Système endocrinien

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié d'entre elles passant dix-huit mois sous régime gras avant d'être transportées vers un second établissement pour y subir jusqu'à six tests de comportement. Dans le premier site, elles sont pesées sept fois, injectées, gavées, prélevées à trois reprises, mesurées trois fois pour leur masse grasse et isolées quarante-huit heures en cage individuelle. Les tests portent sur l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices et les capacités physiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une avancée potentielle en connaissances et l'identification de cibles pour de futurs médicaments, quand la certitude porte sur dix-huit mois de régime imposé et sur la mise à mort finale pour analyse histologique.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d’évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal (degré modéré). La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux (degré léger). La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux à l'occasion des prélèvements (degré léger à modéré), ou de leur isolement dans certaines procédures (degré léger). La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements (degré léger), ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement (degré léger à modéré). D'autres nuisances sont la douleur à l'injection (degré modéré), lors des prélèvements (degré léger à modéré), ou à l'occasion de certains tests comportementaux (degré léger à modéré).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire (application d’un désinfectant et d’une pommade cicatrisante en cas des blessures superficielles sur la peau) , - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Mises à mort à l'issue de leur période d'analyse pour prélever dépôts adipeux, foie, muscles, pancréas, cœur et reins, 60 souris ne sont réutilisées dans aucune autre cohorte. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : tatouage des phalanges et biopsie d'oreille pour le génotypage, cinq gavages quotidiens pouvant irriter l'œsophage, six injections, sept prélèvements de sang à la queue en état vigile, une chirurgie de trente minutes dont le texte admet qu'elle entraîne rarement la mort, et jusqu'à cinq heures d'hébergement à 6 °C, seules, avec des isolements pouvant durer sept heures. L'objet du projet est de comprendre comment la graisse brune produit de la chaleur, piste envisagée contre l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur écrit disposer de lignées cellulaires qui permettront de remplacer les animaux pour produire des adipocytes bruns modifiés, et affirme dans le même temps que les échanges entre le cœur et les organes métaboliques ne peuvent pas s'étudier en culture.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin.

Bénéfices attendus

Une forte prévalence (ou activité) de tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.

Procédures

Les animaux seront tatoués aux phalanges avec biopsie d’oreille pour génotypage. Ils seront soumis à des gavages une fois par jour pendant une semaine, soit 5 gavages au total (10 secondes/gavage). Ils recevront 6 injections au total (10 secondes/injection) et 7 prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutives. Ils seront aussi soumis à une chirurgie de 30 minutes une fois au cours de leur vie, un hébergements au froid (6°C) de 5 heures maximum et des isolements temporaires (maximum 7 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur et des expositions au froid en cages individuelles avec surveillance de la température corporelle. Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Stress et légère douleur lors du tatouage et biopsie d’oreille. - Inconfort lors des pesées (durée inférieure à 1 minute). - Inconfort et/ou stress lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. - Inconfort et/ou légère douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue. - Inconfort, légères douleurs et rarement la mortalité (inférieure à 10%) lors des chirurgies sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale. - Stress, inconfort et douleur lors des expositions au froid (5 heures) avec isolement, jusqu'à 7 heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation thermique et/ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépôts adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.

Remplacement

Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogenèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.

Réduction

En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 15 animaux contrôles (femelles) et 15 animaux génétiquement modifiés (femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Prenant en compte la plus petite différence biologique interprétable que nous pourrions avoir lors de nos procédures, ainsi que le fait que des études statistiques sont probantes à partir d'un nombre suffisant. Nous avons estimé que pour établir une différence éventuelle entre nos groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus (tenant en compte les non répondeurs éventuels et les pertes possibles lors de la chirurgie), soit 15 femelles contrôles et 15 femelles génétiquement modifiées par cohorte. L'usage de 2 cohortes par procédure est justifié par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuiemains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception des 5 jours post-chirurgie, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La classe de gravité de la procédure utilisée dans ce projet est modérée et n’est pas répertoriée comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Lors de la modification de la température d'hébergment (6°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux.

Choix des espèces

La souris, mammifère proche de l'Homme, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de diverses températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogenèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris débuteront la procédure entre 6 et 10 semaines correspondant au début de l'âge adulte, une période où l'organisme est mature tout en étant encore jeune. À ce stade, la délétion génique est stable, ce qui garantit la fiabilité des analyses phénotypiques et fonctionnelles.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués

Réduction

Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.

