pouvant induire une obésité associée à une insulino-résistance et le développement des pathologies hépatiques qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Les animaux soumis à une mesure de la composition corporelle subiront un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure (1 fois, environ 2 minutes). Les souris seront inclues dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces phénotypages seront réalisés sur des souris à jeun, pour lesquels l’alimentation aura été supprimée auparavant (entre 5h et 15h en fonction des tests mis en œuvre). Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Elles seront également amenées à suivre des challenges métaboliques. Ces manipulations pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée (contention, administration par orale et/ou injection, prélèvement sanguin de faible volume) ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, avant l’euthanasie en vue des différentes analyses, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés afin d’effectuer un prélèvement sanguin terminal qui sera suivi d’une euthanasie sans réveil des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux.

Remplacement

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement des tissus graisseux, ainsi que d’autres organes sensibles à l’insuline tels que le foie. D’un point de vue évolutif le GR apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Ce travail de physiologie intégrée permettra de comprendre d’une part, l’activité sensori-motrice et le degré d’anxiété des animaux et d’autre part, les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre les différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire le comportement des animaux et les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 3648 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié. Les administrations de traitement via l’eau de boisson seront surveillées et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Les régimes seront placés en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques et comportementales mises en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduites au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Les souris transgéniques seront utilisées à l’âge adulte et/ou âgées car nous étudions l’impact des glucocorticoïdes sur des tissus et organes matures, totalement différenciés.

Tuées à l'issue parce que leur obésité, selon le porteur, leur interdit d'être maintenues en vie, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse par un régime à 60 % de lipides, les autres le sont par une mutation du gène de la leptine qui les rend morbidement obèses dès la cinquième semaine de vie. Elles reçoivent une ou deux injections d'un nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de l'abdomen, dix minutes d'exposition à une lampe infrarouge, des prélèvements sanguins, un passage en cage à métabolisme et deux heures à 4 °C. Le porteur qualifie ce composé de "traitement révolutionnaire" qui "ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses", alors que l'étude décrite est son premier test sur un animal vivant.

Objectifs

L'obésité est une pandémie mondiale. En 2019, un indice de masse corporelle supérieur à la norme a causé 5 millions de décès. Ceci suggère un besoin urgent de nouveaux traitements. Le brunissement du tissu adipeux blanc est une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour lutter contre l’obésité. En effet, pour mieux combattre le froid, les cellules adipeuses brunes produisent des protéines transformant l’énergie graisseuse en chaleur et brûle ainsi les calories stockées. Chez l’homme, le tissu adipeux est constitué à 95% de graisse blanche et 5 % de graisse brune. Il a été montré que l’activation spécifique de certaines protéines du tissu adipeux blanc permet sa transformation en tissu adipeux brun et ainsi l’élimination des calories excédentaires sous forme de chaleur. Plusieurs molécules agissant sur la voie de signalisation intracellulaire des récepteurs régulant la fonction des adipocytes pour augmenter le métabolisme oxydatif, ont déjà été développées mais elles ont toutes montré des effets secondaires délétères Dans ce projet, nous avons développé un nanocatalyseur induisant la transformation des cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun. Les études préalables que nous avons faites in vitro ont montré qu’il induit un renouvellement important des adipocytes, et reste non toxique pour ces cellules. Pour tester son effet in vivo, nous voulons cibler le tissu adipeux blanc de souris obèses par injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux abdominaux. La présence d’acides gras sera contrôlée dans le sang, l’urine et les féces avant l’injection puis 15 et 30 jours après l’injection. La pesée des souris sera réalisée quotidiennement ainsi que le contrôle de la prise de nourriture et d’eau. L’étude sera réalisée sur 2 modèles de souris obèses : des souris nourries avec un régime riche en lipides et des souris génétiquement obèses. La 1ère étape est un test unique fait sur un petit nombre d’animaux afin de vérifier l’innocuité du catalyseur et de déterminer la dose optimale à utiliser. La 2ème étape permettra de tester 4 structures de nanocatalyseur différant de quelques acides aminés et de déterminer celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour asseoir la robustesse statistique des résultats en vue de les publier.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Ce nanocatalyseur multifonctionnel qui comprend de l'hème et des acides aminés, ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l’obésité et plus largement pour traiter les maladies cardiovasculaires. C’est un traitement révolutionnaire ayant une application à visée humaine personnalisée là où les traitements médicaux traditionnels ont leurs limites. L’étude décrite dans ce projet constitue la première étape testant la fonctionnalité in vivo chez la souris de ce nanocatalyseur transformant les cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun après tout un travail de mise au point préalable in silico et sur culture cellulaire in vitro. C’est une étape clé dans la réalisation de ce nouveau traitement contre l’obésité. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude est minimisé, l’étude exploratoire déterminera la concentration de nanocatalyseur optimale et l’étude confirmatoire, la structure la plus fonctionnelle et efficace.

