Système endocrinien

96 rongeurs Arvicanthis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis pendant 16 semaines à un régime gras et sucré, ils subissent trois séries de huit microprélèvements sanguins sur animal vigile, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer une douleur aiguë et une inflammation, avant un prélèvement sanguin terminal. Tous sont tués pour des analyses moléculaires et biochimiques post-mortem. Le porteur retient ce rongeur diurne pour sa proximité avec le rythme humain et affirme qu'aucune méthode sans animal ne peut caractériser la prise alimentaire, la retombée en chrononutrition humaine restant hypothétique.

Objectifs

Non seulement la quantité et la nature des aliments ingérés impactent la santé, mais le moment auquel sont pris les repas influence également le bien-être des individus. C'est notamment le cas des personnes qui ont des dîners à haute teneur énergétique et des personnes qui ont des habitudes alimentaires erratiques ou nocturnes chez lesquelles on observe une incidence accrue de diabète de type 2, d'obésité et de maladies cardiovasculaires. Au sein du système nerveux central, une région du cerveau appelée l'hypothalamus est impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire, de la satiété et dans l'équilibre énergétique. Cette région est également responsable de l'organisation temporelle de toutes les fonctions et comportements biologiques car elle héberge une horloge biologique, les noyaux suprachiasmatiques (NSC) , qui donne le tempo à l'ensemble de l'organisme. Lors d'un régime alimentaire déséquilibré, il devient donc pertinent de pouvoir discriminer si les perturbations métaboliques observées viennent d'un déséquilibre dans les quantités d'aliments ingérés ou si elles s'accompagnent également d'une désorganisation temporelle du rythme de prise alimentaire. Le projet vise donc à étudier la chrononutrition chez Arvicanthis ansorgei, un modèle de rongeur diurne qui présente une organisation temporelle de ses fonctions biologiques similaire à celle de l'homme, comme par exemple un éveil diurne, un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. L'objectif sera sur des animaux nourris avec un régime équilibré 1/ de caractériser le rythme journalier de la prise alimentaire (structure temporelle sur 24h des repas, leur nombre et leur durée) ainsi que de la sécrétion des principales hormones métaboliques (insuline, leptine et corticostérone) equi la contrôlent 2/ de réaliser un phénotypage métabolique complet des animaux (volumes d'oxygène consommé et de CO2 rejeté avec calcul du quotient respiratoire et dela dépense énergétique) afijn ensuite d'évaluer les conséquences chez arvicanthis d'une exposition à un régime déséquilibré (graisse ou glucide) sur tous ces paramètres et in fine d'évaluer si les conséquences métaboliques observées sont uniquement dues au régime alimentaire déséquilibré seul ou combiné à une modification spontanée du rythme circadien de la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre d'envisager chez l'homme des traitements basés sur des protocoles de chrononutrition visant à proposer certains aliments à certains moments de la journée sans rompre l'équilibre énergétique. La mise en évidence qu'un régime déséquilibré riche en graisse ou sucre ne conduit pas au développement d'une obésité et d'un diabète de type 2 sur le modèle animal choici pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour de futurs traitements chez l'humain.

Procédures

Lers animaux seront soumis à 3 séries de 8 microprélèvements sanguins (durée de chaque prélèvement = quelques secondes) réalisés sur animal vigile. Chaque série de prélèvements est séparée de la précédente par 8 semaines de récupération. Chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et analgésie (durée quelques minutes). Les animaux seront soumis à 16 semaines de régime alimentaire déséquilibré (gras et sucré).

