Système endocrinien

Une solution censée améliorer la digestion des fourrages chez les ruminants, les lapins et les chevaux d'élevage passe d'abord par 144 souris. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées par sonde orogastrique pendant 21 jours, avec des prélèvements de selles deux fois par semaine. Chacune est hébergée seule, en cage sur grille, pour permettre la mesure individuelle de ce qu'elle ingère et excrète. Toutes seront tuées puis autopsiées, et le porteur affirme que les effets du produit ne s'évaluent que sur un organisme "pris dans sa globalité".

Objectifs

L’objectif général du projet est l’amélioration de la digestibilité des fibres chez les monogastriques ainsi que chez les polygastriques. En effet, ce processus, réalisé par un microbiote spécialisé hébergé dans le tractus digestif des individus mono ou polygastriques est essentiel à la nutrition et au bien-être digestif de l'hôte. Les fibres, apportées sous forme de fourrages frais (herbe pâturée), secs (foin) ou ensilés sont un composant essentiel des rations ingérées dans une grande diversité de systèmes d’élevage quel que soit le modèle animal ciblé (ovins, bovins, caprins, equins, lapins...). Le microbiote responsable de cette digestion est remarquablement efficace du fait de la production d’une large gamme d’enzymes (cellulases, hémicellulases) capables d’hydrolyser les polysaccharides complexes présents dans les fourrages, permettant la conversion en composés énergétiques majeurs (acides gras volatils ou à chaine courte) utilisables par l’animal hôte. Cependant, de nombreux facteurs (composition de la ration, stress environnemental…) peuvent réduire la capacité de ce microbiote à assurer sa fonction fibrolytique. Notre objectif est donc basé sur le développement de stratégies nutritionnelles permettant d’améliorer la digestibilité des fibres afin de compenser ce déficit.

Bénéfices attendus

Ce travail doit permettre de mettre en évidence le bénéfice de l'apport d'une fraction microbienne sur l'augmentation de la capacité de leur hôte à dégrader et digérer les fibres issues de sa ration.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d'intervention au cours de ce projet : 1) Le gavage orogastrique et sa répétition (21 jours) pendant le développement du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure, 2) le prélèvement de selles chez l'animal qui peut, également, être source de stress lié à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois pas semaine) et la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet étant d'optimiser le potentiel de dégradation fibrolytique de l'animal, l'apport fractions microbiennes provenant de bactéries connues pour cette activité de dégradation fibrolyitque et exemptes de bactéries vivantes, n'entrainera aucune nuisance pour la santé de l'animal cependant, le geste technique du gavage orogastrique et sa répétition pendant le déroulé du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure. De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois par semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Enfin, l'hébergement en cage individuelle et sur grille peut également source de stress pour les animaux, cette situation fera l'objet d'une évaluation attentive et sera atténuée par la capacité conservée de l'animal à visualiser/sentir ses congénères et par des grilles adaptées pour les souris . Pour toutes ces interventions, un arbre décisionnel est appliqué lorsqu'un point limite apparait.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’impact de l'apport de fractions microbiennes sur l'augmentation des capacités fibrolytiques des herbivores mono et polygastriques nécessite le recours à un modèle in vivo pour atteindre notre objectif. Les effets bénéfiques potentiels de ces produits ne peuvent être évalués que sur un organisme pris dans sa globalité et dans un premier temps sur un modèle murin.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles, qui seront hébergées dans les conditions réglementaires au sein de l'installation. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur ce modèle murin. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 24 souris conventionnelles (12 femelles et 12 mâles par lot) : - un lot de 24 souris TEST qui recevra par gavage orogastrique les fractions microbiennes - un lot de 24 souris TEMOIN qui recevra par gavage orogastrique l'équivalent en volume d'un tampon isotonique. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non préalablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus. Ainsi, 144 souris au total seront utilisés pour ce projet

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse.

Choix des espèces

Les souris seront agées de 10 semaines à leur arrivée au sein de l'établissement utilisateur, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour des études de digestibilité des fibres et correspond aux animaux cibles de la stratégie nutritionnelle (stade adulte)

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.

Opérées du cerveau sous anesthésie générale pour implanter une canule ou une fibre optique dans l'hippocampe, 210 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leur tissu adipeux. L'intervention dure environ une heure, et le porteur signale des crises d'épilepsie rares ainsi que la possibilité que l'animal décolle son implant en se frottant. Chaque souris subit ensuite deux stress de cinq minutes et un test de mémoire, après un régime riche en gras et en sucre administré dès l'adolescence, avec ou sans restriction horaire. Au titre de la réduction, le porteur indique récupérer pour ses mises au point des souris "produites mais non utilisées", issues de croisements transgéniques n'ayant pas donné le génotype voulu.

