Système endocrinien

Exposées à 30 °C pendant toute leur croissance puis portées à 40 °C pendant près de quatre heures à deux reprises, 160 cailles japonaises subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont piquées pour un prélèvement de sang à cinq reprises la première année, puis tous les six mois jusqu'à leur mort, et passent une nuit entière isolées dans une chambre calorimétrique à cinquante et à cent jours. Deux sessions dans une arène circulaire d'un mètre trente mesurent leur réaction à un objet nouveau, ce que le porteur rattache à l'anticipation des effets des vagues de chaleur sur la faune sauvage. Toutes les femelles restent à l'élevage jusqu'à leur mort naturelle, les trois quarts des mâles sont proposés à l'adoption et les autres sont tués pour prélever leurs tissus.

Objectifs

L’un des défis majeurs de notre époque est d’anticiper l’ampleur des changements environnementaux globaux. Ceux-ci se traduisent par une hausse des températures moyennes et une augmentation des événements climatiques extrêmes, comme les vagues de chaleur. Ces modifications affectent les écosystèmes en influençant la phénologie, la distribution des espèces et les réseaux trophiques. Elles impactent également les traits d’histoire de vie, le comportement et la physiologie des organismes. Comprendre la capacité des espèces à s’adapter aux variations de température est donc essentiel. Les organismes possèdent une plage thermique optimale pour leur physiologie. Chez les endothermes (organismes capables de maintenir une température corporelle constante), la zone de neutralité thermique représente l’intervalle où aucune production ou dissipation active de chaleur n’est nécessaire. Au-delà de cette limite, le stress thermique impose aux individus de dissiper activement la chaleur. Des températures extrêmes influencent la croissance, la reproduction et la survie. À l’échelle physiologique, ces variations peuvent modifier la production de corticostérone, une hormone de stress, dont l’élévation pourrait accélérer le vieillissement cellulaire. Notre compréhension des effets du stress thermique sur les réponses moléculaires (dégâts sur l’ADN), physiologiques et comportementales reste limitée. Explorer ces mécanismes et leurs conséquences sur la reproduction et la survie permettrait de mieux prédire l’impact des changements climatiques sur la dynamique des populations. Ce projet étudie les effets du stress thermique en analysant divers mécanismes physiologiques et moléculaires chez la caille japonaise (Coturnix japonica). L’objectif est d’évaluer l’impact d’une hausse de température sur le métabolisme, les marqueurs du vieillissement, la réponse au stress ainsi que la survie et la reproduction. Ces résultats seront essentiels pour évaluer la résilience des individus face au stress thermique et identifier les effets des modifications climatiques sur leur survie et leur reproduction, contribuant ainsi à une meilleure surveillance des réponses biologiques aux changements globaux.

Bénéfices attendus

Le projet apportera des bénéfices en termes de connaissances fondamentales concernant : - La capacité des organismes à s'adapter lors d'une exposition prénatale à une vague de chaleur - les mécanismes physiologiques sous-tendant l’effet d’un stress thermique sur le vieillissement cellulaire - l’importance des effets d’un stress thermique sur la survie et la reproduction des organismes. Ces connaissances fondamentales visant à caractériser la réponse au stress thermique et aux températures anormalement chaudes, sont notamment nécessaires dans une optique de suivi de la réponse des organismes aux changements climatiques. A long-terme, tester les conséquences du stress thermique sur la condition physique et les mécanismes physiologiques sous-jacents pourra permettre une meilleure modélisation des effets futurs de ces changements sur les réponses adaptatives des organismes.

Procédures

Voici les durées des gestes cités qui seront réalisés sur animal vigile, les 160 animaux de l’expérimentation sont concernés par ces procédures : -Exposition chronique à une température de 30±2°C lors de la croissance et exposition aigue à 40°C pendant moins de 4h lors de la mesure du métabolisme à J50 et J100. -Prélèvements de sang (30s) réalisés à J8, J20, J50, J60 et J100 puis une fois tous les 6 mois jusqu’à la mort de l’animal, -Prélèvement de plumes (≤10s) réalisés 1 fois à J20, -Analyses métaboliques dans une chambre calorimétrique (de 20h à 12h le lendemain) réalisées à J50 et J100 -Un des objectifs de l’étude etant de mesurer comment certains comportements (néophobie, exploration, etc.) peuvent être affectés par un stress thermique lors du développement et/ou de la croissance, les animaux seront placés dans une arène circulaire (1m30 de diamétre) et leurs comportements d'exploration ou d'approche d'un nouvel objet seront enregistrés durant 2 sessions de ≤30min chacune à J20 et J50.