Impact sur les animaux

Les tests métaboliques réalisés par microprélèvement sanguin pourront induire une douleur aigue et pourraient créer de l'inflammation. L'exposition au régime déséquilibré pendant 16 semaines pourrait induire des perturbations métaboliques pouvant conduire à la mise en place d'une obésit et / ou d'un diabète de type 2.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de caractériser la prise alimentaire (nombre de repas, durée des repas,intervalles entre les repas, quantité de nourriture ingérée), il n'est pas possible d'utiliser des méthodes alternatives. L'animal reste donc le modèle de choix pour mener à bien cette étude.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires au projet (96 animaux sur 5 ans de projet) a été calculé pour permettre d'obtenir des résultats fiables et exploitables statistiquement. Nous avons privilégié une étude longitudinale pour le métabolisme où chaque animal sera son propre contrôle. Les résultats seront analysés par des tests statistiques permettant d'établir l'impact d'un régime déséquilibré sur la prise alimentaire et le métabolisme sur arvicanthis, modèle de rongeur diurne à l'instar de l'humain et établir si arvicanthis pourrait être résistant au diabète et à l'obésité.

Raffinement

Les mâles arvicanthis sont agressifs entre eux et sont donc maintenus en cage individuelle enrichie (bâton et matériel de nidification). Les animaux sont hébergés dans le même pièce ce qui permet de maintenir les contacts olfactifs, visuels et auditifs entre les congénères. Afin de limiter le stress lié à la préhension, arvicanthis étant un animal diurne particulièrement actif, les animaux sont habitués à la manipulation qui est réalisée avec une serviette ce qui permet de prendre les animaux délicatement par le corps. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été définis permettant d'interrompre la procédure et ainsi soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le moment du repas tout comme la quantité d'aliments ingérés ou leur qualité nutritionnelle concourrent au maintien de l'équilibre énergétique et donc au bien-être des individus. Il est donc important pour notre étude d'utiliser un modèle animal dont la niche temporelle de prise des repas se rapproche de celle de l'homme. Arvicanthis Ansorgei est un rongeur diurne qui présente des caractéristiques similaires à l'homme : rythme veille/sommeil avec un éveil diurne et un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. Il s'avère donc être un modèle pertinent pour étudier les conséquences d'un régime déséquilibré sur les rythmes circadiens (hormones, métabolites et gènes horloges). Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 2 à 4 mois afin de travailler sur des animaux mâtures. Pour limiter les variations entre individus il est important pour l'étude de travailler sur des groupes avec un cerveau intégrant les centres régulateurs du comportement alimenatires (hypothalamus notamment mâture).

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et insulinorésistantes par un régime riche en graisses, elles reçoivent dix injections dont un agent mimant l'exposition au froid, subissent sept prélèvements de sang à la queue et des pesées hebdomadaires pendant dix-huit semaines, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à savoir si une protéine, PIEZO1, joue un rôle dans l'apparition de l'obésité, retombée que le porteur formule au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude sur un "organisme entier".

Objectifs

L’obésité et ses complications métaboliques comme l’insulinorésistance et le diabète de type 2 (DT2) sont des problèmes de santé majeurs. L’obésité résulte principalement d’un déséquilibre entre apport et dépense énergétique. Les adipocytes blancs dans le tissu adipeux blanc sont impliqués dans le stockage du surplus énergétique sous forme de graisse. Les adipocytes bruns présents dans le tissu adipeux brun sont des cellules impliquées dans la dissipation de l’énergie sous forme de chaleur, processus appelé thermogenèse non frissonante. Au sein du tissu adipeux blanc sous-cutané coexistent, avec les adipocytes blancs, des adipocytes beiges qui comme les bruns, sont capables de dissiper de l’énergie sous forme de chaleur et dont le nombre augmente en cas de besoin thermogénique. L’obésité entraine des anomalies de fonctions des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et la réactivation de ces adipocytes et/ou l’augmentation de leur nombre permet de corriger les anomalies métaboliques associées à l’obésité. Il existe cependant des lacunes importantes dans la compréhension des mécanismes et dans l’identité des facteurs qui régulent l’activité et/ou la formation des adipocytes thermogéniques bruns et beiges. Il a été récemment montré que ces adipocytes thermogéniques sont des cellules mécanosensibles suggérant que des protéines activées par des stimulations mécaniques puissent contribuer au contrôle des fonctions biologiques de ces cellules. Nous avons récemment découvert que les adipocytes bruns expriment en grande quantité un canal ionique mécanosensible fonctionnel. L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle de ce canal ionique mécanosensible dans la fonction et le développement des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et d'évaluer si son absence dans ces adipocytes thermogéniques conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques. Pour cela nous générerons des souris n'exprimant plus ce canal ionique mécanosensible dans les adipocytes bruns et beiges. Nous étudierons l’impact de l’absence de cette protéine dans ces adipocytes sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en lipides et sur le développement de l'insulinorésistance et du diabète. Nous déterminerons si cette protéine contrôle, in vivo, le développement et/ou la fonction de ces adipocytes thermogéniques.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce programme, nous espérons comprendre si la protéine PIEZO1 joue un rôle dans l’apparition de l’obésité. Si cette hypothèse est vérifiée, ces connaissances pourraient servir à développer des méthodes de prévention et de lutte contre le surpoids et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Tous les animaux (vigiles) sont soumis à : 1) une injection de glucose, une injection d’insuline, 7 injections d’un agent mimant l’exposition au froid, une injection d'anesthésique. Au total 10 injections sur les 18 semaines de la procédure. Chaque injection dure quelques secondes ; 2) sept prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la queue (une quinzaine de secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : 1) obésité et insulinorésistance 2) contraintes des pesées hebdomadaires 3) contention et douleur lors des injections et des prélèvements