Objectifs

La consommation de régime alimentaire obésogène (riche en gras et en sucre) pendant la période d’adolescence est associée à des troubles de mémoire. Ceux-ci peuvent être prévenus si l’alimentation obésogène est restreinte dans le temps (chrononutrition). Nos travaux précédents montrent que le régime obésogène entraine une modification de la régulation des hormones glucocorticoïdes (corticostérone chez la souris) qui est restaurée par la chrononutrition. Or ces hormones sont connues pour être fortement impliquées dans les processus de mémoire. Leur altération pourrait expliquer les troubles de mémoire associés à la consommation d’alimentation obésogène. L’objectif principal de ce projet est de mesurer le rôle des hormones glucocorticoïdes in vivo, en temps réel et au cours du temps dans différents contextes d’alimentation (obésogène vs contrôle, avec ou sans chrononutrition) en une utilisant une approche nouvelle basée sur la fibre optique. Nous pensons qu’avec cette technologie nous pourrons plus finement comprendre le rôle de ces hormones dans les troubles de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.

Bénéfices attendus

L’achèvement des expériences proposées devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps(chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire (et éventuellement des troubles émotionnels) induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones glucocorticoïdes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à un excès de ces hormones.

Procédures

Chaque animal (210 au total) subit une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie dure environ 1h et la récupération post-opératoire est d’environ 2 heures. Ensuite, chaque animal subit deux stress modérés de 5 min chacun. Tous les animaux subissent un test de mémoire de 2 fois 10 min. Six animaux recevont deux injections de drogue et 6 animaux recevront une injection de drogue. Les injections durent 3 min chacune.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie du cerveau bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (nuisance modérée). L'implantation de canule ou de fibre optique dans la région du cerveau appelée hippocampe (siège de la mémoire), peut entrainer parfois des crises d'épilepsie (rare et de courte durée). La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée ou la fibre optique en la frottant. Cela peut générer un inconfort qui reste modéré car il n’y a pas de plaie ouverte. Certains tests de comportement sont stressants mais ne durent que 5 min. Le régime obésogène utilisé n'entraine pas de diabète pour le temps d'exposition maximale utilisé (12 semaines).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes (cerveau, tissu adipeux) en vue d’analyses post mortem

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les émotions et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la mémoire et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la deuxième. Pour les mises au point nous utilisons des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié

Raffinement

A leur arrivée, les animaux ne subissent pas d’expérimentation pendant 2 semaines afin de favoriser leur acclimatation à notre animalerie. Nous les manipulons régulièrement pour qu’ils s’habituent à l’expérimentateur. Lors des chirurgies nous pratiquons une anesthésie générale et une antalgie médicamenteuse. La chirurgie est réalisée dans des conditions d’asepsie et nous pratiquons des soins pré et post-opératoires adaptés. Nous avons mis en place un arbre décisionnel de points d’arrêt précoces où nous intervenons pour réduire le stress et la douleur des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validées dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permetttant des compariasons directes avec ce qui es déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence (3 à 7 semaines) jusqu'à l'état jeune adulte, stades de développement que nous voulons étudier dans notre projet.

Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des implants hormonaux sous anesthésie, on leur injecte des substances dans l'abdomen pendant quinze jours, on incise l'extrémité de leur queue pour cinq mesures de glycémie après six heures de jeûne. Une partie porte un phénotype transgénique dommageable qui réduit ses comportements exploratoires et sociaux et accroît sa sensibilité au stress, l'hébergement individuel et les restrictions alimentaires ajoutant isolement, baisse d'appétit et perte de poids. Le projet annonce des biomarqueurs précoces et des stratégies thérapeutiques contre le déclin cognitif après la ménopause, retombées situées bien au-delà de la première année, quand la mise à mort des 1 536 souris est acquise dès le départ.