Impact sur les animaux

La manipulation lors des différentes mesures (baguage, pesée, prise de sang, etc.) peut entrainer de la peur/de la détresse chez l’animal. Lors des prises de sang, la piqure d’aiguille entraîne un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur légère ayant pour conséquence un stress physique léger de courte durée. Le prélévement de deux plumes à J20 entraine un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur légère ayant pour conséquences un stress physique leger. Lors de l’évaluation comportementale, les animaux seront isolés ayant pour conséquence une peur/détresse légère à modérée ainsi qu’une exposition à un nouvel environnement. Lors de la mesure du taux métabolique, les animaux seront isolés au cours de la nuit puis au cours de la matinée suivante qui inclue une exposition graduelle (sur une durée de 4h) à un stress thermique. Cette manipulation peut entrainer un stress physique (isolement, mobilité réduite, environnement non adapté) et physiologique (faim, soif) modéré.

Devenir

Toutes les femelles seront gardées à l’élevage et suivies jusqu’à leur mort naturelle. Après la maturité sexuelle, 75% des mâles seront placés à l’adoption, et si celle-ci n’est pas possible ils seront euthanasiés pour collecter des tissues permettant des analyses physiologiques complémentaires.

Remplacement

Le projet vise à comprendre l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacents. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives disponibles à ce jour.

Réduction

Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs. Cela est possible grâce à la réalisation de l’expérimentation en 2 sessions (une par an) qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lors de la deuxième session en fonction des résultats obtenus lors de la première session. Certaines mesures comme les prises de sang, les mesures morphologiques et celles du comportement ont été regroupées afin de réduire le nombre de manipulation des animaux.

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux pendant les procédures : - stabulation en groupes mixtes au sol en densité modérée - température optimale (pour le groupe contrôle), nourriture et eau ad libitum - enrichissement structurel : cachettes, brises-vue et capsules de bouteilles (jouets) - enrichissement alimentaire (litière dense propice au fouissage, vers de farine dispersés 1x/jour dans la litière) - Lors des différentes mesures et dans l’élevage, des points limites précoces feront l’objet d’une attention spécifique. Si un animal présente des signes de souffrance (listés dans un arbre décisionnel précis), il sera soit retiré de l’expérimentation, traité si besoin et replacé dans des conditions contrôle, soit mis à mort si les souffrances sont irréversibles et après avis du véterinaire référent.

Choix des espèces

La caille japonaise, utilisée pour ce projet, présente à la fois une sensibilité au stress thermique ainsi qu’une facilité d’incubation artificielle et la capacité de prospérer dans des environnements de laboratoire contrôlés, ce qui fait d’elle un bon modèle pour étudier les effets du réchauffement climatique. Les cailles peuvent servir d'analogues à de nombreuses espèces d'oiseaux vivant au sol ou à de petits animaux terrestres, en particulier dans les zones semi-arides ou tempérées. De plus, cette espèce est un excellent modèle aviaire dans un contexte d’étude du vieillissement. Son cycle de vie court (de 50 à 60 jours entre l’éclosion et la maturité sexuelle) permet de réaliser des études jusqu'à l'âge adulte des individus en un temps réduit. Les animaux seront utilisés au stade poussin (début de procédure à J2) afin d'étudier les effets d'un stress thermique lors de la croissance. Ils seront également suivis au stade adulte (tous les 6 mois jusqu’à leur mort) afin d’évaluer les effets à moyen et long terme du stress thermique éprouvé lors du développement embryonnaire et/ou de la croissance.

Les souris qui font plusieurs hypoglycémies avant de recevoir la thérapie génique sont mises à mort. 58 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour prélever leur foie. La maladie leur est induite par cinq injections quotidiennes, puis viennent l'injection du vecteur viral dans la circulation, deux semaines de régime riche en sucres et en graisses pour une partie d'entre elles, une incision du bout de la queue et six prélèvements de sang par test de glycémie. Le porteur cherche lequel de deux vecteurs dérègle le moins la glycémie, et espère en tirer des recommandations alimentaires pour des patients dont la maladie touche environ 150 personnes en France.