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure . Ceci est nécessaire pour prélever les différents tissus et les analyser.

Remplacement

Le diabète et l’obésité sont des maladies d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Ces pathologies affectent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et lipidique. De plus, elles s’expriment àl’échelle d’un organisme et font donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose et des lipides. Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici.

Réduction

Réduction: Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre d’animaux minimum, grâce à l’utilisation d’outils statistiques et de l’expérience d’études précédentes menées dans notre équipe. Nous constituerons des groupes de 10 souris (contrôles et mutées). Le nombre total de souris nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées.

Raffinement

Raffinement : Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : hébergement à 30°C correspondant à leur température de confort (thermoneutralité) ; enrichissement de l’environnement (maisonnettes, buchettes, tiges papier), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur ; surveillance régulière suivie selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris . Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus cette souche est connue pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 18 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 30 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes. Ces durées de régime et stades de développement ont déjà été utilisés dans notre équipe pour étudier l’obésité induite par le régime. Ceci nous permettra de comparer nos résultats aux études précédentes.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs dépôts de graisse (lipectomie) sous anesthésie et deux prises de sang, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur fixe comme point limite une perte de poids rapide de 20 %, seuil déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau souscutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années dans l'équipe. Pour cette étude, nous utiliserons des souris C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ablation des ovaires sous anesthésie pour reproduire la ménopause, toutes reçoivent une alimentation alternant régime standard et régime riche en gras, avec mesures de pression, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par prélèvements à la queue et IRM, avant la mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est d'étudier l'effet des estrogènes sur le développement d'un syndrome métabolique lors de variations cycliques de poids. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'évaluer l'interaction entre les différents organes concernés.

