Système endocrinien
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?tude de l?effet d?une hypothyro?die en p?riode postnatale sur la prolif?ration et maturation du microbiote chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1595 souris pour une question sur le microbiote intestinal, dont 280 portées entières retirées à leur mère dès la naissance et confiées à des femelles rendues hypothyroïdiennes par un régime pauvre en iode. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes les souris seront tuées pour un prélèvement de sang et d'organes. Cinq cent vingt d'entre elles sont anesthésiées au gaz chaque semaine pour être mesurées, et pesées trois fois par semaine, quarante subissant en plus un prélèvement de fèces à l'anus. Le porteur écrit qu'une mère de substitution qui ne prend pas la portée en charge expose les souriceaux à la dénutrition et à l'hypothermie, et que ceux dont l'estomac apparaît vide de lait par transparence sont mis à mort.
Objectifs
Chez l'homme 10% des grossesses s'accompagnent d'hypothyro?die. Si cette derni?re n'est pas corrig?e chez le nouveau n?, elle s'accompagne de d?fauts d?veloppementaux irr?versibles. Comme chez la souris, la p?riode postnatale constitue une fen?tre critique du d?veloppement au cours de laquelle les organes acqui?rent leur maturit? fonctionnelle et s?ajustent aux signaux environnementaux. Dans le m?me temps, le microbiote intestinal se d?veloppe et est n?cessaire ? une croissance optimale. Cette p?riode est donc d?terminante pour l??tablissement des interactions h?te-microbiote. Chez la souris aussi les HT sont cruciales dans cette fen?tre d?veloppementale: en absence d?HT, les souriceaux n?atteignent pas le sevrage. Bien que la signalisation thyro?dienne et la maturation du microbiote soient toutes deux n?cessaires au bon d?roulement de cette p?riode critique, le r?le des HT dans le recrutement du microbiote n'a pas ?t? ?tudi?. Pourtant des donn?es laissent ? penser que cela pourrait ?tre le cas. Chez l'adulte les HT r?gulent la synth?se h?patique des acides biliaires . L?augmentation h?patique d?HT, observ?e d?s trois jours apr?s la naissance, pourrait initier la production d?acides biliaires, acteurs majeurs de la maturation du microbiote intestinal, sugg?rant un r?le des HT sur la maturation du microbiote au cours du d?veloppement. Le but de ce projet est d?explorer si les HT participent ? la maturation du microbiote intestinal pendant la p?riode postnatale chez la souris et si oui comment. La mise en ?vidence d?un dialogue inter-organes (foie-intestin) et inter-r?gnes (microbiote-h?te), pendant la p?riode postnatale permettrait de mieux comprendre les m?canismes impliqu?s dans l?adaptation pr?coce de l?organisme ? son environnement, d?terminante pour permettre le sevrage et la sant? ? l??ge adulte. Vues les similitudes qu'il existe entre les effets d?veloppementaux des HT et le recrutement du microbiote entre homme et souris , les r?sultats obtenus nous ?claireraient sur le r?le des HT dans la maturation du microbiote chez l'homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de d?terminer si et comment les hormones thyro?diennes, un signal hormonal crucial pour le d?veloppement postnatal de l'h?te participent ? la prolif?ration et ? la diversification du microbiote. En effet hormones thyro?diennes et microbiote sont tous deux n?cessaires ? une croissance normale et une maturation de nombreux organes de l?h?te, cependant aucune ?tude n?a pour l?instant interrog? une potentielle interaction entre les deux. S?il existe un effet, nous ?valuerons s?il peut ?tre corrig? en restaurant des concentrations d?hormones thyro?diennes normales. Ces connaissances contribueront ? am?liorer notre compr?hension de la mise en place des communications h?te-microbiote, qui sont n?cessaires non seulement ? la bonne sant? de l?h?te adulte, mais aussi ? son bon d?veloppement postnatal . Si nos hypoth?ses sont confirm?es chez la souris, nos r?sultats permettraient d'envisager l'utilisation de probiotiques en cas d'hypothyro?die chez l'homme ? la naissance, en attendant de stabiliser les niveaux d'hormones thyro?diennes, pour limiter les d?fauts de d?veloppement postnatal pr?coce.
Procédures
1595 animaux seront utilis?s dans le projet, ils seront vigiles sauf indication contraire. 35 femelles gestantes seront nourries pendant les deux derniers tiers de leur gestation avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d?hormone thyro?dienne entra?nant une ? hypothyro?die ?. D?autres recevront un r?gime contr?le. A la naissance, des port?es (280) de m?res contr?les seront donn?es ? adopter ? des m?res hypothyro?diennes. Les m?res hypothyro?diennes et leurs petits adopt?s sont maintenus sous leur r?gime sp?cial au maximum un mois apr?s la naissance. Toutes les souris (520) seront mesur?es chaque semaine sous anesth?sie g?n?rale gazeuse (3 minutes) puis pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Certaine de ces souris (40) seront aussi contentionn?es (< 1 min) pour pr?l?vement de f?ces ? l?anus, 1 fois par semaine. En parall?me des souris portant des modifications g?n?tiques (960) sont n?es et ?lev?es par des m?res nourris avec un r?gime contr?le et seront seulement pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Pour l?ensemble des animaux n?s (1480) au cours de ces exp?riences un pr?l?vement sanguin est effectu? au moment de la mise ? mort. Pour les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour r?aliser ce pr?l?vement sans douleur.
Impact sur les animaux
En cas d??chec d?adoption les petits risquent d??tre d?nutris et en hypothermie . L?g?res douleurs li?es ? diff?rents types d?injection en sous cutan?es et dans l?abdomen (analg?sique) anesth?sique) L?gers inconforts li?s ? la manipulation/contention lors des pes?es et du pr?l?vement de f?ces. L?hypothyro?die chez le nouveau-n? entraine une absence de prise de poids Aucun ph?notype dommageable n?est pr?visible pour les deux nouveaux g?notypes . En tout ?tat de cause, les petits portants ces mutations sont observ?s tous les jours du lundi au vendredi et pes?s trois fois par semaine d?s leur naissance comme il est pr?conis? de le faire pour une nouvelle mutation. Toute souffrance pourra ?tre mise en ?vidence, et les animaux mis ? mort si n?cessaires.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en proc?dure seront mis ? mort en vue du pr?l?vement de sang et des organes d'int?r?t.
Remplacement
Cette ?tude implique des interactions r?ciproques entre un organisme et les microbes pr?sents dans son intestin. Elle s?int?resse aussi ? la perturbation de la communication entre plusieurs organes induite par des changements hormonaux. Aucun mod?le in vitro ne permet de reproduire cette complexit?. C'est pourquoi cette ?tude n?cessite l'exp?rimentation animale.
Réduction
Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum tout en garantissant la robustesse statistique des r?sultats. Trois types d?exp?riences sont pr?vus et seront r?alis?s de fa?on s?quentielle. Si le premier type r?alis? ne montrent pas un effet des hormones thyro?diennes sur le recrutement et la maturation du microbiote ou sur la production d?acide biliaire, les autres exp?riences n?auront pas lieu d??tre. Si ces exp?riences sont r?alis?es nous r?duirons le nombre de conditions au minimum en n?incluant que les temps pour lesquels un effet a ?t? observ?. Afin de limiter le nombre d?animaux ? utiliser dans de futures exp?riences, tous les organes d?int?r?t potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront pr?lev?s ? la fin des protocoles et conserv?s au cong?lateur pour d??ventuelles analyses ult?rieures.
Raffinement
Apr?s l?adoption les animaux sont surveill?s quotidiennement, si les petits ne sont pas pris en charge (absence de lait dans l?estomac, visible par transparence) ils seront mis ? mort. La croissance en taille sera mesur?e individuellement chaque semaine, le poids trois fois par semaine et les animaux seront suivis quotidiennement du lundi au vendredi. Ces fr?quences permettront de d?tecter tout effet dommageable des nouvelles mutations. Des points limites pr?dictifs seront d?finis ? l?avance, et leur atteinte entra?nera la mise ? mort imm?diate des individus concern?s afin de pr?venir toute souffrance prolong?e. Aucune exp?rience autre que la manipulation des souris lors des exp?riences de pes?e, de mesure de la taille, et de la collection de f?ces n?est pr?vue. Pour la mesure de la taille, une anesth?sie gazeuse l?g?re de courte dur?e permettra d??viter la contention et de diminuer le temps n?cessaire ? la mesure. Pour le pr?l?vement terminal de sang des les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour qu'il soit sans sans douleur. La profondeur d?anesth?sie sera v?rifi?e. Toutes les mesures visent ? limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des donn?es.
Choix des espèces
La souris sera utilis?e car il s'agit d'un bon mod?le pour ?tudier l?effet des hormones thyro?diennes sur la croissance, les effets sont similaires chez l?homme, seule la temporalit? diff?re. La souris a aussi ?t? largement utilis?e pour ?tudier le microbiote. Enfin il existe des lign?es g?n?tiquement modifi?es permettant d?intervenir de fa?on cibl?e dans un contexte physiologique, en particulier sur la signalisation thyro?dienne, pour avoir acc?s ? des donn?es m?canistiques. Les animaux utilis?s seront des animaux ?g?s de 7 ? 28 jours. L'objectif du projet est d'?tudier les effets de la signalisation thyro?dienne, ? partir du moment o? elle se met en place et temps qu?elle reste tr?s ?lev?e (21 ? 28 jours) sur le recrutement et la diversification du microbiote qui s?effectue dans le m?me temps. Microbiote et signalisation thyro?dienne sont critiques pendant cette p?riode postnatale pour permettre les transformations n?cessaires au sevrage.