Objectifs

La glycogénose de type I est une maladie génétique rare causée par un défaut dans un gène qui joue un rôle clé dans la production de sucre (glucose) par le foie. Lorsqu'il ne fonctionne pas correctement, le corps ne peut pas produire de glucose en interne, ce qui entraîne de graves baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies). De plus, des accumulations de glycogène (polymère de glucose) et de graisses se forment dans le foie, ce qui peut provoquer des problèmes hépatiques à long terme, allant jusqu’au développement de tumeurs pouvant nécessiter une greffe du foie. Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour cette maladie. Les patients doivent suivre un régime alimentaire très strict pour éviter les hypoglycémies, en mangeant régulièrement des sucres lents (Maïzena crue). La thérapie génique est une piste prometteuse ; elle consiste à introduire un gène fonctionnel dans le foie à l’aide de virus modifiés qui servent de « transporteurs » du gène médicament. Une étude sur un modèle viable de souris atteintes de glycogénose de type I a montré que l’injection unique de ce traitement permettait de restaurer la production de glucose par le foie et d’éviter l’apparition de tumeurs. Deux types de vecteurs ont été testés. Le premier est plus efficace et nécessite l’injection d’une dose plus faible, mais l’expression du gène médicament n’est pas régulée par l’insuline. Le deuxième, bien que moins efficace, est sensible aux régulations hormonales. Ces régulations sont importantes car l’insuline est une hormone qui contrôle le taux de sucre dans le sang. Elle est produite par le pancréas après un repas pour éviter que les taux de glucose dans le sang soient trop élevés. L’absence de régulation hormonale de l’expression du gène médicament pourrait dérégler l’équilibre de glucose dans le corps, et potentiellement favoriser une résistance à l’insuline, surtout en cas d'alimentation déséquilibrée, voire une hyperglycémie, qui sont les caractéristiques du diabète. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la thérapie génique sur l’équilibre du glucose et la réponse à l’insuline chez des souris atteintes de glycogénose. Ces souris suivront deux types d’alimentation : • Un régime normal • Un régime riche en sucre et en graisses (favorisant le diabète) Cela permettra de s’assurer que le traitement ne provoque pas de complications métaboliques, quelles que soient les habitudes alimentaires du patient.

Bénéfices attendus

Le taux de sucre dans le sang (glycémie) doit être très bien régulé. Si le foie produit trop de glucose, cela peut entraîner un risque de diabète, surtout chez les personnes ayant une alimentation déséquilibrée et un excès de poids. Les patients atteints de glycogénose de type I ne produisent pas de glucose eux-mêmes, donc ils doivent manger régulièrement des sucres lents tout au long de la journée et même la nuit. Ce régime constant peut les rendre moins sensibles à l'insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. La thérapie génique pourrait leur permettre de produire du glucose, mais selon la méthode utilisée, elle pourrait aussi modifier l’équilibre glycémique et, à long terme, augmenter le risque de diabète, surtout si leur alimentation n’est pas adaptée. Ce projet vise à mieux comprendre comment la thérapie génique influence la régulation du glucose chez des souris atteintes de glycogénose, en particulier après les repas. L’objectif est de trouver la meilleure approche pour optimiser ce traitement et, si nécessaire, donner des recommandations alimentaires aux patients pour éviter d’éventuels effets secondaires.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Toutes les souris transgéniques seront traitées par thérapie génique par une injection unique du vecteur dans la circulation sanguine. Pour cela, les souris seront immobilisées dans un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (durée d’environ 1 minute). Une partie des souris seront nourries en régime riche en sucres et en graisse pendant 2 semaines après la thérapie génique. Ce régime pourrait favoriser le développement d’un état prédiabétique chez certains lots de souris, sans conséquence sur le bien-être animal (asymptomatique). Pour analyser la régulation de leur glycémie, les souris recevront une injection de glucose ou d’insuline et leur glycémie sera mesurée régulièrement. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 6 fois au cours de chaque test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Au total, 3 prises de sang seront aussi réalisées avant et après l’injection du glucose pour suivre la sécrétion d’insuline. En fin de procédure, une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : -l’induction de la glycogénose de type I qui est une maladie entrainant des hypoglycémies sévères quand les animaux ne mangent pas (entre les repas). Le développement des hypoglycémies entraine un mal-être qui peut être important, voire le décès de l’animal s’il n’est pas pris en charge. -la biopsie de tissu et les injections peuvent entrainer une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour réaliser ces gestes induit un léger stress. -la prise de sang peut entrainer une légère douleur.