Objectifs

Les femmes sont plus touchées que les hommes par certaines maladies du cerveau, comme la maladie d'Alzheimer, notamment après la ménopause. Cette période de la vie s'accompagne de changements importants dans l'organisme : le cerveau, le système de défense de l'organisme et le métabolisme sont tous affectés. La diminution de certaines hormones perturbe le fonctionnement du cerveau et peut, avec le temps, entraîner des dommages neurologiques durables. En parallèle, l'organisme développe un état inflammatoire plus marqué. Cette combinaison, perturbation cérébrale et inflammation, pourrait expliquer en partie pourquoi le risque de développer la maladie d'Alzheimer augmente après la ménopause. Notre projet vise à mieux comprendre ces mécanismes en étudiant comment le système immunitaire se modifie au fil des étapes de la ménopause chez la souris. Nous souhaitons également examiner le lien entre ces modifications et des paramètres tels que le poids et l'alimentation. Enfin, nous cherchons à déterminer si et comment les cellules du système immunitaire jouent un rôle dans le fonctionnement du cerveau durant cette période.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes clés qui relient ménopause et déclin cognitif. Déterminer le rôle précis des cellules immunitaires dans l’apparition ou l’aggravation des symptômes. Révéler des biomarqueurs précoces, utiles pour le diagnostic ou la prévention, avant l’apparition des pertes de mémoire. Ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant spécifiquement les processus immunitaires déclenchés par la ménopause. Prévenir la maladie pour éviter de devoir traiter des symptômes cognitifs aggravés. Les premiers résultats de ce projet peuvent être accessibles dès la 1re année de réalisation du projet.

Procédures

Injections abdominales de substances pendant 15 jours (animal vigil). Incisions de la queue pour collecter une goutte de sang et injection pour le test de tolérance au glucose et à l’insuline (animal vigil) : mesurer la glycémie à 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après injection (1 intervention d’1 minute par point temporel). Jeûne de 6 h (début tôt le matin pour limiter le stress). Tests comportementaux (animal vigil) : 10 min par session pour étudier les capacités cognitives des souris (1 session par test). La durée réduite de chaque test (inférieure à 1 h), sans manipulation et sans perte de poids attendue. Pose d’implants hormonaux : 5 min d’intervention, 1 fois (animal endormi). Injections cervicales : 30 min d’intervention, 1 fois (animal endormi).

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induisent un stress léger limité à la durée des tests, inférieure à une heure, sans manipulation invasive ni perte de poids attendue. L’hébergement individuel peut entraîner un stress modéré lié à l’isolement social, pouvant se traduire par une diminution transitoire de l’activité ou de l’appétit. Les interventions chirurgicales nécessaires à la pose d’implants entraînent une douleur post-opératoire transitoire. Une perte de poids peut être observée transitoirement lors des périodes de restriction alimentaire nécessaires à certaines tâches comportementales. L’incision de l’extrémité de la queue pour le prélèvement d’une goutte de sang provoque une douleur légère et de courte durée ainsi qu’une irritation locale transitoire. Le phénotype dommageable du modèle transgénique peut conduire à une réduction des comportements exploratoires et sociaux des souris transgéniques ainsi qu’à une sensibilité accrue au stress. Les injections aabdominales répétées peuvent provoquer un stress léger ainsi qu’une gêne transitoire au moment de la contention et de l’injection. Les injections cervicales nécessitent une anesthésie générale de l'animal (30 minutes d'intervention). Les souris seront donc contrôlées pendant plusieurs jours après la chirurgie .

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche.