Organisation et plasticité du microenvironnement hypothalamique : contribution de la matrice extracellulaire, des tanycytes et des signalisations neuro-immunes au contrôle des fonctions métaboliques et reproductives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
14 038 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à quatre heures d'anesthésie pour une chirurgie crânienne, une ablation des ovaires ou des testicules de quinze à vingt minutes, des prélèvements sanguins répétés et douze semaines de régime gras ou sucré. Les protocoles s'étalent de deux à soixante-douze semaines, avec des jeûnes allant jusqu'à seize heures et des isolements de deux semaines répétés deux fois, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. L'objet déclaré porte sur la communication entre l'hypothalamus, les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, avec un espoir formulé au conditionnel d'améliorer des traitements de l'obésité. Le porteur justifie la mise à mort de toutes par "la nécessité de récupérer les organes et tissus à l'issue des expériences".
Objectifs
Le fonctionnement de l’organisme repose sur une communication constante entre le cerveau et les organes périphériques. Ce dialogue permet de réguler des fonctions essentielles telles que l’équilibre énergétique, qui contrôle la prise alimentaire et la dépense d’énergie, ainsi que la reproduction. Une partie clé de cette régulation se déroule dans l’hypothalamus, une région du cerveau spécialisée dans l’intégration des signaux provenant du reste du corps. Au sein de l’hypothalamus, le noyau arqué joue un rôle central. Cette structure reçoit en permanence des informations issues de la circulation sanguine, notamment sous forme d’hormones, qui renseignent sur l’état physiologique de l’organisme. Ces signaux doivent ensuite être transmis aux neurones pour déclencher des réponses adaptées. Plusieurs types de cellules participent à cette communication. Les cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins, régulent le passage des molécules depuis le sang vers le tissu cérébral. Les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), localisés à l’interface entre le cerveau et le liquide cérébrospinal, contribuent également au transfert et à la distribution de ces signaux. En parallèle, l’environnement extracellulaire, c’est-à-dire l’espace situé entre les cellules, constitue un milieu de diffusion essentiel pour les molécules avant qu’elles n’atteignent leurs cibles neuronales. L’ensemble de ces éléments forme un système dynamique dans lequel les interactions cellulaires et moléculaires permettent d’assurer une communication fine entre la périphérie et le cerveau. Certaines composantes de cet environnement, comme la matrice extracellulaire, pourraient jouer un rôle actif dans la distribution et l’efficacité des signaux. De plus, des échanges étroits entre les tanycytes et les cellules vasculaires semblent contribuer à coordonner le passage de l’information. Enfin, des liens existent entre ces mécanismes de régulation et le système immunitaire, suggérant que cette région du cerveau est également sensible aux signaux liés à l’inflammation ou à l’état immunitaire de l’organisme. Mieux comprendre ces interactions représente un enjeu important pour décrypter les mécanismes qui contrôlent les grandes fonctions physiologiques et leurs dérèglements.
Bénéfices attendus
L’hypothalamus médio-basal est une petite région du cerveau qui joue un rôle essentiel dans la régulation de fonctions vitales comme le métabolisme (équilibre énergétique et pondéral) et la reproduction. Ce projet de recherche s’intéresse à l’environnement qui entoure les cellules de cette région cérébrale, ainsi qu’aux échanges entre différents types de cellules, notamment les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), les vaisseaux sanguins et le système immunitaire. L’un des objectifs est de mieux comprendre le rôle de la matrice extracellulaire, c’est-à-dire le réseau de molécules qui entoure les cellules. Cette structure pourrait influencer la manière dont le cerveau répond à certaines hormones impliquées dans le métabolisme, y compris celles utilisées actuellement pour traiter l’obésité. En améliorant ces connaissances, il serait possible d’optimiser les traitements existants ou de développer de nouvelles approches pour lutter contre les maladies métaboliques qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Le projet cherche également à identifier de nouveaux mécanismes de communication entre les tanycytes et les vaisseaux sanguins. Ces interactions sont importantes pour maintenir des barrières protectrices entre le sang et le cerveau. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait permettre, à terme, de contrôler temporairement ces barrières afin de faciliter l’entrée de médicaments dans le cerveau, ce qui constitue aujourd’hui un défi important pour de nombreuses thérapies. Enfin, cette étude vise à identifier pour la première fois les cellules immunitaires présentes dans cette région du cerveau et à comprendre leur rôle potentiel dans la régulation du métabolisme et de la reproduction. Jusqu’à présent, ces cellules ont été peu étudiées dans ce contexte. Elles pourraient pourtant représenter de nouvelles cibles pour développer des traitements innovants.
Procédures
Selon les procédures, des traitements pourront être administrés de différentes manières : par voie orale (1min), par injection (1min) ou via un implant sous cutané (durée maximale 20 minutes) selon les volumes et fréquences maximales recommandées pour le bien être de l’animal et dans le respect de la réglementation en vigueur. Dans certains groupes, après une anesthésie par voie gazeuse ou par injection, des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’administrer des traitements par injection au niveau du cerveau (durée anesthésie : 1h, intervention : 30 à 45 min) ou de mettre en place des dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (durée intervention/anesthésie : 2 à 4h). Afin d’étudier les fonctions reproductrices, des ablations des ovaires ou des testicules pourront être réalisées (Durée intervention : 15-20 min. Durée anesthésie maximum 1h). Afin d’étudier les effets des différents traitements sur les animaux, certains groupes pourront : - Subir des prélèvements sanguins unique ou répétés (5 à 20 minutes) - Être isolés physiquement de leurs congénères (pas d’isolement olfactif ou visuel) (maximum 2 semaines, répété 2 fois) - Subir des traitements complémentaires par injection (1 min) - Être pesés plusieurs fois par semaine (1min) Les animaux impliqués dans l’études du métabolisme pourront avoir un régime alimentaire modifié, tel que des régimes riches en graisses ou en sucre (durée maximale 12 semaines), ou une mise à jeun (durée maximale 16h). La prise en charge de la douleur impliquera également des injections d’anti-douleur (1min). Les animaux seront suivis pendant 2 à 72 semaines en fonction des protocoles avec des temps d’acclimatation et de récupération suffisants entre chaque intervention.
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie, d’injections ou de prélèvements de sang peuvent provoquer des douleurs à court-terme qui seront limitées par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure si nécessaire. Afin d’évaluer l’impact du métabolisme ou des rythmes naturels, il sera parfois nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant deux semaines (pour l’analyse en cages métaboliques par exemple). Cet isolement reste limité puisque les animaux seront maintenus dans des cages transparentes adjacentes, permettant un contact visuel entre congénères.
Devenir
La nécessité de récupérer les organes et tissus à l’issue des expériences implique la mise à mort de l’ensemble des animaux de ce projet
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous privilégions des approches sur cellules et réalisées par ordinateur pour atteindre les trois objectifs de ce projet. Ces méthodes incluent : 1) l’analyse des interactions matrice/récepteur par modélisation informatique, 2) l’étude des voies de signalisation cellulaire et 3) la culture en laboratoire de cellules spécifiques. Cependant, pour obtenir une compréhension globale et intégrée de l’hypothalamus médio-basal et de ses mécanismes physiopathologiques, l’approche animale reste indispensable. En effet, les modèles n’utilisant pas d’animaux présentent des limites majeures : 1) Ils ne permettent pas d’étudier les interactions dynamiques entre les cellules et leur matrice extracellulaire, essentielles pour comprendre la plasticité tissulaire, 2) Ils ne reproduisent pas les dialogues complexes entre les cellules spécialisées et les vaisseaux sanguins, cruciaux pour le contrôle de la perméabilité de la barrière entre les vaisseaux et le cerveau, 3) Ils ne capturent pas les interactions entre les cellules immunitaires et le système neuroendocrine, qui jouent un rôle clé dans la régulation métabolique et reproductive. Seule l’approche animale permet d’appréhender ces processus dans leur ensemble, en tenant compte de la complexité des réseaux neuronaux, vasculaires et endocriniens qui régissent cette région cérébrale, essentielle au contrôle du métabolisme et de la reproduction.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour extraire un maximum de données de chaque groupe d’animaux, en intégrant des mesures multiples et des suivis longitudinaux. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines parties sont partagées entre les trois objectifs principaux du projet, évitant ainsi une utilisation excessive d’animaux. La taille des groupes a été définie par une analyse de statistique spécifique, fondée sur : 1) les effets biologiques attendus, estimés à partir de nos précédents travaux et 2) les données issues de la littérature pour des modèles similaires.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard et réglementaire d’hébergement. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un enrichissement est ajouté dans la cage pour stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. Les périodes d’isolement sont limitées et justifiées. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement afin de limiter tout stress, angoisse ou douleur. Une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long du projet. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, sera mis à mort.