Devenir

Afin de caractériser l’effet des traitements, en particulier le pourcentage de cellules du foie guéries et le nombre de particules virales, le foie sera prélevé en fin d’expérience. Pour cela, tous les animaux devront être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui, on sait fabriquer en laboratoire de mini-foies appelés organoïdes, qui contiennent différents types de cellules du foie (comme les hépatocytes, les cellules biliaires ou encore les cellules immunitaires). Cependant, la thérapie génique ne peut pas être testée uniquement sur ces mini-foies, car elle repose sur l’injection de virus modifiés dans le sang pour transporter le gène médicament. Pour fonctionner, ces vecteurs doivent atteindre les cellules du foie (hépatocytes) en traversant les petits vaisseaux sanguins. Or, toutes les cellules du foie ne seront pas forcément corrigées. L’efficacité du traitement dépend donc de la quantité de cellules qui reçoivent le gène. C'est pourquoi il est essentiel de tester cette thérapie dans un organisme entier, où la circulation sanguine et le fonctionnement du foie sont aussi proches que possible de la réalité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour cette étude a été calculé avec précision, en tenant compte des connaissances actuelles sur la maladie, du modèle animal choisi, du fonctionnement du métabolisme du sucre et de l’énergie, des résultats d’expériences précédentes et d’une approche statistique. Au total, ce projet réalisé sur 2 ans nécessitera 58 souris mâles, dont 50 souris atteintes de la maladie et traitées par thérapie génique et 8 souris saines servant de groupe témoin.

Raffinement

-Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, l’induction de la maladie sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. -La maladie étudiée ne se développe que dans le foie des souris adultes, ce qui évite des complications comme des hypoglycémies graves et protège les souris pendant leur développement. - Avant que la maladie n’apparaisse, les souris seront habituées à boire du glucose à la pipette. Ainsi, si leur taux de sucre baisse légèrement, elles accepteront plus facilement cette solution. - Pour éviter les hypoglycémies, les souris auront un accès facile à la nourriture (croquettes dans la cage, biberons adaptés). En cas d’hypoglycémie sévère, une injection de glucose sera réalisée, et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir leur température. Une grille d’évaluation permettra de surveiller les signes d’hypoglycémie. L’apparition de plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique constitue un point limite nécessitant l’euthanasie de la souris pour raison éthique. -Les souris seront manipulées avec un tunnel pour limiter leur stress. -Pour réduire la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones de ponction du sang et d’incision. -Une grille de score aidera à prendre des décisions en cas d’observation d’un mal-être et décrit les points limites au-delà desquels les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. La maladie sera induite à l’âge de à 5 semaines. Une période de 5 semaines suivant ces injections permet la disparition des effets potentiels sur le métabolisme du produit injecté lors de l’induction de la maladie. Les souris seront traitées par thérapie génique à l’âge de 10 semaines. Les souris saines témoins seront commandées dès l’âge de 4 semaines.

4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant jusqu'à deux fois en contention dans un tube d'IRM et donnant six gouttes de sang en deux heures après incision du bout de la queue. La moitié d'entre elles, soit 2 160 souris, reçoit un régime hyperlipidique pendant trois semaines à quinze mois pour développer une obésité, avec une prise de poids que le porteur estime pouvoir atteindre 200 % du poids initial. 2 400 subissent en plus une chirurgie cérébrale d'une heure pour injection d'un virus, et 1 920 un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq jours. Le porteur annonce à long terme de nouvelles stratégies contre l'obésité, quand l'objectif immédiat reste de cartographier des sous-populations de neurones de l'hypothalamus.

Objectifs

L'obésité est un problème de santé très sérieux, souvent lié à des maladies comme le diabète ou les problèmes cardiaques. Dans le cerveau, une région appelée l’hypothalamus joue un rôle clé pour contrôler la faim et gérer l’énergie du corps. Cela se fait grâce à des cellules nerveuses spécialisées, appelées neurones, qui aident à limiter la prise alimentaire et à réguler le métabolisme. Si ces neurones ne fonctionnent pas bien, cela peut conduire à l’obésité. Cependant, tous les neurones ne sont pas identiques. Notre objectif est de mieux comprendre cette diversité pour savoir comment ces neurones influencent l'obésité. Pour cela, nous utiliserons des outils génétiques pour marquer ces neurones et suivre leur évolution dans le temps. Nous testerons également une technologie innovante pour activer ou désactiver précisément les certaines sous-population de neurones, grâce à des molécules spécifiques. Cela nous aidera à voir comment ces cellules influencent le métabolisme et le développement de l’obésité. Dans chaque modèle, nous soumettrons la moitié des souris à un régime riche en graisses pour observer l’apparition et l’évolution de l’obésité sur des périodes allant de quelques semaines à plus d’un an. Avec ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle des neurones de l’hypothalamus et leurs sous-populations, afin de trouver de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter l’obésité.