Remplacement

Les liens entre la ménopause, l’immunité, le métabolisme et le fonctionnement du cerveau sont très complexes, car ils impliquent de nombreux organes et systèmes qui interagissent en permanence dans l’organisme. À ce jour, aucune méthode utilisant uniquement des cellules en culture, des organoïdes ou des simulations informatiques ne permet de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un organisme vivant. Seules les études réalisées chez l’animal permettent d’observer en même temps l’évolution du comportement, des hormones, du métabolisme, du système immunitaire et du cerveau chez un même individu au cours du temps. Les méthodes alternatives apportent des informations utiles, mais elles ne permettent pas d’évaluer le comportement ni de comprendre les réponses globales de l’organisme nécessaires pour étudier cette période de vulnérabilité liée à la ménopause. Dans l’état actuel des connaissances, l’utilisation de l’animal reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Pour obtenir des souris génétiquement modifiées de manière efficace, nous sélectionnons uniquement celles dont les gènes correspondent à nos besoins. Ensuite, nous comparons les résultats entre différents groupes d’animaux à l’aide de méthodes statistiques adaptées : pour deux groupes, un test simple vérifie s’il y a une différence significative entre eux ; pour plus de deux groupes, une analyse plus poussée est réalisée. Nous avons calculé le nombre idéal de souris par groupe pour obtenir des résultats fiables, en tenant compte de la variabilité naturelle, pour détecter toutes différences entre les groupes. Résultat : il faut environ 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : Période d’habituation avant utilisation en expérimentation d’une semaine minimum. La surveillance des animaux sera renforcée durant les périodes expérimentales et en cas de constat de dégradation du bien-être / souffrance des animaux. L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois l’hébergement des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal. Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée, anatomique, physiologique, comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, il sera mis en place des mesures conservatoires et des critères d’arrêt des souffrances, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier le cerveau et le système nerveux chez les vertébrés. L’organisation de son système nerveux est, à bien des égards, proche de celle de l’être humain, tant sur le plan de la structure que du fonctionnement. Cela permet aux scientifiques de mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et comportements, avec des résultats souvent pertinents pour l’humain. Plus largement, les caractéristiques du cerveau de la souris sont similaires à celles des autres mammifères, ce qui rend les connaissances obtenues utiles pour la recherche médicale. Dans ce projet, nous nous intéressons à des cellules du cerveau appelées microglies, qui jouent un rôle important dans la défense immunitaire du système nerveux. Pour les observer, nous utilisons des souris génétiquement modifiées, chez lesquelles ces cellules émettent une lumière visible au microscope. Cela permet de mieux les repérer et d’analyser leur comportement dans le tissu cérébral. Nous étudions également des souris présentant des caractéristiques proches de la maladie d’Alzheimer, afin de mieux comprendre comment le système immunitaire du cerveau évolue dans cette maladie. Les tests biologiques, biochimiques et comportementaux sont effectués sur les souris à partir du moment où elles deviennent adultes sur le plan reproductif et jusqu’au début de l’âge adulte. Cette période correspond à un organisme déjà mature, mais encore peu affecté par le vieillissement. Cela permet d’étudier les effets des manipulations sur un système hormonal fonctionnel, tout en limitant les effets liés à l’âge et en assurant de bonnes conditions de tolérance pour les animaux.

Une neurochirurgie de 90 minutes sous anesthésie générale pour 1 472 souris, dix jours d'hébergement individuel en cage hermétique avec passage à 33 °C puis à 4 °C pendant 24 heures pour 1 312 autres : 2 732 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi jusqu'à quatre immobilisations de cinq minutes en position fœtale dans un tube, des gavages quotidiens, des injections abdominales pendant deux semaines et six mesures de glycémie après sept heures de jeûne. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et tissu gras. Le projet porte sur les mécanismes de la reprise de poids après un régime, sans que l'effectif de 2 732 souris soit rapporté à une justification chiffrée.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids. NOUS ETUDIERONS EGALEMENT COMMENT CETTE “MEMOIRE DE L’OBESITE” PEUT IMPACTER LA MEMOIRE, L’ANXIETE ET L’ETAT EMOTIONNEL, AFIN DE COMPRENDRE LES CONSEQUENCES COGNITIVES ET EMOTIONNELLES DE CES ALTERATIONS CEREBRALES LIEES AU POIDS.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