Choix des espèces
Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à élucider les interactions entre le cerveau et les organes périphériques, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies métaboliques et reproductives, telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé dans ce type de recherche, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. Par ailleurs, la disponibilité de nombreux modèles murins génétiquement modifiés offre la possibilité de concevoir des approches ciblées, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les variations expérimentales. Tous les animaux de ce projet sont utilisés au stade adulte entre 6 semaines et 24 mois selon les objectifs.
Rôle d’un canal exprimé par des cellules du système immunitaire dans la capacité du gras à produire de la chaleur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
688 souris sont hébergées à des températures dérogatoires, 344 pendant 24 heures et 344 pendant sept jours, la moitié d'entre elles seules dans leur cage. 864 subissent en plus un prélèvement sanguin éveillées, dans un ensemble de 1 032 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur graisse brune, l'objectif déclaré étant de savoir si une protéine des macrophages, TRPV4, leur permet de détecter la chaleur produite par ce tissu. Sur le remplacement, le porteur écrit que les cultures cellulaires ne reproduisent pas "les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune", et en conclut que seul le recours à des souris vivantes répond à la question.
Objectifs
Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présentes partout dans notre corps. On les connaît surtout pour leur rôle de « nettoyeurs » : ils éliminent les microbes, les cellules mortes et les déchets. Mais, ils ont aussi des fonctions beaucoup plus spécialisées selon l’endroit où ils se trouvent dans l’organisme. Dans la graisse brune (un type de graisse qui sert à produire de la chaleur et à brûler de l’énergie, surtout quand il fait froid) les macrophages jouent un rôle important. Ils aident à contrôler les nerfs qui activent cette graisse et influencent ainsi la capacité du corps à produire de la chaleur et à gérer son énergie. Cependant, une question reste ouverte : ces macrophages sont-ils capables de détecter eux-mêmes la chaleur produite par la graisse brune ? Des analyses ont montré qu'ils possèdent une protéine appelée TRPV4, connue pour être sensible à la chaleur. Le but de ce projet est donc de comprendre si cette protéine permet aux macrophages de « sentir » la chaleur produite par la graisse brune et d’influencer la capacité du corps à gérer son énergie et à maintenir sa température lorsque l’organisme est exposé au froid.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre des fonctions encore peu connues des macrophages, au-delà de leur rôle habituel de "nettoyeurs". Il aidera aussi à mieux comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement de la graisse et la gestion de l’énergie par le corps. À plus long terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches pour améliorer la santé métabolique et lutter contre certaines maladies comme l’obésité ou le diabète.
Procédures
688 animaux seront hébergés à des températures dérogatoires pendant 24h (344 souris) ou 7 jours (344 souris) dont la moitié sera hébergée individuellement (172 souris pendant 24h et 172 souris pendant 7 jours). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur 864 animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’exposition au froid induit un stress physiologique et une augmentation de la dépense énergétique qui entraîne une hausse de la prise alimentaire. L’isolement social peut induire un stress. Les prises de température peuvent induire un stress léger et un inconfort transitoires. Le prélèvement sanguin provoque une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever la graisse brune dans le but de l’analyser.
Remplacement
Les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre le rôle des macrophages dans la régulation de la production de chaleur par la graisse brune, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune et entre les différents organes.
Réduction
Nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Nos visites quotidiennes permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le rôle des macrophages dans le tissu adipeux et nous disposons déjà du modèle de souris permettant d’enlever TRPV4 dans les macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Il s’agit donc de l’espèce la plus appropriée pour ce projet. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).
Evaluation pharmacologique, comportementale et métabolique de modulateurs du métabolisme énergétique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Injectées une fois par jour pendant dix jours, contenues à chaque administration, pesées deux fois par semaine, 6 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite les tests moteurs, poutre, rotarod jusqu'à 40 tours par minute et agrippement, puis l'open field pendant trente minutes et cinq minutes de nage forcée, chacun précédé d'une nouvelle injection. Sept jours d'hébergement individuel en cage calorimétrique, sans enrichissement, closent le protocole avant la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur écrit que le nombre de souris "est réduit à son minimum" et le rattache à la littérature et à sa propre expérience, sans donner de calcul pour ces 6 780 individus.
Objectifs
La perte d’appétit, pouvant aller jusqu’à l’anorexie, est un problème fréquent dans de nombreuses situations de maladie ou après des épisodes de stress physique ou psychologique importants. Elle peut entraîner une perte de poids, une fatigue marquée et une dégradation de l’état général, rendant le rétablissement plus difficile. Ce phénomène constitue aujourd’hui un enjeu important pour la santé. Le projet vise à étudier l’effet de différentes substances capables d’agir sur ces mécanismes biologiques de faim, afin de mieux comprendre comment l’appétit et l’équilibre énergétique peuvent être influencés. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour limiter la perte d’appétit et améliorer l’état nutritionnel dans des situations de maladie sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Il permettra d’identifier et de comparer des substances susceptibles de moduler ces paramètres, et de sélectionner les candidats présentant les profils d’efficacité et de tolérance les plus favorables.
Procédures
Injections (10 max par souris; 1 fois par jour pendant 10 jours; durée
Impact sur les animaux
Administrations (injections et contention quotidienne) : peuvent provoquer une douleur légère au point d’injection et un stress transitoire lié à la manipulation, sans chirurgie ni anesthésie générale. Variations de prise alimentaire induites par les composés : peuvent entraîner des fluctuations du poids corporel (jusqu’à une perte de poids significative) avec possible altération transitoire de l’état général (baisse d’activité, pelage altéré, posture inhabituelle). Tests locomoteurs, moteurs et comportementaux : peuvent induire un stress aigu et transitoire lié à l’environnement nouveau et à l’effort demandé. Calorimétrie indirecte : l’hébergement individuel et l’absence d’enrichissement pendant l’enregistrement peuvent générer une gêne/anxiété transitoire liée à l’isolement.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Pour étudier de manière intégrée la prise alimentaire, le poids corporel, le comportement et le métabolisme énergétique, un modèle souris est indispensable. La souris est le modèle le plus pertinent pour cette étude, car elle présente des similitudes avec la physiologie humaine et constitue une référence largement utilisée dans les travaux sur la régulation métabolique.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et aux bonnes pratiques de l’établissement utilisateur. Ils sont maintenus en cages collectives de même sexe, avec un accès ad libitum à une alimentation standard et à l’eau, en dehors des contraintes strictement nécessaires à certaines procédures expérimentales. L’environnement est systématiquement enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, favorisant l’expression des comportements naturels et contribuant à la réduction du stress. Une période d’acclimatation est respectée avant toute intervention expérimentale. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des procédures, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Les critères surveillés incluent le comportement, l’activité spontanée, l’aspect du pelage, la posture, la mobilité et la respiration. Des points limites précoces et prédictifs, spécifiques à chaque procédure, ont été définis et appliqués de manière stricte afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique, en raison des similitudes fonctionnelles avec la physiologie humaine et de la sensibilité de la souche C57BL/6 aux variations nutritionnelles. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge. À ce stade, ils ont atteint la maturité physiologique et métabolique, garantissant la robustesse des mesures expérimentales et limitant l’impact de la croissance sur l’interprétation des résultats.
Décontamination de lignées de souris génétiquement modifiées/altérées (GM/GA)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
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- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
10 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, pour redériver des lignées génétiquement modifiées vers un statut sanitaire donné. 700 mâles sont vasectomisés par voie scrotale sous anesthésie, 3 000 femelles juvéniles reçoivent deux injections hormonales pour produire un grand nombre d'ovocytes, 2 000 femelles adultes sont opérées pour recevoir des embryons, et 5 000 nouveau-nés sont tatoués aux doigts ou subissent une résection de phalanges en vue du génotypage. Les mâles vasectomisés sont tués à la fin de leur vie de reproducteur, les femelles donneuses au moment du recueil des ovocytes, les receveuses au sevrage des petits. Le devenir déclaré porte 10 880 morts, alors que le résumé écrit que les nouveau-nés porteurs des bons génotypes sont "utilisés ensuite pour le maintien de lignées".
Objectifs
Le recours à l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées ou altérées (GM/GA) dans les projets scientifiques est justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. La redérivation vers le statut sanitaire d’intérêt avant l’entrée en élevage est nécessaire pour répondre aux besoins expérimentaux et pour assurer le maintien des animaux dans des conditions optimales. Les élevages des lignées au statut sanitaire approprié (Exempts d'un certain nombre d'agents Opportunistes et Pathogènes Spécifiques à l’espèce étudiée selon une liste d’exclusion internationale, ou au statut axénique ou « germ-free », en lien avec les thématiques de recherche de l’EU) sont déjà effectués de façon centralisée dans des zones d’élevages dédiées. Le regroupement de ces élevages après redérivation dans une organisation centralisée, gérés par du personnel formé, compétent et affecté à cette mission de façon permanente, dans une zone d’élevage dédiée de très haut statut sanitaire, apporte une solution optimale au bon respect de la règle des 3R, en particulier l’ajustement du nombre d’animaux produits rapporté aux besoins de chaque unité utilisatrice.