Procédures

Au cours du projet, les animaux recevront une injection unique de biocatalyseur lors de l’étape 1 et deux injections à un mois d’intervalle lors de l’étape 2. Liste des interventions faites sous anesthésie gazeuse : -l’injection du nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de la souris d’une durée de 20 secondes. -l’exposition de l’abdomen des animaux à une source de lumière infrarouge commerciale (à usage médical) pendant un maximum de 10 minutes juste après l’injection du nanocatalyseur. -les prélèvements sanguins d’une durée de 1 min chacun. Liste des interventions faites sur animal vigile : -La récupération de selles et d’urine après avoir mis les animaux en cage à métabolisme pendant 30 min. En cage à métabolisme, les souris ont un accès libre à la nourriture et à la boisson. - Le test de tolérance au froid (4°C) d’une durée de 2h, nous utiliserons une caméra infrarouge avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris. Les souris dont la température cutanée aura baissé de plus de 1°C par rapport au début de l’expérimentation seront remises à température ambiante et réchauffée sous une lampe infra rouge médicale.

Impact sur les animaux

L’injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux de la souris peut engendrer une légère douleur, ainsi que l’exposition consécutive de l’abdomen des animaux à une source de lumière IR (à usage médical) pendant 10 minutes. Le prélèvement sanguin peut également être douloureux. Bien que peu probable, la toxicité potentielle du nanocatalyseur est aussi à envisager dans les effets indésirables attendus sur les animaux particulièrement lors de la 1ère étape du projet. L’état d’obésité obtenu chez les groupes de souris ayant une alimentation enrichie en lipides ainsi que l’état d’obésité avéré des groupes de souris obèses génétiquement est à prendre en compte dans les nuisances potentielles attendues sur les animaux même si des mesures de suivi, de soins et de conditions d’hébergement seront prises en conséquence. Avec l’âge et la prise de poids, ces animaux seront en perte de mobilité. Ils seront susceptibles de développer des maladies métaboliques chroniques. L’exposition au froid est également à considérer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car leur autopsie et les prélèvements de coeur, de foie et de rein de tissu adipeux blanc et brun sont nécessaires pour compléter notre étude. De plus, ce sont des animaux obèses qui ont des facteurs de comorbidité importants et ne peuvent être maintenus en vie.

Remplacement

Le recours à la pratique sur animal pour valider la fonctionnalité thérapeutique de ce nanocatalyseur est essentiel. Cette validation arrive au terme de plusieurs longues étapes de mise au point in silico et d’études de sa fonctionnalité in vitro. Il a d’abord été élaboré in silico en utilisant des logiciels de conception. Son efficacité et sa toxicité ont également été évaluées in silico au moyen de logiciels puis il a été testé in vitro sur culture de cellule. Toutes les expériences in vitro possibles ont été réalisées au préalable. Tous les critères étant validés, il doit être testé in vivo car les expériences sur la souris constituent l'étape ultime dans le développement de cette nouvelle thérapie et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Nous avons fait tout notre possible pour remplacer l’expérimentation sur l’animal qui arrive en bout de chaine d’étude et seulement après la validation des tests in vitro et de l'étape 1 in vivo.

Réduction

Lors de la 1ère étape du projet déterminant la dose optimale de nanocatalyseur à utiliser, un total de 16 souris nourries avec un régime riche en lipides et 16 souris génétiquement obèses seront utilisées. La 2ème étape du projet permettra de tester 4 structures différentes de nanocatalyseur et de préciser celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour valider statistiquement les résultats en vue de les publier. Pour la 2ème étape du projet, avec l’aide d’un biostatisticien, nous avons établi : -qu’un protocole type utilisera 16 souris nourries avec un régime riche en graisses et 16 souris génétiquement obèses -que 4 protocoles types seront réalisés pour tester les 4 structures de nanocatalyseur (1 structure de nanocatalyseur par protocole type). - que la structure du nanocatalyseur déterminée comme étant la plus fonctionnelle et la plus efficace pour le brunissement des adipocytes donnera lieu à un replicat unique du protocole type en vue d’asseoir la robustesse statistique des résultats et de les valider statistiquement. Sur 2 ans, nous utiliserons un total de 160 souris maximum et moins si les résultats escomptés sont obtenus avant. Pour le test au froid, nous n’utiliserons pas de groupes d’animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées par lot est calculé au plus juste pour interpréter et valider statistiquement les résultats. Les groupes de souris témoins négatifs de la 1ère étape du projet seront réutilisés dans l’étape 2 et non pas en surnuméraire. La taille de l'échantillon a été estimée selon des hypothèses appropriées et les résultats seront analysés avec un test statistique approprié. Selon ces hypothèses, nous avons obtenu une taille de groupe de huit animaux. Les animaux seront assignés au hasard aux groupes expérimentaux. Les données seront traitées en aveugle. Tous les animaux en bonne santé avant et pendant l'expérience seront inclus dans l'étude. Si des signes de détresse, de douleur et de perte d'état corporel sont observés, les souris seront exclues du protocole et prise en charge par des antalgiques.

