Système endocrinien

434 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité étant tuée par prélèvement complet du sang sous anesthésie. Pendant quatre semaines, ils passent huit à seize heures par jour dans un dispositif d'hypoxie intermittente, pendant leur phase de sommeil, pour reproduire les apnées obstructives, avec un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire, une prise de sang en troisième semaine et une échographie de l'aorte sous anesthésie. Le porteur qualifie de "léger" ou "modéré" chacun des stress attendus, y compris le passage en hypoxie et le transport entre les deux établissements. Quinze rats échappent à la mise à mort et seront réutilisés dans d'autres projets, parmi lesquels ceux qui auront servi à former le personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, trente semaines de gavage quotidien et trente semaines d'injections intrapéritonéales bihebdomadaires. S'y ajoutent une chirurgie d'implant d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue à six jours de vie et des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients. Le porteur justifie l'effectif par un calcul de puissance mené "en utilisant un logiciel de statistique", sans autre indication sur la façon dont on parvient à 12 812 individus.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

7 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections dans l'abdomen, dix sous la peau, une injection quotidienne au pousse-seringue pendant vingt-huit jours, des chirurgies intracrâniennes, la pose de canules et de pompes osmotiques, un isolement d'une semaine, jusqu'à dix-huit semaines de régime obésogène, trois jeûnes et la coupure de la pointe de la queue pour les prises de sang. Le porteur signale que le régime gras provoque des problèmes de dents, que les chirurgies exposent à l'hypothermie et à des troubles cardiorespiratoires, et que l'enrichissement est retiré pendant l'isolement pour ne pas gêner les lasers qui mesurent l'activité locomotrice. Il écrit que chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure "dans le respect des 3R", les tissus de la moitié d'entre elles allant aux analyses moléculaires, ceux de l'autre moitié aux analyses histologiques.

Objectifs

Les hormones permettent à nos organes de communiquer entre eux et jouent ainsi un rôle essentiel au bon fonctionnement et au maintien de nos fonctions physiologiques, notamment celles régulées par le cerveau. Tout comme l’homme, la souris possède des récepteurs aux hormones dans des régions cérébrales essentielles dans la régulation du métabolisme énergétique. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour la mise en place de stratégie thérapeutique contre les troubles du métabolisme comme l’obésité. Notre objectif est de comprendre: 1- le nouveau rôle de récepteurs aux hormones dans la régulation du métabolisme énergétique dans un contexte physiologique et pathologique, 2- tester des nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge de des troubles métaboliques comme l’obésité. Ces deux axes de recherche seront étudiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les maladies métaboliques tel que l’obésité. De plus, il permettrait de comprend le nouveau rôle, au niveau du cerveau, de récepteurs dans l'intégration des signaux de satiété ou d'appétit venant de la périphérie.

Procédures

Injections intrapéritonéales (6 max par souris; durée

Impact sur les animaux

Les nuisances en lien avec les chirurgies sont 1) pendant les chirurgies, une hypothermie et des problèmes cardiorespiratoires, ainsi que du stress et un déssèchement des yeux 2) en post-chirurgie, des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques ainsi que du stress. Le régime riche en graisse va entrainer une prise du poids au fur et à mesure des semaines, les souris vont devenir un peu moins actives et développer des problèmes de dents à cause de croquettes plus souples que les croquettes standards. Lors des tests métaboliques, les animaux n’auront plus accès à la nourriture pendant plusieurs heures, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. Le gavage peut entrainer du stress dû à la contention et à la sonde de gavage. La coupure de la pointe de la queue lors de ces mêmes tests entraine une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure pour prélèvements sanguins. Concernant l’isolement pour la mesure de paramètres métaboliques: l'isolement pendant une semaine chez la souris peut créer du stress. La mesure de composition corporelle nécessite une anesthésie qui peut également engendrer un stress chez la souris, la dose de rayons X nécessaire est faible et non-chronique et n’entraine donc pas de nuisance.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure, dans le respect des 3R. Une moitié sera dédié à l’étude moléculaire de différents tissus (hypothalamus, tronc cérébral, foie, pancréas, tissu adipeux). La seconde moitié sera dédié à l’étude histologique des mêmes tissus.

Remplacement

Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. De plus, pour réaliser les tests de comportements, il n'existe pas d'alternatives à l'utilisation d'animaux décrit actuellement dans la littérature. Des premiers tests ont été effectués in vitro, pour sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses comme antagoniste des récepteurs parathyroïdiens, ainsi que les concentrations de toutes les molécules qui seront utilisés pour transposer in vivo. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés (t test si 2 conditions / ANOVA si plus de 2 conditions).

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi, en dehors des phases d’isolement. L’enrichissement se limite à la litière lors des phases d’isolement, pour éviter l’interaction avec les lasers qui détectent l’activité locomotrice des souris. Pour limiter les nuisances/effets indésirables des injection intrapéritonéales, nous utiliserons une aiguille fine. Pour le gavage, nous utiliserons une sonde souple pour limiter les nuisances. De plus, une anesthésie profonde sera réalisée à chaque acte chirurgicale pour limiter la douleur et un analgésique sera également utilisé en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité. Les souris sont faciles à manipuler. Dans cette étude, certaines souris entreront en suivi (régime spécifique ou standard) à l’âge de 11 semaines. En effet, à 11 semaines les souris, en plus d'avoir passé la maturité sexuelle seront plus robuste et auront atteint un poids qui va leur permettre de subir la prise de poids inévitable due au régime sans que cela n’impacte trop leur organisme.