Bénéfices attendus
Les lignées murines génétiquement modifiées ou altérées (GM/GA) sont obtenues suite à la modification de leur matériel génétique soit par une technique de manipulation génétique (GM) soit par l’apparition de mutations spontanées (GA), ce qui leur confère une caractéristique nouvelle. Les nouvelles lignées GM/GA importées sont redérivées pour pouvoir être élevées dans les meilleures conditions sanitaires possibles de façon à préserver leur bonne santé. Ceci est encore plus important pour les lignées immunodéficientes à phénotype dommageable (leur élevage post-redérivation est assuré dans le cadre d’un autre projet autorisé). Le bénéfice de ce projet est à rapporter à ceux autorisés de chacune des entités de recherche ayant recours à des lignées murines GM/GA pour leurs projets expérimentaux spécifiques en vue de répondre à une ou plusieurs hypothèses scientifiques dans le domaine de recherche scientifique fondamentale/biomédicale concerné. Ces modèles de souris GM/GA sont indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, vieillissement…) et pathologiques (infections, cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ils sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.
Procédures
Les nuisances prévues sont les suivantes : - 700 mâles adultes seront vasectomisés par voie scrotale, sous anesthésie, à raison de 15-20 min d’intervention chirurgicale/animal en 1 fois ; - 3000 femelles juvéniles recevront 2 injections hormonales à l’état vigile à raison de quelques secondes/animal afin d’obtenir un grand nombre d’oocytes pour la réalisation d’une fécondation in vitro ; - 2000 femelles adultes receveuses seront réimplantées avec des embryons, sous anesthésie, à raison de 15-20 min d’intervention chirurgicale/animal en 1 fois ; - 180 femelles adultes recevront une injection hormonale à J17.5 de gestation, à raison de quelques secondes/animal ; - 5000 nouveau-nés des deux sexes, seront identifiés et prélevés à l’état vigile en vue de génotypage, soit par tatouage au niveau des doigts (quelques secondes) et par prélèvement tissulaire au niveau de l’oreille ou de la queue (quelques secondes) ; soit par un prélèvement tissulaire unique par résection de phalanges (quelques secondes) ; soit à un prélèvement tissulaire au niveau de l’oreille (quelques secondes) et à un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : - l’administration des hormones/médicaments peut induire un stress léger lors de la contention ainsi qu’une courte douleur au point d’injection liée à la piqûre elle-même, - les opérations de chirurgie (vasectomie pour les mâles et transfert embryonnaire pour les femelles) peuvent induire une désorientation et un stress des animaux lors du réveil de l’anesthésie, ainsi qu’une douleur locale post-chirurgie, - la contention et la réalisation de prélèvements en vue de l’identification et du génotypage des animaux, peut induire un stress et une douleur locale brève et transitoire. Les douleurs peuvent être classées en deux types : - légère (équivalente à l’introduction d’une aiguille) pour les injections d’hormones ou lors du tatouage et des biopsies tissulaires ou du prélèvement sanguin pour identification/génotypage, - modérée à la suite de l’opération chirurgicale, avec des douleurs localisées au niveau du scrotum chez les mâles vasectomisés et au niveau du plan musculo-péritonéal chez les femelles réimplantées.
Devenir
L’ensemble des animaux inclus dans chacune des 4 procédures (P1 à P4) sont mis à mort : - à la fin de sa vie de reproducteur pour les mâles vasectomisés (performance au coït en baisse voire absente nécessitant un renouvellement après réforme), - au moment du recueil des ovocytes pour les femelles donneuses, - au moment du sevrage pour les femelles receveuses (une intervention chirurgicale unique sur l’appareil reproducteur) des petits nés issus des lignées murines GM/GA à décontaminer, - au moment du prélèvement d’utérus pour les femelles d’intérêt. Ces animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux de la procédure 5 sont soit mis à mort (animaux ne portant pas les génotypes d‘intérêt) soit utilisés ensuite pour le maintien de lignées (animaux porteurs des bons génotypes).
Remplacement
En amont du projet, les entités de recherche effectuent des analyses préalables de l’existence de méthodes alternatives NAMs (Non-Animal Methods) : culture cellulaires in vitro, organoïdes, organes-on-chip et modélisation computationnelle pour éviter l’utilisation d’animaux. Cependant encore aujourd’hui, seul un organisme intégré (entier) permet d’étudier, de récapituler et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus, l’ensemble des organes et plus largement les différents systèmes physiologiques. Le recours à l’animal est justifié au niveau des projets de recherche des entités souhaitant utiliser les différentes lignées importées.
Réduction
Pour la décontamination, le nombre d’adultes donneurs et de femelles receveuses nécessaires au succès de l’opération varie sensiblement d’une lignée à une autre. Nous procédons toujours par étapes en produisant par fécondation in vitro (FIV), un premier lot d’embryons en attendant de voir les résultats du transfert (nombre de petits nés) avant de produire un second lot. De même lors de redérivation par hystérectomie aseptique nous attendons de voir les résultats d’adoption de la 1ère séance avant de démarrer une seconde séance. Notre expérience a permis de revoir à la baisse le nombre de femelles donneuses d’ovocytes sans compromission des résultats de la FIV. La très grande majorité (90%) des lignées murines qui nous sont confiées sont redérivées après 1 seule session de décontamination. La cryopréservation et l’évaluation systématique depuis fin 2024, de la semence des mâles donneurs de sperme de provenance extérieure permet de qualifier selon des critères précis et définis le mâle et/ou la quantité de sperme à utiliser préférentiellement pour la FIV Le nombre des femelles receveuses est ajusté au plus juste au regard du statut génétique attendu des embryons à réimplanter issus de la FIV. Aussi, des embryons de plusieurs lignées sont réimplantées le même jour pour que les problèmes éventuels avec les embryons d’une lignée soient compensés par les meilleurs résultats obtenus avec une autre et/ou que des embryons de lignées différentes puissent être groupés dans une même femelle. Le marquage et le génotypage précoce sur nouveaux nés permet d’identifier les animaux de façon unique non ambiguë et d’obtenir un bout de tissu, qui servira pour extraire l’ADN de l’animal et l’amplifier ensuite par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L’ensemble est réalisé précocement (7-10j) afin d’avoir les résultats très rapidement et avant le sevrage. Cela permet de ne pas conserver des animaux non utiles et de savoir très vite si un second round de décontamination doit être mis en place ou non.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale gazeuse couplée à une analgésie multimodale permettant de prendre en charge de manière complète la douleur liée à ces actes chirurgicaux. Un fluide réhydratant réchauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin d’opération chirurgicale palliant une éventuelle déshydratation tout en offrant une bonne reprise de l’homéostasie et un réveil rapide de qualité. L’utilisation d’une litière douce avant et après l’intervention particulièrement pour les mâles vasectomisés limite l’inconfort en favorisant la cicatrisation. Les souris opérées sont placées sur un plateau chauffant jusqu’à leur réveil et reçoivent des graines de tournesol disposées au fond de la cage avant stabulation. Les animaux sont évalués pendant les 48h suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien. Il est rarissime d’observer des complications dans ce type de procédures. En cas d’observation d’une souffrance chez un animal post-opératoire qui n’est pas résolue en 48h l’animal est mis à mort. Les mâles vasectomisés une fois cicatrisés sont très rapidement accompagnés par une femelle du même âge durant toute leur vie afin de conserver le caractère grégaire de l’espèce, sans nuire à leur libido tout en vérifiant le maintien de sa stérilité au cours du temps. Nous réalisons pour la vasectomie des mâles une chirurgie scrotale qui est moins invasive, mieux tolérée et permet d’éviter des complications liées à la chirurgie abdominale pratiquée traditionnellement, comme par exemple la péritonite, et par conséquent induisant moins de souffrance. De surcroît, si lors de la procédure de chirurgie en vue de réimplantation d’embryons la femelle receveuse n’est pas en état de pseudo gestation par constatation de l’absence d’ampoule au niveau de l’oviducte, alors nous procéderons à une stérilisation par ovariectomie en lieu et place d’une mise à mort de l’animal. Ainsi, cette femelle pourra jouer le rôle de « femelle accompagnatrice » par ajout dans la cage d’un mâle et éviter un hébergement individuel.
Choix des espèces
La souris en tant que mammifère est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche fondamentale et biomédicale. En effet, le génome des rongeurs de laboratoire à 99% proche de celui de l’humain est facilement modifiable à façon. Grâce à la performance, en perpétuelle évolution, des outils de transgénèse, il existe plusieurs milliers de lignées murines GM/GA qui sont parfaitement caractérisées/définies et présentent de grandes similarités avec les systèmes humains ce qui permet de transposer les découvertes du modèle murin chez l’humain. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques eux-mêmes. - Les mâles donneurs de sperme sont des adultes. - Les femelles donneuses d’ovocytes sont des juvéniles, généralement prépubères répondant mieux au traitement hormonal de la superovulation. - Les mâles vasectomisés, les femelles receveuses et gestantes d’intérêt sont des adultes. - Des jeunes (2 sexes) seront identifiés et génotypés pour sélection des animaux d’intérêt à conserver post-sevrage.