Raffinement

Dès leur entrée à l’animalerie et pour toutes les souris, la surveillance sera quotidienne, des croquettes seront mises dans une mangeoire dans la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation des animaux obèses ainsi que l’utilisation de biberons à pipettes longues. La fréquence de change sera de 2 fois par semaine (les souris obèses sont diabétiques et urinent plus) et les souris seront hébergées par 4 dans une cage. Avant le début du protocole, les animaux seront pesés à l’occasion des changes pour éviter de les perturber avec mesure de la prise de nourriture et de boisson. Une grille d’évaluation clinique du bien-être (BEA) spécifique au protocole sera mise en place pour chaque animal dès son arrivée avec un scoring du comportement (attitude dans la cage), de l’aspect physique (aspect du poil), de la physiologie (hyperventilation, déshydratation) et de l’évolution du poids. Ce qui permettra d’adapter un traitement antalgique selon le score obtenu. Une surveillance renforcée des souris sera effectuée après l’injection du nanocatalyseur : toutes les 2h pendant 12h puis toutes les 12h pendant 72h et enfin quotidienne avec contrôle de la consommation de nourriture, de la boisson, pesée des souris et observation de leur état général. Des points limites adaptés seront mis en place pour les souris obèses de ce projet. Durant l’exposition au froid, nous utiliserons une caméra IR avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris mais si la température corporelle d’un animal baisse de 1°C, il sera immédiatement retiré et réchauffé sous une lampe infrarouge. Durant l’expérience, pour éviter toute douleur, la plupart des actes seront faits sur souris anesthésiées : l’injection du nanocatalyseur, l’exposition de l’abdomen à une source de lumière IR, ainsi que le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Chez l’homme, l’obésité résulte de facteurs alimentaires, génétiques/épigénétiques et environnementaux. Elle est due à : 1) une alimentation trop riche, une activité physique faible 2)une prédisposition génétique : 8 gènes responsables d’obésité monogénique et 22 gènes de prédisposition à l’obésité ont été identifiés. Par conséquent, nous utiliserons, ici, les 2 modèles de souris développés spécifiquement pour les études sur l’obésité : -l’un reproduit les conditions humaines d’obésité alimentaire avec insulino-résistance : souris nourries avec un régime enrichi en lipides 60% pendant 30 jours. -le modèle génétiquement obèse est proche de l’obésité génétique humaine (mutation du gène codant pour la leptine également identifiée chez l’homme). Elles présentent une obésité morbide apparaissant 4 à 5 semaines après la naissance, s'accompagnant de troubles métaboliques. La prise en charge des animaux obèses est décrite dans les procédures. Ces animaux sont de jeunes adultes mâles de 25 grammes soit 35 à 42 jours environ. C'est à ce stade de développement que la courbe de croissance des souris s'infléchit et que les fonctions physiologiques de l'animal ont atteint leur maturité. Notre étude à visée humaine doit être réalisée sur souris adultes comme le sont la plupart des études précliniques de ce type en recherche fondamentale.

Frottis vaginaux quotidiens, micro-incisions de la queue pour quatre prises de sang étalées sur huit heures, cathétérisation artérielle permanente, pose d'un capteur de glycémie sous la peau, ablation des ovaires avec implant hormonal : 328 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des gènes, des hormones et des organes. Le porteur retient cette espèce parce que son système circadien ressemble à celui des humains, contrairement aux rats et aux souris nocturnes, et n'utilise que des femelles. Il annonce une perte de poids possible de 15 %, une inflammation des plaies, un risque d'hémorragie lié à la cathétérisation et un hébergement individuel pendant toute l'expérimentation pour une partie des animaux. Le régime de lumière nocturne qui donne son objet au projet n'est décrit nulle part, et l'effectif de 328 animaux repose sur des moyennes d'études antérieures sans calcul exposé.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives. Le projet initial nécessite l'ajout de 16 animaux pour modification de la voie de cathétérisation.

Bénéfices attendus

Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.

Procédures

Pour analyser l'effet de la pollution lumineuse sur le métabolisme: un groupe de 108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée puis à 5 microprélèvements sanguins sur une période de 3H. Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus.16 animaux maximum seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale. 16 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 1H) pour réaliser des prélèvements sanguins séquentiels un ou plusieurs jours. Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale. Pour analyser le cylce sexuel, 108 autres individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un groupe de 48 animaux sera soumis à une ablation des ovaires et à la pose d'un implant sous cutané d'hormone sous anesthésie générale. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux vigiles maintenus à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%, une inflammation des plaies et l'hémorragie comme complication de la canulation cathétérisation artérielle ne peut être totalement exclue. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. La contention douce nécessaire aux injections peut entrainer un stress léger de courte durée.

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.

Remplacement

En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.

Réduction

En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.

Raffinement

En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.

Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.

Objectifs

Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.

Bénéfices attendus

Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.

Procédures

Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (

Impact sur les animaux

Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.

Remplacement

Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.

Raffinement

Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.