1 980 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-deux injections dans l'abdomen, douze prélèvements de sang à la queue et douze semaines de régime enrichi en graisses. S'y ajoutent une biopsie de la queue, deux jeûnes de six et seize heures, un gavage, une injection dans le sinus rétro-orbitaire et une perfusion intracardiaque sous opioïde, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont mises à mort à l'issue pour prélever les organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Objectifs

Le pancréas est central dans la régulation de la glycémie. Il produit les hormones permettant de réguler la glycémie. Comme tous les tissus, le pancréas est relié au cerveau par le système nerveux périphérique. Cependant, son rôle dans la fonction du pancréas n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier la contribution du réseau nerveux dupancréas, et notamment dans la sécrétion des hormones régulant la glycémie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 à 22 injections intra-peritonéales (20s), 1 injection sous-cutanée (10s), 2 jeun (6h et 16h), 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 injection intra-veineuse (5s), 1 chirurgie sans réveil (10min), 1 gavage (1min).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale : douleur légère due à la piqure. -Injection intra veineuse rétro-orbitale : gêne, douleur légère au point d'injection. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment de l'injection. -Injection sous- cutanée : douleur légère due à la piqure. -Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée.-Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle du système nerveux du pancréas en condition normale et de stress glycémique, tels que l'obésité et la mise à jeun. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Une étude pilote avec des petits nombres d’animaux a été inclue pour mettre en place des protocoles adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

1 019 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, douze à seize jours d'isolement pour la mesure du métabolisme et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et commencent par une chirurgie cérébrale de vingt minutes sous anesthésie générale, suivie d'injections dans l'abdomen. Certaines lignées développent à partir de neuf mois des problèmes musculaires ou une paralysie, que le porteur présente comme une caractéristique de la lignée. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, muscle, tissu gras et foie, la question posée étant de relier le dérèglement du métabolisme à la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.

Tuées au terme d'une heure d'expérience pour que leur cerveau soit prélevé, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une instillation dans le nez pendant deux minutes alors qu'elle est éveillée, une injection dans l'abdomen trente minutes plus tard, puis passe sur la table d'opération sous anesthésie. Il s'agit de vérifier qu'un peptide administré par le nez fait passer la leptine du sang vers le cerveau, pour éviter l'injection directe dans le cerveau lors des expériences suivantes et viser, à terme, l'obésité et le diabète. Le porteur affirme que les traitements "ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement" tant que les doses sont respectées, alors que cette heure se termine par une chirurgie dont les souris ne se réveillent pas.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider chez la souris, la voie d’administration intranasale de l'octapeptide OP et de l’antagoniste de son récepteur dans la facilitation du transport de la leptine periphérique vers le cerveau et ses effets. Il s’inscrit dans une étude plus vaste qui vise à comprendre comment le système OP/récepteur influence ce transport en portant un éclairage sur les mécanismes de contrôle du poids et de l'appétit. Ce projet vise plus spécifiquement à proposer la voie intranasale, non-invasive, comme une alternative efficace à l’administration intracérébroventriculaire de l’OP, ouvrant ainsi la perspective d’une approche translationnelle vers une nouvelle stratégie thérapeutique des troubles métaboliques et de l'obésité.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre des avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle concernant le mode d'accès de la leptine au cerveau. La littérature rapporte l’efficacité de l’OP, administré par la voie intracerebroventriculaire, à faciliter l’accès de la leptine au parenchyme et à activer sa signalisation. Cette étude pourrait démontrer que l’instillation d’OP favorise, de la même façon, le passage de cette hormone hypoglycémiante périphérique au cerveau pour y produire son effet anorexigène. Cette validation aura des conséquences positives sur les futures expériences pré-cliniques en s’affranchissant définitivement du geste invasif d’administration intracérébroventriculaire stéréotaxique voire clinique avec une voie d’auto-administration facile et acceptable par les patients.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, les souris seront soumises à trois gestes techniques sur une durée totale d’une heure. Tout d'abord, une administration intranasale (2 minutes environ) sera réalisée sur des animaux vigiles suivie d'une injection intrapéritonéale (2 minutes) après trente minutes. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie et couverture analgésique sera effectuée en vue du prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

À priori, nous ne prévoyons pas d'incidents majeurs chez les animaux utilisés dans ce projet qui s’étend sur 1 heure. Cependant, une surveillance accrue sera mise en place dans la seconde demie-heure pour les animaux injectés afin de détecter tout signe d'hypoglycémie. Il est important de noter que les traitements ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement préjudiciables au bien-être des animaux, tant que les doses définies sont respectées. La chirurgie thoracique terminale est précédée d’une prise en charge analgésique et anesthésique.

Devenir

Mise à mort des animaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

Le projet scientifique vise à valider la voie d’administration intranasale d’OP pour faciliter le transport de la leptine produite par le tissue adipeux vers le cerveau afin d’envisager un transfert en clinique humaine comme un nouveau traitement contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien cet objectif physiologique n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’étude sera réalisée in vivo chez la souris, puis ex vivo. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.

Réduction

En accord avec nos expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’étude est conduite sur des lots de 12 souris (6 males et 6 femelles) par condition de traitement qui suivront l’ensemble des gestes expérimentaux. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables, y compris en fonction du sexe.

Raffinement

Les souris sont maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier au moins une semaine avant le début du projet. Les gestes expérimentaux sont menés dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés avant et pendant toute la durée du protocole (1 heure d’expérimentation par animal) et leur score confronté à la grille de score détaillée incluant des points limites adaptés. Les gestes techniques sont réalisés en présence d’une médication appropriée.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système OP/récepteur dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions de la leptine liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.