Sept jours enfermées seules dans une cage calorimétrique, sans congénères et sans enrichissement : 2 160 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant hormonal sous la peau lors d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, puis des injections deux fois par semaine, une partie recevant en plus un régime gras pendant près de trois mois. Le déséquilibre hormonal ainsi provoqué doit reproduire un syndrome ovarien chronique et entraîne, selon le texte, prise de poids, résistance à l'insuline, anxiété accrue et agressivité perturbant la cohabitation. Les femelles utilisées ont 5 à 7 semaines, un stade prépubère retenu pour observer l'effet d'une perturbation hormonale prolongée sur le développement ovarien.

Objectifs

Certaines maladies chroniques touchant les ovaires peuvent entraîner des troubles hormonaux importants chez les femmes. Ces affections apparaissent souvent dès l’adolescence et peuvent évoluer au cours de la vie. Elles se manifestent notamment par des irrégularités menstruelles, une production excessive d’hormones masculines, une difficulté à ovuler ou à concevoir un enfant, ainsi que par la formation de petits kystes dans les ovaires. Ces troubles sont parfois associés à une prise de poids, à des problèmes de peau (acné), à une pilosité excessive ou à une chute de cheveux. Ils peuvent également augmenter le risque de développer d'autres maladies comme le diabète, l’hypertension ou certains troubles cardiovasculaires. L’origine de ces pathologies reste encore mal comprise, bien que des facteurs génétiques et liés au mode de vie soient probablement impliqués. Ces maladies peuvent aussi avoir un impact psychologique important, notamment en raison de l’infertilité ou de la modification de l’apparence physique. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à l’apparition et au maintien de ces troubles, afin d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, qui présente des caractéristiques proches de celles observées dans ces maladies. Nous testerons si l’activation ou la régulation de certains processus biologiques naturels permet de limiter les manifestations les plus marquantes de la maladie. L’objectif est d’identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes concernées, en agissant à la source des déséquilibres hormonaux et métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider, au sein de plusieurs modèles expérimentaux, une nouvelle approche thérapeutique ciblant les déséquilibres biologiques impliqués dans une maladie hormonale chronique des ovaires. Cette affection fréquente chez les femmes en âge de procréer est souvent sous-diagnostiquée. Elle constitue l’une des principales causes de troubles de la fertilité, et elle s’accompagne fréquemment de complications métaboliques, cardiovasculaires et psychologiques, ayant un impact significatif sur la santé globale et la qualité de vie des personnes concernées. Le développement d’un traitement capable de corriger les dérèglements hormonaux et métaboliques associés à cette pathologie pourrait contribuer à améliorer la fonction reproductive, à prévenir les complications à long terme, et à limiter l’apparition de maladies associées. En améliorant la prise en charge globale, cette approche permettrait aussi de réduire les coûts médicaux et sociaux liés à ces troubles. À terme, cette stratégie pourrait déboucher sur des solutions thérapeutiques innovantes et mieux tolérées, destinées à améliorer durablement la santé des patientes.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 30 minutes), précédée et suivie d’une analgésie. Certaines souris recevront un régime alimentaire riche en graisses jusqu’à la fin de la procédure (durée du régime : 80 et 87 jours). Elles recevront des injections sur animaux vigiles, deux fois par semaine (quelques secondes). Certaines souris recevront également 4 à 5 injections d’une molécule supplémentaire (quelques secondes) sur animaux vigiles en 1 semaines ou en 4 semaines. La composition corporelle sera mesurée deux fois par une méthode non invasive, sans anesthésie (durée inférieure à 2 minutes). Elles seront également hébergées individuellement en cage (durée 7 jours) pour permettre de mesurer en continu des paramètres physiologiques tels que la consommation d’oxygène, la production de dioxyde de carbone, l’activité locomotrice.