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, plus d’un milliard de personnes dans le monde sont touchées par l’obésité, ce qui en fait une priorité de santé publique. Les traitements actuels s'avèrent peu efficaces, et les interventions durables se limitent souvent à des techniques invasives comme la chirurgie bariatrique (opération chirurgicale visant à réduire ou court-circuiter l'estomac), qui n'offre pas toujours de résultats garantis. Face à ce défi, approfondir notre compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’obésité devient crucial pour développer des solutions thérapeutiques plus adaptées et efficaces à l’avenir. À court terme, notre projet fournira de nouvelles informations sur les processus qui encouragent la consommation d’aliments hypercaloriques et participent au développement de l’obésité et des comorbidités associées. De plus, il s’inscrit dans un cadre de recherche international visant à déchiffrer les rôles spécifiques des différentes sous-populations de neurones. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux lutter contre l’obésité.

Procédures

Administration orale (1920 animaux) : Chaque souris recevra un médicament par voie orale une fois par jour pendant 5 jours. Cette procédure est rapide, ne durant que 15 secondes par animal, et ne nécessite pas d’anesthésie. Nous manipulons les souris avec soin pour éviter tout stress. Chirurgie cérébrale (2400 animaux) : Une intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale pour garantir l’absence de douleur. Chaque souris ne subira qu’une seule opération d’une heure maximum au cours de sa vie. Analyse de la composition corporelle (4320 animaux) : Pour mesurer la composition corporelle (graisse, muscles, etc.), une IRM est utilisée. Cette méthode est rapide (moins de 5 minutes) et réalisée en maintenant l’animal en contention pour réduire tout inconfort. Une même souris peut passer cette analyse au maximum deux fois dans sa vie. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline (4320 animaux) : Ces tests, réalisés une fois par animal, consistent à mesurer la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. La moitié des souris (2160) seront sous un régime hyperlipidique afin de mimer l’obésité.

Impact sur les animaux

Les souris du premier objectif recevront une administration orale de tamoxifène, un agent pharmacologique qui peut provoquer des effets secondaires. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Bien que l'administration par gavage oral soit indolore, elle nécessite une immobilisation complète de l’animal, générant un certain niveau de stress. Les souris du deuxième objectif, subissant une injection dans le cerveau à des endroits précis de virus, pourraient également ressentir des douleurs post-opératoires liées à la neurochirurgie. Ces douleurs sont principalement dues à l’incision cutanée du crâne et à la déshydratation associée à l’anesthésie, mais elles devraient diminuer dans les jours suivant l’intervention grâce au traitement analgésique mis en place. Lors du suivi du développement de l’obésité : Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Prise de poids consécutive au régime gras. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline : Mesure de la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. Ces tests reproduisent les conditions physiologiques suite à un repas. Les hyperglycémies et hypoglycémies sont monitorées mais n’induisent aucun mal-être.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem. Toutes les souris sont classées sans réveil.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la fonction et le mécanisme de développement de ces sous-populations de neurones associés à un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

La composition corporelle de tous les animaux adultes sera analysée in vivo par résonnance magnétique nucléaire. Ce type d’analyse permet de vérifier les changements de composition corporelle des animaux dans le temps et en fonction des différents régimes alimentaires. Cette approche permet d’éviter de sacrifier plusieurs lots d’animaux à des temps différents pour vérifier les changements de composition corporelle.Nous avons réalisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires dans les deux sexes afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Pour l’analyse des données, nous comparerons les différents groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux demandé correspond au maximum estimé pour le projet. Si, en cours d’étude, nous constatons qu’il est possible de le réduire, nous le ferons bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement pour les pièces d'hébergement. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise), qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise) (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales et seront soumises soit à un régime hyperlipidique induisant l’obésité ou un régime standard pendant 3 semaines, 3 mois, 6 mois, 9 mois ou 15 mois et 2 semaines (en tenant compte des 5 jours de tamoxifène et l’attente d’une semaine). Les souris sont donc utilisées jusqu’à un âge de maximum 17 mois et 2 semaines.