1) ANALYSE DE COMPOSITION CORPORELLE (2732 SOURIS) MAINTIEN 5 MINUTES EN POSITION FŒTALE DANS UN TUBE VENTILÉ, SANS ANESTHÉSIE. JUSQU’À 4 ANALYSES PAR ANIMAL. 2) NEUROCHIRURGIE (1472 SOURIS) INJECTION INTRACÉRÉBRALE SOUS ANESTHÉSIE GÉNÉRALE PENDANT ENVIRON 90 MINUTES. UNE INJECTION ANTALGIQUE 30 MINUTES AVANT, PUIS UNE PAR JOUR PENDANT 2 JOURS. PENDANT L’ANESTHÉSIE : DEUX INJECTIONS D’ANESTHÉSIQUES LOCAUX, UNE INJECTION ANTALGIQUE ET DEUX INJECTIONS DE RÉHYDRATATION. UNE SEULE CHIRURGIE PAR SOURIS. 3) INJECTIONS ABDOMINALES (2624 SOURIS) 1152 SOURIS : INJECTIONS ABDOMINALES SANS ANESTHÉSIE PENDANT UN MAXIMUM DE 2 SEMAINES. 2560 SOURIS : EUTHANASIE PAR INJECTION ABDOMINALE SOUS SÉDATION, APRÈS INJECTION SOUS-CUTANÉE D’UN SÉDATIF. 4) GAVAGE ORAL (1472 SOURIS) GAVAGE QUOTIDIEN PENDANT 5 JOURS, SANS ANESTHÉSIE. 5) CAGES MÉTABOLIQUES POUR L’ÉTUDE DE LA DÉPENSE ÉNERGÉTIQUE (1312 SOURIS) HÉBERGEMENT INDIVIDUEL EN CAGES HERMÉTIQUES PENDANT 10 JOURS. TEMPÉRATURE MODIFIÉE À 33 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, PUIS À 4 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, AVEC DEUX JOURS DE RÉCUPÉRATION À 22 DEGRÉS CELSIUS ENTRE LES DEUX. CETTE PROCÉDURE EST RÉALISÉE UNE SEULE FOIS. 6) APRÈS 7 HEURES DE JEÛNE INJECTION ABDOMINALE SUIVIE DE 6 MESURES DE GLYCÉMIE PAR PRÉLÈVEMENT DE SANG À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, SANS ANESTHÉSIE. DURÉE MAXIMALE : 120 MINUTES. RÉALISÉ UNE SEULE FOIS. 7) PRÉLÈVEMENTS SANGUINS EN RÉPONSE AU STRESS (108 SOURIS) PRÉLÈVEMENTS À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, ZONE NON INNERVÉE. MAXIMUM 4 PRÉLÈVEMENTS DE 15 MICROLITRES PAR ANIMAL, SOIT 60 MICROLITRES AU TOTAL, CORRESPONDANT À ENVIRON 4 POUR CENT DU VOLUME SANGUIN. 8) TESTS COMPORTEMENTAUX (108 SOURIS) OBJECTIF : ÉVALUER L’IMPACT DES MANIPULATIONS EXPÉRIMENTALES SUR L’ANXIÉTÉ, LA MÉMOIRE, L’APPRENTISSAGE, LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. HÉBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT UN MAXIMUM DE 6 SEMAINES DANS DES CAGES TRANSPARENTES, ENRICHIES ET RAPPROCHÉES. TESTS RÉALISÉS : OPEN FIELD (10 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ACTIVITÉ ET L’ANXIÉTÉ ; LIGHT DARK TEST (5 MINUTES, UNE FOIS) ET ELEVATED PLUS MAZE (5 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ANXIÉTÉ ET LA PRISE DE RISQUE ; WATER MAZE (5 MINUTES, 16 RÉPÉTITIONS) POUR LA MÉMOIRE SPATIALE ET L’APPRENTISSAGE ; TAIL SUSPENSION TEST (6 MINUTES, UNE FOIS) POUR LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. TEST DE PRÉFÉRENCE POUR LE SUCRE : 48 HEURES AVEC DEUX BOUTEILLES D’EAU, PUIS 48 HEURES AVEC EAU ET SOLUTION SUCRÉE À 4 POUR CENT, POUR ÉVALUER L’INTÉRÊT POUR UNE RÉCOMPENSE AGRÉABLE.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience, EXCEPTE POUR LES TESTS DE COMPORTEMENTS OU NOUS DEVONT PLACER LES SOURIS DANS DES CAGES INDIVIDUELLES DEUX SEMAINES AVANT LE DEBUT DES TESTS ET CE JUSQU’A LA FIN DE LA PROCEDURE, POUR UNE DUREE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AFIN DE LIMITER LES BIAIS SOCIAUX. EGALEMENT, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Au cours de ces 10 jours, la température des cages sera ponctuellement changée à 33°C pendant 24 h, puis à 4°C pendant 24 h, avec deux jours de récupération à 22°C entre ces deux changements. Une légère perte de poids est possible à la suite de ces changements de température.Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. LES SOURIS QUI PASSERONT LES TESTS COMPORTEMENTAUX PEUVENT DEVELOPPER UN STRESS PSYCHOLOGIQUE TRANSITOIRE, SE MANIFESTANT PAR DE L’ANXIETE, DES REPONSES DE PEUR OU UNE IMMOBILITE PROLONGEE. CES EFFETS SONT REVERSIBLES ET DE COURTE DUREE, CAR LES TESTS SONT REALISES DE MANIERE LIMITEE ET CONTROLEE, AVEC DES PROCEDURES RAPIDES ET ADAPTEES. DES MESURES SONT PREVUES POUR REDUIRE AU MAXIMUM L’INCONFORT, NOTAMMENT DES MANIPULATIONS DOUCES ET DES PERIODES DE RECUPERATION SUFFISANTES ENTRE LES TESTS. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

1) LES ANIMAUX ARRIVERONT À 4 SEMAINES ET SERONT HABITUÉS À L’HÉBERGEMENT PENDANT AU MOINS 1 SEMAINE. L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL SERA LIMITÉ AUX TESTS COMPORTEMENTAUX POUR UNE DURÉE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AVEC DES CAGES TRANSPARENTES ET ENRICHIES RAPPROCHÉES POUR LIMITER L’ISOLEMENT.Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.