Impact sur les animaux

Les souris recevront un implant hormonal sous-cutané destiné à reproduire les déséquilibres endocriniens caractéristiques de certaines maladies chroniques des ovaires. Cette intervention chirurgicale peut entraîner une réaction inflammatoire locale et un inconfort transitoire au site d’implantation. L’anesthésie générale utilisée peut provoquer une hypothermie, une dépression respiratoire, voire des troubles du réveil. Une mauvaise cicatrisation de la plaie, une dessiccation des tissus ou une gêne post-opératoire peuvent également survenir. Le déséquilibre hormonal induit peut entraîner une prise de poids, une résistance à l’insuline, des troubles glycémiques, une baisse de l’activité physique, une sécheresse cutanée, une modification du pelage, une anxiété accrue, ainsi qu’une augmentation de l’agressivité pouvant perturber la cohabitation des animaux. Une altération du comportement exploratoire est également observée dans certains cas. Certaines souris recevront des injections intrapéritonéales répétées, ce qui peut générer un stress lié à la contention, une douleur transitoire au point d’injection, ainsi qu’un risque d’irritation locale ou d’adhérences. Des infections, bien que rares, peuvent survenir aux sites d’injection ou de prélèvement. Les animaux seront également placés, pendant une semaine, en hébergement individuel dans des cages calorimétriques. Ce dispositif, indispensable à la mesure de paramètres métaboliques individuels, impose l’absence temporaire de cohabitation et d’enrichissement, ce qui peut induire un stress social et sensoriel. Le passage en cage calorimétrique ainsi que la manipulation répétée des animaux au cours du protocole peuvent également constituer des facteurs de stress supplémentaires.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Le laboratoire réalise un grand nombre d’expérimentations pour lesquelles les animaux ont été remplacés par des méthodes alternatives. Ces approches incluent notamment l’utilisation de modèles in vitro et d’outils in silico, utilisés dans les phases exploratoires pour limiter le recours aux animaux. Cependant, l’avancée du projet nécessite la mise en place d’expériences, justifiées, qui impliquent de l’expérimentation animale. L’étude des déséquilibres hormonaux et métaboliques liés aux maladies chroniques des ovaires implique des interactions complexes entre systèmes endocrinien, ovarien, nerveux et immunitaire, qui ne peuvent être fidèlement reproduites dans des systèmes alternatifs. Aucun modèle in vitro ou in silico ne permet actuellement d’évaluer l’impact d’une modulation hormonale prolongée sur l’ensemble des fonctions métaboliques, comportementales et reproductives. Le modèle animal reste donc indispensable pour valider les effets des interventions thérapeutiques dans un organisme entier, dans des conditions mimant au plus près la physiopathologie humaine.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2160 souris. Afin de limiter le nombre d’animaux témoins, les expérimentations seront regroupées autant que possible. Plusieurs tissus seront prélevés et analysés par différentes approches biologiques afin d’exploiter pleinement les données obtenues. Ces échantillons seront également partagés avec des collaborateurs, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux nécessaires. La taille des effectifs a été déterminée à l’aide d’un calcul de puissance, permettant d’utiliser le nombre minimal d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Des analyses statistiques seront effectuées pour interpréter correctement les effets observés et garantir la robustesse des conclusions.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur et seront optimisées en collaboration avec le personnel de l’animalerie afin d’assurer le bien-être des animaux. Les souris auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum, et leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification pour favoriser leur confort et leur comportement naturel. Une surveillance rigoureuse et régulière sera mise en place pour identifier rapidement tout signe de mal-être, tel que des yeux mi-clos, une réduction de l’activité ou des comportements anormaux, permettant ainsi une intervention précoce si nécessaire. Des points limites spécifiques à chaque type d’expérience seront définis afin de minimiser toute douleur ou souffrance. Une perte de poids significative, une altération marquée de l’état général ou l’apparition de signes cliniques sévères (difficultés respiratoires, prostration) entraîneront une évaluation immédiate et, si nécessaire, l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. Les réactions au site d’implantation et aux injections seront surveillées régulièrement afin de détecter précocement toute inflammation, infection ou complication locale. Des interventions seront prévues en cas de nécessité, incluant l’application d’antiseptiques ou l’administration d’analgésiques adaptés aux animaux présentant des signes de douleur. En cas de difficulté d’alimentation, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage pour garantir un apport nutritionnel suffisant. L’ensemble du personnel impliqué dans ce projet est spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale et suit une formation continue afin d’assurer des manipulations sécurisées et respectueuses du bien-être animal. Toutes les interventions seront réalisées dans le strict souci de réduire l’inconfort des animaux, notamment grâce à l’utilisation d’anesthésie et d’analgésie adaptées ainsi que de lampes chauffantes pour limiter l’hypothermie post-anesthésique. Les femelles présentant des signes d’agressivité liés à l’hyperandrogénie seront placées en hébergement individuel pour éviter les blessures et le stress liés aux interactions sociales conflictuelles. Si nécessaire, des ajustements en temps réel seront apportés aux conditions d’hébergement et aux protocoles expérimentaux afin d’améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la rigueur scientifique du projet.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur des considérations scientifiques et méthodologiques. La souris est un modèle bien établi, bénéficiant d’une expertise approfondie en élevage, en techniques expérimentales et en suivi vétérinaire. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques et pratiques. Il s’agit d’un modèle largement utilisé, pour lequel les connaissances en matière de manipulation, d’élevage et de suivi vétérinaire sont bien établies. Ce modèle permet de reproduire de manière fiable les manifestations cliniques observées dans certaines pathologies humaines, notamment en ce qui concerne les déséquilibres hormonaux, les troubles métaboliques et comportementaux. Les animaux utilisés dans ce projet présentent des caractéristiques compatibles avec l’étude des effets d’un déséquilibre hormonal prolongé. Ils sont viables, fertiles et ne présentent pas d’anomalies phénotypiques connues. Les expérimentations seront réalisées chez des femelles âgées de 5 à 7 semaines, correspondant à une période prépubère. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour étudier l’impact des perturbations hormonales sur le développement ovarien et les fonctions métaboliques à long terme.