Rôle du système immunitaire dans la progression de la pathologie du foie dans un modèle de souris développant un foie gras
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Une souris qui fait plus de trois hypoglycémies au cours de la procédure est mise à mort. 152 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère, dont 80 rendues malades d'une glycogénose hépatique par cinq injections quotidiennes vers six à huit semaines. À sept jours, un morceau d'oreille d'un millimètre leur est prélevé pour génotypage, puis leur glycémie est suivie par mini-incision de la queue, avec trois à quatre prises de sang mensuelles. Le porteur compte 1 à 2 % de décès par hypoglycémie sévère, survenant en général la nuit. La moitié des souris est tuée pour le prélèvement du foie, du cerveau et des gonades, l'autre pendant une chirurgie de purification des cellules du foie, toutes entre trois et quatre mois après l'induction, avant l'apparition des tumeurs que le projet cherche à comprendre.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire est la forme la plus fréquente de cancer du foie. Dans la majorité des cas, ce cancer apparaît après plusieurs étapes de dégradation du foie : accumulation de graisse dans les cellules hépatiques (stéatose), inflammation chronique, fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) puis cirrhose. En effet, plus de 80 % des cancers du foie se développent sur un foie déjà cirrhotique. Cependant, certaines personnes développent un cancer du foie sans présenter de fibrose ou de cirrhose importantes. Cette situation est observée notamment chez les patients atteints de glycogénose de type 1a, une maladie génétique rare. Chez ces patients, une enzyme essentielle à la production de glucose est absente ou déficiente. L’organisme ne peut donc pas maintenir une glycémie normale pendant le jeûne, ce qui entraîne des hypoglycémies sévères. À long terme, 70 à 80 % des patients adultes développent des tumeurs du foie. Habituellement, l’excès de graisses dans le foie devient toxique pour les cellules hépatiques. Les cellules endommagées déclenchent alors une réaction inflammatoire impliquant différentes cellules immunitaires. Ces cellules produisent des molécules favorisant l’inflammation et la formation de fibrose. Fait surprenant, chez les patients atteints de glycogénose, les marqueurs de l’inflammation sont peu élevés et la fibrose est faible, voire absente, même lorsque des tumeurs sont présentes. Ces observations suggèrent que le cancer du foie se développe par des mécanismes différents de ceux décrits habituellement. L’objectif de ce projet est d’étudier les cellules immunitaires présentes dans le foie de souris modèles de glycogénose et de les comparer à celles de souris rendues obèses/diabétiques et développant une fibrose classique. Grâce à des analyses réalisées à l’échelle de la cellule unique, nous identifierons les populations de cellules du foie impliquées dès les premiers stades de la maladie. Ces travaux pourraient révéler de nouveaux mécanismes d’apparition des tumeurs hépatiques, ouvrant la voie à des stratégies thérapeutiques ciblées pour les patients atteints de glycogénose et, plus largement, pour les maladies métaboliques associées à un risque accru de tumeurs hépatiques.
Bénéfices attendus
À long terme, ce projet vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire et l'apparition de la fibrose dans le développement des maladies du foie et des tumeurs hépatiques. Les chercheurs s'intéressent à deux maladies métaboliques : la glycogénose de type 1, une maladie rare en comparaison avec le diabète associé à l'obésité, maladie considérée comme une épidémie Par cette approche, ils espèrent mieux comprendre comment les cancers du foie apparaissent dans des foies qui accumulent de la graisse (foie stéatosique), avec ou sans fibrose. En général, le cancer du foie se développe sur un foie très abîmé appelé foie cirrhotique. Cependant, des études récentes montrent que certaines tumeurs peuvent aussi apparaître chez des patients diabétiques dont le foie ne présente pas de fibrose importante. Ces travaux pourraient donc aider à identifier les mécanismes responsables de la formation des tumeurs dans différentes situations et, à terme, permettre une prise en charge plus adaptée à chaque patient selon l'évolution de sa maladie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité externe de l’oreille pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Les souris avec une glycogénose peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement ou lors d’anesthésie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Le suivi de leur glycémie pourra nécessiter une microgoutte de sang, prélevée à l’extrémité de la queue après une mini-incision, réalisée en quelques secondes. Les souris développent une stéatose (accumulation de lipides dans le foie) qui peut être associée à des atteintes hépatiques comme une fibrose, la perte de la fonction hépatique caractérisée par l’apparition d’un ictère (coloration jaunâtre des extrémités) ou le développement de tumeurs à plus long terme (>6 mois). Un prélèvement sanguin sera réalisé tous les mois pour suivre la progression de la maladie et durera environ 15 secondes (au total, 3 à 4 prélèvements/souris). Une partie des souris subiront une chirurgie afin de purifier les différentes cellules du foie. La chirurgie durera moins de 15 minutes et les animaux seront mis à mort. La deuxième partie des souris sera mise à jeun pendant 6h, en fin de protocole, avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Les hypoglycémies sévères, en dessous de 30-40 mg/dl, peuvent entrainer un mal-être important, voir un coma ou un décès. Les souris ayant des atteintes hépatiques peuvent présenter des signes de mal-être, généralement associés à une perte de poids. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress. La chirurgie peut entrainer de la douleur qui est réduite par une anesthésie et une analgésie adaptée et un risque d’hémorragie qui est limité par la maitrise de l’hémostase.
Devenir
La moitié des animaux sera mis à mort en fin d’expérimentation afin de prélever des tissus dont le foie, le cerveau et les testicules ou ovaires, pour réaliser des analyses au niveau structurel et moléculaire. La deuxième moitié des animaux subira une chirurgie pour purifier les cellules du foie et quantifier chaque sous-type de cellules immunitaires. Les animaux seront mis à mort pendant la chirurgie.
Remplacement
Aujourd’hui, les chercheurs savent fabriquer en laboratoire de petites versions simplifiées du foie, appelées organoïdes, à partir de plusieurs types de cellules du foie (les cellules qui fabriquent les substances du foie, celles qui transportent la bile, certaines cellules immunitaires du foie, etc.). Cependant, dans la glycogénose, le fonctionnement du foie ne dépend pas seulement de ces cellules locales. Il repose aussi sur des échanges complexes entre les cellules du foie et des cellules immunitaires qui arrivent par le sang. Les chercheurs ont également observé que certains changements observés dans le foie semblent être contrôlés en partie par un système hormonal, qui implique notamment le cerveau et l’hormone de croissance. Pour comprendre correctement tous ces mécanismes, il ne suffit donc pas d’étudier un foie isolé ou un organe fabriqué en laboratoire : il faut utiliser un modèle animal, qui permet de conserver les interactions naturelles entre plusieurs organes. Dans cette étude, plusieurs organes et tissus seront analysés en même temps — une région du cerveau (l’hypothalamus), l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang — afin de comprendre comment l’ensemble de l’organisme participe à la maladie. La souris est le modèle le plus adapté pour plusieurs raisons : -Un métabolisme proche de l’humain -Un modèle unique de la maladie hépatique obtenu par transgenèse : chez la souris atteinte de glycogénose hépatique, la maladie du foie reproduit fidèlement les principales caractéristiques observées chez les patients. Elle résulte d'une surcharge métabolique, un mécanisme également impliqué dans des maladies fréquentes comme le diabète. -Des outils scientifiques robustes : Les chercheurs disposent de nombreuses données et d’outils génétiques pour étudier précisément différents facteurs d’intérêt dans le foie.
Réduction
Pour obtenir des résultats fiables, il faut analyser un nombre suffisant d’échantillons afin de réaliser des analyses statistiques permettant de comparer les différents groupes analysés. Une méthode statistique robuste sera utilisée. La connaissance des modèles animaux et des approches moléculaires utilisées nous a permis de définir un nombre d’animaux minimum par groupe. Comme les souris atteintes de glycogénose ont un risque de décès lié aux possibles hypoglycémies, nous avons prévu d’augmenter le nombre de ces animaux pour ne pas compromettre les analyses statistiques. Les maladies métaboliques (comme le diabète) peuvent se développer différemment chez les mâles et les femelles. Il est donc essentiel d’inclure les deux sexes pour obtenir des résultats complets. Au total, 152 souris (mâles et femelles) seront étudiées, dont 80 souris atteintes de glycogénoses. Les reproductions seront arrêtées dès que ce nombre sera atteint, pour éviter d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. Les griffes des souris pourront être coupées si l’animal se gratte. Tous les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions réglementaires. La maladie est ciblée uniquement dans le foie à l’âge adulte, ce qui permet d’éviter un retard de croissance lié à la glycogénose; les animaux passent la période périnatale sans phénotype dommageable. Le personnel technique est formé à la reconnaissance des signes d’hypoglycémie et à la conduite à tenir. Les risques d’hypoglycémie sont contrôlés en réduisant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes au sol et des tétines des biberons longues). En cas d’hypoglycémie sévère, la souris sera injectée avec une solution de glucose et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. L’animal sera mis à mort s’il développe plus de 3 hypoglycémies au cours de la procédure. Lors des mises à jeun, les souris sont placées dans de grandes cages avec des maisons en plastique pour limiter l’agressivité et le stress. Pour assurer leur confort thermique, une partie des cages est placée sur une plaque chauffante. Grâce à la bonne connaissance de ce modèle animal, des critères précis ont été définis pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront euthanasiées précocement (entre 3 et 4 mois après l’induction de la maladie), avant que la maladie hépatique entraine l’apparition de tumeurs et de signes de mal-être. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté afin de limiter la souffrance de l’animal. La surveillance du bien-être des souris est basée sur le contrôle de leur poids, les taux de marqueurs sanguins d’atteintes hépatiques (transaminases), l’apparition d’un ictère et l’observation de leur comportement ; Des points limites et spécifiques du projet ont été définis.