Un jeûne de 12 heures puis un gavage d'huile, un jeûne de 6 heures puis un gavage de sucre, une incision au bout de la queue avant chaque test pour prélever le sang : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 90 d'entre elles reçoivent 20 semaines d'alimentation riche en graisses, pour tester si des aliments enrichis en oméga-3 et en extraits de plantes renforcent l'immunothérapie contre le cancer du sein triple négatif chez des souris obèses. Identifiées par un poinçon à l'oreille, toutes reçoivent ensuite sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire, puis 6 à 7 injections de traitement en 21 jours et une mesure de la tumeur tous les trois jours sous anesthésie. Le porteur retient des souris de 7 semaines parce que ce cancer "est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes", et écrit que l'étude "pourrait poser les bases de futures recherches chez l'Homme".

Objectifs

Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.

Procédures

• Une identification indivuelle par poinçonage de l’oreille sera appliquée aux 120 souris. • Trois groupes de 30 souris (90 souris) recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • Deux mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées brièvement dans un tube (moins de 2 min/souris). Les deux mesures seront réalisées à 16 semaines d’intervalle. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6 heures (le matin) avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures (toute la nuit) avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces deux tests seront effectués avec une semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi du cancer : - Avant l’injection des cellules cancéreuses, une injection du mélange d’anesthésiques sera réalisée dans l’abdomen de toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera donc sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur le plus précocément possible (toutes les souris vigiles, environ 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum soit entre J3 post injection des cellules et J7) - Traitement : 6 à 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection unique d’anesthésique pour toutes les souris (quelques secondes/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie profonde pour toutes les souris (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.

Raffinement

Plusieurs mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : Pour éviter d’avoir à recourir aux gavages quotidiens, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont directement ajoutés à la nourriture. Seules deux personnes expérimentées manipuleront les souris dès leur arrivée et tout au long de l’étude pour qu’elles s’habituent à leur présence.Une surveillance de tous les animaux sera mise en place deux fois par semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7 jours sur 7 après leur injection. A chaque passaque une vérification de l’état général des souris (apparence (pelage, posture, yeux, oreilles), comportement (activité, interactions, agressivité, réaction au toucher)) sera réalisée. De plus, un suivi du poids des souris serait réalisé une fois par semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite deux fois par semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule petite incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation forcée des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un médicament contre la douleur. Ensuite,une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la croissance de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les trois jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera quatre semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.

6 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à 56 injections, subir 26 mesures de composition corporelle et 15 prélèvements sanguins dont sept en une seule journée. Un quart d'entre elles est exposé au froid pendant 21 jours, d'autres sont hébergées à 30 degrés jusqu'à six mois ou soumises à un régime engraissant pendant cinq mois. Le porteur décrit les nuisances attendues, prise de poids modifiant la mobilité, problèmes cardiovasculaires liés à l'obésité, diarrhées, hématomes, risque de péritonite et d'irritation de l'œsophage. Les retombées thérapeutiques annoncées contre l'obésité restent au conditionnel, et l'effectif de 6 080 animaux est rapporté à des "outils statistiques" et au partage des témoins entre protocoles, sans qu'aucun chiffre soit donné.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser les mécanismes de différenciation et d’adaptation des cellules adipeuses en réponse aux variations pondérales, en particulier dans le contexte de l’obésité. L'idée est d'identifier les éléments clés qui favorisent ou freinent l'inflammation et la régénération de la graisse en étudiant : les adipocytes (les cellules qui fabriquent la graisse) et les cellules impliquées dans leur régulation. Pour cela, les cellules du tissu adipeux seront étudiées en parrallèle de l'évaluation de l'état de santé des animaux. L'objectif final est de voir si on peut agir directement sur ces cellules pour rendre le tissu adipeux plus sain, ce qui pourrait non seulement améliorer la gestion du poids mais aussi la santé métabolique en général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les acteurs moléculaires essentiels au bon fonctionnement des progéniteurs (cellule à l'origine des cellules graisseuses) et des adipocytes (cellules graisseuses) du tissu adipeux. En effet, la perte de fonction des adipocytes contribue au développement et à l’aggravation des comorbidités associées à l’obésité. Bien que le lien entre les altérations du tissu adipeux et la sévérité clinique de l’obésité soit bien établi, les mécanismes capables de restaurer les fonctions de ce tissu restent aujourd’hui largement méconnus. Nos travaux permettront donc, à terme, de développer des stratégies thérapeutiques innovantes ciblant le tissu adipeux, afin de limiter les désordres métaboliques liés à l’obésité. Par ailleurs, nos résultats pourraient également ouvrir la voie à de nouvelles approches pour optimiser la perte de poids et en améliorer les bénéfices métaboliques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc : 1) de mieux comprendre le fonctionnement des cellules graisseuses 2) les mécanismes de régulation de ces cellules 3) afin de trouver de nouvelles stratégies pour lutter contre l'obésité et les maladies métaboliques associées.