Tuées à la fin du protocole pour des analyses post-mortem, ou réutilisées dans un autre projet pour 65 d'entre elles, 390 souris sont soumises à un régime gras dès l'âge de quatre semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 28 jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, des gavages, sept prélèvements de sang en deux heures par une incision de la queue, et trois minutes de contention dans un tube d'imagerie. Le porteur indique que le régime gras prolongé peut altérer leur mobilité et créer un état dépressif et de l'anxiété, et prévoit que les souris écartées du protocole après le régime soient utilisées pour l'enseignement ou des mises au point techniques.

Objectifs

Afin d’améliorer la quantité trop importante de sucre dans le sang, chez le diabétique de type 2, plusieurs approches médicamenteuses sont possibles. Parmi elles, il existe une famille de molécules proches d’hormones naturellement produites par l’intestin. A l’heure actuelle, les médicaments de cette famille sont nombreux sur le marché, mais ne cible généralement qu’un seul site d’action. La molécule de cette étude est la première capable de cibler deux sites à la fois, lui conférant ainsi un potentiel thérapeutique plus important que les médicaments actuellement le marché. L’avantage d’avoir deux cibles réside dans le fait que des mécanismes d’action différents et complémentaires pourraient exister et donc permettre une efficacité supérieure. L’étude de l’action de ce type de médicament a mis en lumière le fait qu’en plus d’améliorer le diabète, elles étaient capables d’améliorer le métabolisme des graisses, souvent perturbé chez le diabétique. En effet, l’accumulation de graisses dans le foie, est un phénomène courant chez le diabétique et a des effets délétères sur l’organe mais aussi sur le diabète en général. Le but de ce projet est d’identifier comment la molécule étudiée dans ce projet ciblant deux sites améliore le métabolisme à la fois du sucre et des graisses chez un modèle de souris obèse/diabétique et en particulier d’identifier quels sont les mécanismes d’action permettant ces améliorations au niveau du foie en essayant de discriminer l’implication de l’un ou l’autre site d’action. Pour permettre la mesure des paramètres pertinents pour cette étude, ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un site d’action et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi les effets. Les études préliminaires sur les effets de la molécule de cette étude semblent montrer une efficacité accrue en raison de sa capacité à cibler simultanément les deux sites d’action. L’intérêt d’un tel ciblage est que l’activation des deux sites entraîne des effets différents et complémentaires. Là où deux molécules étaient nécessaires, avec la molécule de notre étude une seule serait suffisante. De plus, d’un point de vue « pratique », les études montrent qu’une prise hebdomadaire chez l’Homme est suffisante pour permettre d’avoir les effets escomptés. Néanmoins, certains effets bénéfiques en relation avec le métabolisme lipidique et notamment avec un site d’action particulier restent à déterminer En résumé, le développement et la compréhension du mécanisme de la molécule de cette étude devrait permettre de contrôler plus efficacement le diabète de type 2 et d’apporter un confort au patient par l’administration d’une prise hebdomadaire unique de la molécule.