Choix des espèces
Mus musculus. Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation du métabolisme similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris imite très fidèlement la maladie hépatique associée à la glycogénose, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, les expérimentations seront réalisées à l’âge de 3 à 4 mois, juste avant l’euthanasie des souris.
Caractérisation d’un modèle d’hypertension artérielle induite chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Jusqu'à vingt-quatre séries de mesures de pression artérielle de quinze minutes, six isolements de vingt-quatre heures, douze injections et douze incisions de la queue : 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent une alimentation riche en sel ou une molécule dans l'eau de boisson, en continu pendant quatre à vingt-quatre semaines, pour comprendre comment des mutations génétiques conduisent à une hypertension secondaire. Aucun point limite ni seuil d'arrêt n'est indiqué. Le porteur justifie le choix de la souris par la facilité avec laquelle son génome se manipule et affirme que l'hypertension artérielle est "impossible à analyser sans l'utilisation d'un modèle animal".
Objectifs
L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire majeur qui touche 10 à 45% de la population. Malgré le développement de stratégies thérapeutiques de plus en plus efficaces, le contrôle optimal de la pression artérielle n’est atteint que chez environ un tiers des patients. Ces dernières années des mutations génétiques ont été identifiés comme responsable du développement de forme secondaire d’hypertension artérielle. Afin de mieux prendre en charge ces formes spécifiques d’hypertension, il est nécessaire de comprendre les changements provoqués par ces mutations dans les cellules. L’objectif de ce projet est de comprendre comment ces mutations conduisent au développement d’hypertension secondaire mais aussi d’étudier les conséquences cardiovasculaires et métaboliques associées.
Bénéfices attendus
A terme ce projet permettra de comprendre comment ces mutations sont responsables du développement de certaines formes d’hypertension et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi améliorer la prise en charge de patients.
Procédures
Alimentation riche en sel et/ou eau de boisson contenant une molécule : en continu pendant 4 à 24 semaines – Mesures pression artérielle : 15 min/série de mesures, jusqu’à 24 fois – Echocardiographie sous anesthésie : 5-10 min, 1 fois – Isolement : 24h, 6 fois – Injections : quelques secondes, 12 fois – Incision au niveau de la queue : quelques secondes, 12 fois – prélèvement de sang : 30 secondes, 1 fois
Impact sur les animaux
Il peut exister un inconfort lié à la préhension et à la contention des animaux ; une douleur légère au point d’injection ; un stress lié à l’isolement ; un stress et une hypothermie liés à l’anesthésie
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Des approches dans des modèles de culture ont permis de valider la stratégie qui va être appliquée chez la souris. L’utilisation d’animaux est maintenant indispensable pour comprendre les mécanismes de développement de la pathologie ainsi que pour évaluer les complications cardiométaboliques associées.
Réduction
Le nombre optimal d’animaux a été établi par des tests statistiques. Un suivi longitudinal des animaux pour l’étude de certains paramètres permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation du projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie de la souris. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les périodes d’isolement sont réduites au minimum nécessaire. Une surveillance hebdomadaire sera mise en place et une grille d’évaluation établie afin de permettre une surveillance objective des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel technique qualifié de l’animalerie ou par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes de souffrance ou de mal-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en raison de ses caractéristiques génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hypertension artérielle, maladie complexe et impossible à analyser sans l’utilisation d’un modèle animal. Nous utiliserons des animaux adultes, âgés de 16 à 20 semaines au début des expérimentations, la pathologie à laquelle on s’intéresse se développant chez l’adulte. Le développement d’une hypertension est un processus long, justifiant de suivre les souris sur plusieurs mois (jusqu’à l’âge de 44 semaines).
Évaluation d’agonistes biaisés du récepteur de l’apéline sur l’équilibre hydrique et la fonction cardiovasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Tués juste après la mesure de leur pression artérielle pour leur épargner des douleurs importantes et des complications vasculaires, les rats porteurs d'un cathéter fémoral donnent le ton du sort réservé aux 1 200 rats de ce projet, tous tués à l'issue. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Chaque rat reçoit une injection de l'une des dix versions modifiées de l'apéline, jusqu'à quatre prélèvements sanguins, environ 24 heures en cage individuelle de métabolisme, et pour certains la pose d'un dispositif de mesure dans l'artère fémorale suivie de deux heures d'enregistrement. Le porteur écrit que les "mini-organes" et les "organ-on-chip" "ne suffisent pas encore", et que l'utilisation d'animaux non-humains vivants reste "indispensable".
Objectifs
Le projet cherche à mieux comprendre comment une substance naturellement présente dans l’organisme (l’apéline) aide à réguler plusieurs fonctions essentielles : la quantité d’eau dans le corps et la pression du sang dans les artères. Cette substance agit en se fixant sur des « récepteurs », c’est-à-dire des sortes d’interrupteurs présents à la surface des cellules. Selon la manière dont ces « interrupteurs » sont activés, les effets peuvent être différents : certains agissent surtout sur les reins pour favoriser l’élimination d’eau, d’autres influencent davantage la pression sanguine. Des versions légèrement différentes de cette substance existent naturellement dans le corps. Elles n’agissent pas toutes de la même façon : certaines modifient la pression sanguine alors que d’autres favorisent principalement l’élimination d’eau par les urines. Les raisons de ces différences ne sont pas encore bien comprises. L’objectif est d’identifier des substances capables d’augmenter l’élimination d’eau sans faire baisser dangereusement la pression artérielle, ou de diminuer la pression artérielle sans perturber l’équilibre hydrique. Dans le premier cas ces composés pourront être utililsés pour traiter l’hyponatrémie, dans le second cas pour traiter l’hypertension. Le projet consiste donc à créer et étudier jusqu’à 10 versions de cette substance, développées à partir des formes naturelles déjà connues. Leur conception repose sur une approche rationnelle : certaines modifications chimiques sont choisies en fonction des effets observés avec les molécules naturelles, afin de mieux comprendre quelles parties de la molécule sont responsables des effets sur les reins ou sur la pression sanguine. Certaines versions seront également conçues pour rester actives plus longtemps dans l’organisme. Avant d’être étudiées chez l’animal, ces nouvelles versions seront d’abord testées en laboratoire sur des cellules afin de vérifier leur bon fonctionnement et leur stabilité. Seules les molécules présentant les résultats les plus favorables (par exemple une bonne stabilité, une activité suffisante et des effets ciblés) seront ensuite évaluées chez le rat. Les chercheurs observeront notamment la quantité d’urine produite, l’équilibre de l’eau et des sels minéraux dans le corps, ainsi que les effets sur la pression artérielle. Après ces études, des analyses complémentaires permettront de mieux comprendre comment ces substances influencent le fonctionnement des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
À court terme, le projet apportera de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines substances agissent sur les cellules et influencent des fonctions essentielles comme la production d’urine, la pression sanguine et la souplesse des vaisseaux. Ces résultats aideront également à concevoir des substances plus efficaces et dont l’action est mieux ciblée. À moyen terme, les chercheurs espèrent identifier des composés capables d’augmenter l’élimination d’eau par les reins sans provoquer de baisse de la pression sanguine, ou au contraire de diminuer la pression artérielle sans perturber l’équilibre de l’eau dans le corps. Ces avancées pourraient servir de base à de futures recherches sur des maladies fréquentes touchant le rein et les vaisseaux sanguins. À long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies répandues ayant un impact important sur la santé publique, comme certaines maladies du cœur, l’hypertension ou l’hyponatrémie ou la polykystose rénale. Des traitements plus précis pourraient aussi réduire les effets indésirables observés avec les médicaments actuels. Au-delà des applications médicales, ce projet permettra d’améliorer les connaissances générales sur le fonctionnement des vaisseaux sanguins et des reins, ce qui bénéficiera plus largement à la recherche en santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions destinées à mieux comprendre les effets des substances étudiées sur l’équilibre de l’eau dans le corps et sur la pression artérielle. • Administrations de substances : chaque animal reçoit une molécule par injection. Ces gestes sont courts, d’une durée de quelques secondes. • Recueil des urines et suivi de la consommation d’eau et de nourriture: certains animaux sont placés pendant environ 24 heures dans des cages adaptées permettant de mesurer la quantité d’urine produite et l’eau et la nourriture consommées. • Prélèvements de sang : des échantillons sanguins sont prélevés une à quatre fois maximum selon le protocole expérimental, avec un intervalle de plusieurs dizaines de minutes à plusieurs heures entre les prélèvements. Ces interventions sont réalisées sous anesthésie afin de limiter la douleur et durent quelques minutes par prélèvement. • Mise en place dans l’artère fémorale d’un petit dispositif de mesure de la pression artérielle : elle est réalisée sous anesthésie générale. L’enregistrement de la pression du sang est réalisé dans la foulée, pendant environ deux heures. L’ensemble des interventions est organisé de manière à limiter le nombre de manipulations et à réduire autant que possible la durée de chaque étape.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux sont principalement liés aux manipulations et aux substances étudiées : 1. Gêne passagère lors des injections : Les animaux peuvent ressentir une douleur légère et très courte au moment de l’injection sous la peau. 2. Stress temporaire lié aux manipulations : La contention, la pesée et l’administration des composés peuvent provoquer un stress bref, limité au temps de l’intervention. 3. Adaptation au changement de cage : Pour les animaux qui sont placés pendant environ 24 heures dans des cages spéciales, l’hébergement individuel et le nouvel environnement peuvent modifier temporairement l’activité ou l’alimentation. 4. Effets physiologiques temporaires des composés : Selon la molécule, une augmentation temporaire de la production d’urine, de légères modifications des sels dans le sang ou l’urine, ou une baisse passagère de la pression artérielle peuvent survenir. 5. Mise en place du dispositif de mesure de la pression artérielle sous anesthésie (et enregistrement) : cette procédure peut entrainer des douleurs et un inconfort post-opératoires importants, ainsi que des complications vasculaires locales. Dans l’ensemble, ces effets sont courts, passagers et liés aux manipulations ou aux effets attendus des composés. Aucune maladie durable n’est prévue.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet sont euthanasiés à l’issue des procédures pour des raisons scientifiques et éthiques. Les analyses prévues nécessitent que le sang, les organes et les tissus soient prélevés immédiatement après la procédure afin de garantir la fiabilité des mesures. Dans le cas des animaux pour lesquels une mesure de la pression artérielle sera réalisée, l’euthanasie interviendra juste après la mesure afin de ne pas leur faire subir des douleurs importantes et de laisser survenir des complications vasculaires.