2 200 souris vont être utilisées, dont 920 nourries seize semaines au régime gras, 280 isolées 48 heures en cage métabolique et 240 placées à 5 °C pendant six heures ou dix jours, avec mesure de la température rectale. 560 d'entre elles subissent trois tests métaboliques comportant sept piqûres sanguines chacun, 640 une injection quotidienne pendant sept jours, et 1 560 un prélèvement à la veine temporale juste avant leur mise à mort. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées pour récupérer organes et sang. L'objectif affiché est d'identifier une enzyme des macrophages comme cible future de médicaments contre l'obésité, perspective renvoyée à d'éventuels développements ultérieurs.

Objectifs

Dans notre organisme, il existe deux grands types de cellules graisseuses, appelées adipocytes. Les adipocytes blancs stockent les graisses issues de notre alimentation, tandis que les adipocytes bruns et beiges les brûlent pour produire de la chaleur. Cette combustion joue un rôle essentiel pour maintenir la température du corps lorsqu’il fait froid, mais aussi pour éliminer l’excès de calories après un repas. Chez les personnes souffrant d’obésité, ces adipocytes « brûleurs de graisse » fonctionnent moins efficacement. Mieux comprendre les mécanismes responsables de cette défaillance pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour restaurer leur activité et favoriser la perte de poids. Des travaux scientifiques ont montré que certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, présentes dans les tissus adipeux, participent au bon fonctionnement de ces adipocytes grâce à un dialogue étroit entre cellules. Cependant, en situation d’obésité, ces macrophages changent de comportement et se mettent à produire des substances qui freinent l’activité des adipocytes brûleurs de graisse. L’une de ces substances pourrait être un dérivé lipidique fabriquée par les macrophages grâce à une enzyme spécifique. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si et comment, la production de ce dérivé lipidique par cette enzyme des macrophages contribue au dysfonctionnement des adipocytes bruns et beiges.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de ce dérivé lipidique produit par les macrophages dans la dysfonction des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer l'enzyme le synthètisant comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Des souris (920) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (1200) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (280) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (560) recevront seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Les tests seront espacés de 2 semaines. Un prélevement de sang à la veine temporale sera également réalisé sur certaines souris (1560) avant la mise à mort dans certaines procédures. Des souris vigiles (640) recevront une injection et des souris vigiles (640) recevront une injection par jours pendant 7 jours. Des souris (920) seront hébergées à thermoneutralité (30 °C) pendant 18 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température rectale, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (120 souris) ou 10 jours (120 souris). 7 mesures espacée d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(120 souris).

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur légère et de courte durée. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une augmentation de l'enrichissement de l'environnement. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2-2.5 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. La mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention.

Devenir

Mise à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études cellulaires qui ont montré que ce dérivé lipidique inhibe le développement/fonction des adipocytes thermogéniques qui participent au contrôle de la prise de poids et à la thermorégulation. Cependant, les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques ainsi que de la thermorégulation et de la régulation de la dépense energétique sont complexes, faisant intervenir un dialogue entre différentes cellules et organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de la production ce dérivé lipidique par les macrophages sur la fonction des adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement significatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié. Une des procédures est dépendantes du résultat de deux autres et ne sera réalisée uniquement si ces procédures donnent des résultats montrant une différence significative entre les génotypes, afin de réduire le nombre de souris utilisées dans ce projet.

Raffinement

L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, buchette de bois). Cet environnement a été adapté selon les conditions experimentales pour favoriser le bien-être des souris et des comportements naturels. L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir adaptée à chaque procédure a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Avec le recul que nous avons sur les experiences proposées, nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a un tissu adipeux brun très développé qui contribue à leur dépense énergétique et constitue donc un modèle de choix pour identifier de nouveaux mécanismes régulant la fonction thermogénique de ce tissu et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'Homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (age 12-23 semaines selon les procédures).

Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.

Objectifs

Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.

Remplacement

Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.

Raffinement

Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.