Procédures

Pour les tests nécessitant un gavage, les animaux vigils recevront un bolus unique par gavage. Cette manipulation prendra une dizaine de secondes. Pour chaque test nécessitant des mesures sur le sang, un prélèvement de sang se fera sur animaux vigiles et consistera : - en un prélèvement unique de 100 µl sur 2 minutes à J-4. - ou de 7 prélèvements de 30 secondes sur 2h à J+25 ou J+27 selon le test utilisée Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par injection dans la partie abdominale sur les animaux vigils, qui auront été habitués à leur manipulateur. Cette intervention prend moins de 10 secondes par animal. En ce qui concerne l’imagerie, les souris, vigiles, seront insérés dans un tube permettant la contention et la mesure indolore durera 3 minutes. Toutes les interventions citées ici exceptée la dernière se tiendront dans l’EU1, La technique d’imagerie se tiendra dans l’EU2.

Impact sur les animaux

En plus d’une perturbation du métabolisme, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer la capacité des animaux à se Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Les gavages nécessitent la contention de la souris, celui-ci peut provoquer un stress. De plus le gavage peut provoquer une fausse route. Les prélèvements de sang au cours des différents test de tolérance (glucose, insuline et lipides) nécessitent une petite incision à la queue qui peut provoquer une douleur légère et passagère. L’imagerie se fera par insertion de la souris dans un tunnel sombre qui permet la mesure. Cet environnement étroit et nouveau, peut entraîner un stress durant la mesure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux. Les animaux qui ne seront pas entrés dans le protocole de traitement, suite au régime serviront pour l’enseignement ou des mises au point techniques.

Remplacement

L’obésité et le diabète de type 2 sont des maladies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du sucre dans le sang, ce qui a des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences de cette pathologie, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. Par ailleurs l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, issus des animaux obèses diabétiques nous permettra de mieux comprendre l’impact direct des traitements sur les différents organes et évitera l’utilisation d’un certain nombre d’animaux supplémentaires pour les études in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de tester beaucoup de doses, ni de multiplier les temps de traitements pour ce type de molécule. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante. En ce qui concerne le travail in vitro nous avons essayé d’optimiser le nombre pour permettre de travailler sur l’ensemble des tissus d’intérêts aux différentes doses et temps escomptés. Grâce à notre expérience de ce type de traitement et au nombre important d’animaux issu de la partie préliminaire (suite au régime et avant la division en groupe pour le traitement), nous pourrons limiter les tests à une partie seulement des souris : petit nombre d’animaux pour avoir des résultats significatifs. Notre expérience dans ces techniques in vitro nous permet de rationaliser ce nombre pour ne pas multiplier les conditions expérimentales.

Raffinement

Par expérience, nous appliquerons des conditions optimales à l’obtention du modèle en permettant de maintenir le bien-être nécessaire. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). De plus, les animaux auront à disposition dans les cages des objets permettant l’enrichissement nécessaire : des tunnels en plastique permettront de diminuer le stress et de réduire l’ennui en stimulant l’activité et permettant un sentiment de sécurité. De plus de la « frisette »de carton, permettra aux animaux de créer un nid et de s’y réfugier, renforçant le bien-être et ce sentiment de sécurité. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Une partie de la nourriture pourra directement être placée dans la cage pour permettre aux souris obèses ayant des problèmes de mobilité d’avoir accès à la nourriture plus facilement. Les tunnels d’enrichissement seront aussi placés à proximité de la nourriture et l’eau pour permettre aux souris de monter sur ces objets et de leur donner un accès plus facile. Pour ce qui est de l’anesthésie, nous utiliserons un anesthésique chimique lors des procédures 2, 3 et 4 qui se tiendront dans l’EU 1 et un gaz anesthésiant lors de la procédure 1 qui se tiendra dans l’EU 2. Pour le transport des animaux entre les deux EU (fin de procédure 1), les souris seront mises dans une cage contenant du coton avec un couvercle filtrant et transportées dans l’EU2 qui se trouve en face du lieu où les souris sont hébergées (EU1). Le temps de trajet estimé est de moins de 5 minutes. Au cours de ce transport, les cages seront mises dans un sac noir afin de préserver les souris de l’environnement extérieur en termes de température et de stress. Nous veillerons aussi au points limites du projet engendré par le diabète de type 2 qui consiste principalement en une déshydratation, en veillant à réhydrater ces derniers en cas de besoin. Enfin, en ce qui concerne les traitements et prélèvements, le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaires au bon déroulement du prélèvement de sang servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des injections intrapéritonéales. Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie est le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Les animaux utilisés seront des jeunes males de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifient par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Par conséquent, les traitements qui auront lieu par la suite seront réalisés sur ces mêmes souris devenus adultes (20 semaines)

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.

Objectifs

Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.

Procédures

Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.

Remplacement

L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.