Procédures

La moitié des animaux recevront une molécule pour enclencher le phénotype souhaité (animal vigile, par voir orale 21 fois sur 10 semaines-1minute ou par injection 28 fois sur 14 jours-11minute ou en continu en eau de boisson ou via l'alimentation). La moitié des animaux pourra être sous régime alimentaire spécial (animal vigile, 5 mois maximum en continu). Les animaux seront hébergés à température ambiante ou à thermoneutralité (30 degrés) (animal vigile, 6 mois maximum en continu). Ils pourront recevoir un traitement au cours du projet (animal vigile, 1 fois par jour pendant 8 semaines maximum soit 56 fois, 1 minute). La composition corporelle (taux de gras, de muscle et d'eau) de l'animal sera évaluée de manière non invasive (animal vigile, 26 fois soit 1 fois par semaine pendant 6 mois, 3 minutes). Des challenges métaboliques seront effectués : une exposition au froid pour 25 pourcents des animaux (animal vigile, 21 jours maximum en continu), un test de tolérance au glucose (animal vigile, 1 fois, 2 heures), un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 1 fois, 2 heures) et un test de réponse au jeun (animal vigile, 1 fois, 16h). La dépense d'énergie des animaux sera mesurée (animal vigile, 1 fois, 4 jours). Certains tests nécessiteront des prélèvements sanguins répétés (animal vigile, 15 prélèvements au total : 7 sur une journée, 6 sur une autre puis 2 sur une dernière, l'acte dure quelques secondes). En fin de procédure des mesures seront réalisées (animal vigile ou anesthésié, 1 fois, 5 minutes à 1 heure).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires. 3) Les différentes températures d'hébergement pourront entrainer un stress chez les animaux et une altération de leur thermorégulation 4) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids. 5) Les différentes administrations peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections répétées peuvent induire risque de péritonite, des lésions cutanées, une irritation de l'oesophage ou à une irritation de la zone d'injection. 6) Les mesures de la composition corporelle et des échanges de chaleur (calorimétrie) peuvent induire un stress léger chez les animaux 6) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun de quelques heures 7) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre des prélèvements post-mortem, principalement des tissus adipeux. D'autres organes seront également collectés, dans une logique de valorisation optimale des données issues de chaque animal au service de la recherche.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier et de comprendre comment sont régulées les cellules du tissu adipeux. Pour cela, il est essentiel d’adopter une approche à l’échelle de l’organisme, ce qui nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux adaptés. Les souris sont particulièrement pertinentes, car elles permettent de développer des modèles transgéniques ciblés pour analyser des mécanismes précis. C’est pourquoi l’utilisation de modèles rongeurs est indispensable et ne peut être remplacée. Toutefois, nous exploiterons autant que possible des modèles cellulaires in vitro afin d’affiner nos analyses avant de valider nos résultats in vivo.

Réduction

Cette étude nécessitera 6080 souris. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude. Les résultats seront évalués à l'aide de tests statistiques. A la fin du projet, différents organes seront prélevés pour analyse afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux. De plus, nous optimiserons les groupes expérimentaux en partageant les témoins entre protocoles compatibles afin de limiter le nombre total de souris utilisées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La durée des administrations sera réduite au maximum et quand cela sera possible, les molécules seront combinées pour limiter le nombre d'injection. Les volumes injectés seront également toujours réduit au maximum. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés (prise de température, suivi pondéral) et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. Pour les mesures de calorimétrie, les animaux seront toujours habitués à leur environnement avant les enregistrements afin de réduire leur stress au minimum. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. Les animaux entreront en procédure entre 4 et 8 semaines de vie car les procédures doivent être initiées pendant la phase précoce de développement du tissu adipeux. Une procédure durera 6 mois maximum.

1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.