Remplacement
Avant d’utiliser des animaux, toutes les substances sont d’abord testées dans des expériences en laboratoire sur des cellules. Ces tests permettent de mesurer la façon dont les molécules se fixent sur leur récepteur, leur stabilité dans le sang et leur capacité à activer différentes voies de signalisation à l’intérieur des cellules. Cependant, aucun modèle en laboratoire ne peut reproduire l’interaction complexe entre les reins, le cœur, les vaisseaux sanguins, le foie et la circulation sanguine. Pour connaître l’effet réel sur la pression artérielle et la production d’urine, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant, avec tous les systèmes de régulation actifs. Les modèles « mini-organes » ou « organ-on-chip » ne suffisent pas encore. L’utilisation d’animaux vivants reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour être le minimum nécessaire afin de détecter de manière fiable les effets attendus. Les calculs se basent sur des données précédentes et sur des méthodes statistiques pour garantir que chaque animal contribue utilement aux résultats. La stratégie est progressive : seuls les composés qui montrent des résultats favorables en laboratoire sont testés chez l’animal. Des mesures supplémentaires permettent de réduire le nombre total d’animaux : • Combiner plusieurs mesures sur le même animal quand c’est possible ; • Standardiser strictement les conditions pour limiter la variabilité ; • Utiliser des courbes de doses optimisées pour éviter les répétitions inutiles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes et disposent d’un environnement enrichi (nids, tunnels, bâtonnets). Une période d’adaptation est respectée avant toute intervention. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel qualifié, dans un environnement calme pour limiter le stress. Les volumes injectés sont conformes aux recommandations réglementaires. Les interventions invasives ou terminales sont faites sous anesthésie générale avec contrôle de la profondeur de l’anesthésie et maintien de la température corporelle. Pour les études de 24 heures en cages adaptées permettant de mesurer la quantité d’urine produite, le contact visuel et olfactif avec d’autres animaux est maintenu. Une surveillance quotidienne permet d’évaluer le poids, le comportement et l’état général. Des points limites adaptés sont définis afin d’identifier précocement toute situation susceptible d’entraîner une souffrance et de mettre en place les mesures appropriées.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car sa physiologie et son fonctionnement cardiovasculaire et rénal sont proches de l’Homme. Cette espèce permet de mesurer précisément la pression sanguine, la quantité d’urine produite et la composition des sels dans l’urine et le sang. La taille du rat facilite les prélèvements sanguins répétés nécessaires pour déterminer la durée d’action et la répartition des composés dans l’organisme. L’utilisation de rats issus de souches standardisées assure que les résultats sont comparables entre animaux, ce qui limite le nombre total nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Les rats utilisés sont adultes, âgés de 8 à 12 semaines, car à ce stade leur organisme est complètement développé. Cela permet de réaliser des mesures physiologiques stables et reproductibles, et d’évaluer correctement le métabolisme et la durée d’action des composés étudiés. L’utilisation d’adultes offre également une taille et une robustesse suffisantes pour les interventions, telles que la pose de cathéters ou le prélèvement de tissus, ce qui réduit le stress et le risque de complications.
Nouvelle approche thérapeutique de la maladie d’Alzheimer par modulation du métabolisme énergétique cérébral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
891 souris vont être utilisées, chacune subissant la pose chirurgicale d'une pompe diffusant la molécule testée en moins de vingt minutes, puis deux tests comportementaux au plus, étalés sur cinq et six jours, dont le résumé ne dit pas lesquels. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles de la lignée transgénique employée présentent un risque élevé d'agressions entre eux en groupe, avec des blessures possibles, et le mâle dominant peut être isolé. Les souris entrées en procédure expérimentale sont toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau, tandis qu'une partie des souris nées à l'élevage est gardée en vie pour la reproduction, les surnuméraires étant tuées quand leur génotype ne sert ni à l'élevage ni à l'expérimentation et qu'aucune adoption n'est possible.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer s'accompagne d'une diminution progressive de la capacité du cerveau à utiliser l'énergie dont il a besoin pour fonctionner correctement. Cette perturbation apparaît trés tôt, avant même l'apparition des premiers symptômes, et pourrait contribuer aux troubles de la mémoire, ainsi qu'aux autres troubles cognitifs observés chez les patients. Le fonctionnement du cerveau repose sur une coopération étroite entre les différentes cellules cérébrales. Parmi elles, les astrocytes jouent un rôle important en fournissant aux neurones une partie de l'énergie nécessaire à leur activité. À l’heure actuelle, peu de traitements visent à corriger directement ces anomalies du métabolisme énergétique cérébral. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer une nouvelle approche thérapeutique visant à améliorer l’approvisionnement énergétique des neurones. Pour ce faire, nous étudierons les effets d’une hormone naturellement présente dans l’organisme, capable d’atteindre le cerveau et connue pour agir sur le métabolisme énergétique, l'inflammation, ainsi que sur la faculté du cerveau à récupérer et à se restructurer. Ce projet permettra de déterminer si cette hormone permet de compenser ce déficit énergétique en améliorant le fonctionnement des mécanismes de transfert d’énergie dans le cerveau et de limiter ou au moins de ralentir l’apparition des troubles associés à la maladie d’Alzheimer. Les objectifs de cette étude sont d'évaluer l'effet de notre molécule d'intéret sur le métabolisme énergétique cérébral et sur les symptômes de la maladie d'Alhzeimer, ainsi que de vérifier si ses effets protecteurs peuvent être obtenus après une administration périphérique, ce qui en ferait un candidat thérapeutique prometteur. Ce projet répond à un enjeu majeur de santé publique en explorant une stratégie innovante susceptible de préserver le fonctionnement cérébral et de limiter les effets de la maladie d’Alzheimer grâce au maintien d'un apport energétique adapaté.
Bénéfices attendus
La maladie d'Alzheimer s’accompagne d’une diminution de la capacité du cerveau à produire et à utiliser l’énergie nécessaire à son bon fonctionnement. Cette altération, observée très tôt au cours de la maladie, pourrait contribuer aux troubles de la mémoire et aux autres difficultés cognitives observées chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d'une molécule capable d'améliorer le métabolisme énergétique du cerveau. A court et moyen termes, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le transport et l'utilisation de l'énergie entre les cellules du cerveau, ainsi que leur implication dans les processus d’apprentissage et de mémoire. Cette étude contribuera aussi à déterminer les effets de notre molécule d'intérêt sur ces mécanismes. Les résultats obtenus permettront d'enrichir les connaissances scientifiques sur les mécanismes impliqués dans la maladie d’Alzheimer et pourraient ouvrir de nouvelles pistes de recherche. A long terme, ce projet pourrait avoir des retombées cliniques importantes. Si les effets bénéfiques de notre molécule sont confirmés, celle-ci pourrait être envisagée comme une nouvelle stratégie thérapeutique visant à préserver l'approvisionnement énergétique du cerveau. Cette stratégie pourrait ainsi contribuer à ralentir l'évolution des symptômes et à améliorer la prise en charge des patients atteints de la maladie d’Alzheimer, une pathologie qui touche une part importante de la population âgée (15% des personnes de plus de 80 ans). Plus largement, ce projet pourrait favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les mécanismes énergétiques impliqués dans les maladies neurodégénératives.
Procédures
Tous les actes chirurgicaux décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux venant à naître au sein de notre animalerie subiront au maximum un prélèvement (durée de moins de 10 secondes), ainsi que la pose d’un tag permettant leurs identifications (durée moins de 5 secondes). En ce qui concerne, l’ensemble des animaux entrant dans la procédure expérimentale, une unique chirurgie (durée de moins de 20 minutes) sera réalisée permettant la mise en place de la pompe diffusant notre molécule d’intérêt. À la suite de laquelle les animaux effectueront au maximum deux tests comportementaux, repartis sur 5 et 6 jours respectivement ( ils n'auront pas lieux la même semaine). Chaque session durera au maximum 5 minutes par jour pour l'un des tests et 3 minutes par jour pour l'autre.
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et le prélèvement, qui ne durent que quelques secondes, peuvent entraîner un inconfort transitoire dans les 24 à 48 heures suivant l’intervention. La procédure chirurgicale est susceptible d’induire une douleur post-opératoire, un inconfort local au niveau du site d’implantation, ainsi qu'une perte de poids au cours des 48h suivante. Les manipulations répétées nécessaires au suivi des animaux et à la réalisation des tests comportementaux peuvent également induire un stress transitoire. De même, l’administration des anesthésiques et analgésiques par injection peut occasionner un inconfort transitoire au point d’injection ainsi qu'un stress lié à la manipulation. Enfin, les souris mâles de la lignée transgénique utilisée présentent un risque élevé de comportements agressifs lorsqu’elles sont hébergées en groupe. Ces interactions peuvent induire un état de stress et entraîner des blessures plus ou moins importantes.
Devenir
La majorité des animaux issus de la procédure d'élevage seront conservés afin d'être intégrés dans une procédure expérimentale ou pour assurer le renouvellement des couples reproducteurs. Concernant les animaux surnuméraires, si leur génotype ne présente pas d'intérêt pour l'élevage, la formation ou l'expérimentation et qu'ils ne peuvent pas être proposés à l’adoption, ils seront euthanasiés. Tous les animaux concernés par la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issue de celle-ci. Le prélèvement des cerveaux, incompatible avec le maintien en vie des animaux, sera réalisé afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires, métaboliques et histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l’effet d’une molécule sur le fonctionnement énergétique du cerveau et à évaluer son impact sur les capacités cognitives, notamment les processus liés à l’apprentissage et à la mémoire. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire totalement la complexité du cerveau et de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant pour répondre à ces objectifs. Les études réalisées sur des cellules permettent d’analyser certains mécanismes au niveau cellulaire et moléculaire. Elles seront utilisées dans ce projet en complément afin de mieux comprendre le mode d’action de notre molécule d'intérêt. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l'organisation globale du cerveau, les interactions complexes entre les différents types cellulaires, les échanges avec les vaisseaux sanguins,ni les mécanismes de régulation métabolique qui interviennent dans un organisme entier. De même, les modèles informatiques ne permettent pas actuellement de reproduire de manière suffisamment fiable les relations complexes entre le métabolisme cérébral et les fonctions cognitives. Ils ne permettent notamment pas d'évaluer des fonctions complexes telles que l’apprentissage et la mémoire. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour étudier ces fonctions. Le modèle murin utilisé est, à ce jour, le plus pertinent pour l'étude de la maladie d’Alzheimer. Il permet d’évaluer les effets de la molécule sur des mécanismes énergétiques cérébraux et des fonctions comportementales.
Réduction
Plusieurs stratégies sont mises en œuvre afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. La reproduction des animaux est réalisée à la demande et non en continu, ce qui permet d’ajuster précisément le nombre d'animaux produits aux besoins expérimentaux et de limiter la production au strict nécessaire. La majorité des animaux produits est utilisée dans les procédures expérimentales ou d’élevage. Lorsque cela est possible, les animaux ne présentant pas le génotype requis sont réutilisés dans d’autres projets compatibles, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaire, à la procédure expérimentale, pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant, a été déterminé à l’aide d'outils statistiques. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum.
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du projet. Les conditions d’élevage et d’hébergement sont optimisées et adaptées à l’espèce et aux contraintes du projet. Les animaux sont hébergés en groupes et bénéficient d’un environnement enrichi (matériel de nidification, tunnel et/ou igloo), compatible avec les objectifs expérimentaux. Pendant la formation des lots, les zootechniciennes vont réaliser une surveillance accrue des cages, aidées par un logiciel, qui les alertera en cas de conflit. Lors de l'apparition d'agressivité chez les mâles, davantage d'enrichissements seront ajoutés dans un premier temps. Si la situation devient récurrente ou si les blessures deviennent plus importantes, le mâle dominant sera isolé (autorisation) dans une cage fortement enrichie, positionnée prés de ses congénères sur le portoir ventilé. Pendant l’élevage, les procédures d'identification et de prélèvements sont réalisées dans des conditions d’asepsie stricte et sous anesthésie générale. La taille des prélèvements est réduite au minimum afin de limiter l’impact sur les animaux. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé. Des points limites gradés, associés à un arbre décisionnel et à des critères d’arrêt sont définis pour chaque étape du protocole avec des grilles de suivi adaptées. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et locale, sur un tapis chauffant, dans des conditions d’asepsie stricte et associée à une analgésie adaptée (avant, pendant et aprés l'intervention). Les tests comportementaux ont été sélectionnés afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Une phase d’habituation est systématiquement mise en place afin de réduire le stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation.
Choix des espèces
Le choix du modèle Souris repose sur les critères principaux suivants : 1- La souris partage de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec l’Homme, notamment en ce qui concerne l’organisation et le fonctionnement du système nerveux central. Elle est largement utilisée dans l’étude des maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie d’Alzheimer. 2- Le modèle de la maladie d’Alzheimer chez la souris transgénique reflète les mécanismes pathologiques observés chez l’Homme, notamment l’accumulation de peptides β-amyloïdes et les altérations cognitives associées. Il constitue un modèle validé et largement décrit dans la littérature scientifique. 3- La souris offre par ailleurs des avantages expérimentaux majeurs, notamment l'existence de tests comportementaux validés permettant d’évaluer les fonctions cognitives telles que l’apprentissage et la mémoire. Entre J21 et J28 postnatal, les animaux seront identifiés et génotypés. Cette période correspond au sevrage et permet la séparation des animaux en fonction de leur sexe et de leur génotype, ainsi que la constitution des lots expérimentaux. La réalisation de ces procédures à ce stade limite leur impact sur le développement postnatal. À partir de 4,5 mois, les animaux mâles et femelles seront transférés dans la zone expérimentale et soumis à une période d’acclimatation de 14 jours. À l'âge de 5 mois, les animaux subiront la procédure chirurgicale. Cet âge correspond à un stade adulte jeune, caractérisé par une stabilité des paramètres physiologiques, métaboliques et comportementaux. Il permet la réalisation d’interventions chirurgicales dans des conditions expérimentales homogènes et limite les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Ce stade est également favorable à une récupération post-opératoire optimale et à une standardisation des conditions expérimentales entre individus. À l'âge de 6 mois, les évaluations comportementales seront réalisées. Dans le modèle de maladie d’Alzheimer utilisé, cet âge correspond à un stade d’expression du phénotype, permettant l’observation de déficits comportementaux pertinents pour l’évaluation des effets neuroprotecteurs de la molécule d'intérêt.
Etude du lien causal entre tissu adipeux intramusculaire (IMAT) et fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique dans les contextes de vieillissement et/ou d’obésité EU2/3. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gavées une fois par jour pendant cinq jours, reçoivent dans le quadriceps sous anesthésie une injection de glycérol ou de cardiotoxine qui lèse le muscle, subissent des tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prises de sang à la queue, et une partie d'entre elles passe des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. Une partie est soumise à un régime enrichi en lipides, dont le porteur écrit que l'inconfort peut durer plusieurs semaines, et les mises à mort sont échelonnées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois pour prélever les tissus. L'effectif, lui, repose sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant présenté comme difficile à mettre en œuvre avec autant de tests dans la même procédure.
Objectifs
L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.
Procédures
Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).
Devenir
Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.
Remplacement
A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.
Etude du lien causal entre tissu adipeux intramusculaire (IMAT) et fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique dans les contextes de vieillissement et/ou d’obésité EU1/3. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Établir un lien causal entre le tissu adipeux intramusculaire et le métabolisme du glucose conduit à utiliser 2 232 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, des gavages quotidiens pendant cinq jours, des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins caudaux allant jusqu'à 130 microlitres cumulés, une partie étant soumise à un régime enrichi en lipides dont le porteur écrit que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines". La fonction musculaire est évaluée par trois tests nommés, agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois, pour la récolte des tissus. Le porteur écrit qu'un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre ici et qu'il s'est appuyé sur ses "habitudes expérimentales" pour fixer l'effectif.
Objectifs
L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.
Procédures
Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).
Devenir
Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.
Remplacement
A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.
Expression de la CCK (cholécystokinine) dans le tissu rénal de rats mâles Sprague-Dawley traités à la streptozotocine.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.
Procédures
Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.
Impact sur les animaux
L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.
Raffinement
La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.