Objectifs

Le surpoids et l’obésité sont des problèmes de santé majeurs. Seules 20% des personnes en surpoids parviennent à une perte de poids durable, avec un risque de cycles répétés de perte et de reprise de poids. Ces variations cycliques du poids sont associées à des modifications de la pression artérielle, du rythme cardiaque et des fonctions rénales, responsables notamment du développement de diabète et de maladies rénales ou cardiovasculaires et induisant une augmentation de la mortalité, en particulier chez les femmes. Le surpoids et l’obésité chez les femmes post-ménopausées constituent des problèmes de santé publics importants. La carence en estrogène renforce le mauvais fonctionnement du métabolisme, prédisposant au développement d’un syndrome métabolique avec notamment le développement d’une obésité, d’une hypertension, d’un diabète de type 2… Récemment il est apparu le concept que notre organisme pourrait garder une mémoire de ces changements que l’on appelle « mémoire métabolique » et pourrait expliquer par exemple la difficulté plus grande de perte de poids après la ménopause. Ce projet a pour but d’évaluer l’impact de variations cycliques de poids sur le développement d’un syndrome métabolique et d’une mémoire métabolique dans des conditions pré et post-ménopauses.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra d’identifier les mécanismes responsables des complications observées chez la femme ménopausée en réponse à des variations cycliques de poids et ouvrira des perspectives pour la mise en place de traitements ciblés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ. Pour la moitié des animaux au cours de cette intervention les ovaires seront retirés, pour l’autre moitié l’intervention sera la même mais les ovaires ne seront pas retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Pour cette intervention chirurgicale, deux injections sous-cutanées d’analgésiques (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, une en préopératoire (1h avant la chirurgie) et une en post-opératoires (24 heures après la chirurgie). Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées à la fin de chaque phase de chaque cycle uniquement pour un lot d’animaux (celui soumis à trois cycles de variations cycliques de régime alimentaire). Ces mesures, réalisées sur animal vigil dure environ 15 minutes. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline. La réalisation de ces tests nécessite que les animaux soient à jeun pour une durée de 6 heures. Durant cette période ils auront accès à l’eau en continu. Une injection intra-péritonéale de glucose ou d’insuline sera réalisée (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection). Une petite incision sera réalisée au niveau de la queue afin de collecter le sang à différents temps après l’injection (15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 90 minutes et 120 minutes). Chaque collecte de sang prend moins de 10 secondes. Une IRM non invasive sera réalisée, sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Il peut exister une douleur post-opératoire qui sera soulagée par des anti-douleurs ; un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline ; un stress lié à la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour mener à bien ce projet. Il n’existe pas de modèle alternatif nous permettant d’évaluer l’interaction entre différents organes ou tissus comme le cœur, la glande surrénale et le tissu adipeux en réponse à des variations de l’apport en gras dans l’alimentation dans un contexte pré et post-ménopause.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste, L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence une différence entre les groupes. Nous utiliserons des approches statistiques adaptée à la comparaison de quatre groupes de petite taille.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cage enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris (hébergement dans des cages de 2 à 5 maximum ; enrichissement des cages avec des maisonnettes, des batônnets en bois et du coton ; nourriture et eau ad libitum, température contrôlée…). Une stratégie antalgique pré et post-opératoire sera mise en place. En pré-opératoire un anti-inflammatoire non stéroïdien (sera injecté 1h avant le début de la chirurgie. En post-opératoire les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet et recevront une nouvelle injection d’anti-inflammatoire non-stéroïdien 24h après la chirurgie. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 8 jours suivant la chirurgie, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier l’effet de modifications de l’apport en gras dans l’alimentation. C’est également un modèle de choix qui est couramment utilisé pour étudier les effets de modifications hormonales telles que l’absence d’œstrogène, reproduisant des conditions post-ménopauses. Les animaux utilisés auront 8 semaines au début de la procédure. Il s’agit de jeunes adultes ayant atteint une maturité sexuelle. A la fin de l’expérimentation qui peut durer jusque 33 semaines, certains des animaux auront 41 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des animaux jeunes au début du protocole afin d’essayer de s’affranchir au maximum de l’effet vieillissement des animaux. Nous pourrons ainsi étudier indépendamment de l’effet vieillissement l’effet de la présence ou non des œstrogènes.

1 080 rongeurs, 864 souris et 216 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète de type 1 est induit par injection de streptozocine, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments, parfois par pompe osmotique implantée, et subissent des tests de glycémie avec prises de sang répétées. Le porteur indique que les administrations et la contention peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces molécules comme sélectionnées après des tests in vitro et destinées à d'éventuels essais cliniques, et prévoit la mort de tous les animaux en fin de procédure.

Objectifs

Le glucose est décrit comme étant le principal carburant de l’organisme, et son taux plasmatique est régulé par l’insuline, une hormone secrétée par les cellules bêta du pancréas. Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose, appelé aussi hyperglycémie, dans le sang. On distingue principalement 2 types de diabète : le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). Le DT1 est due à la détérioration des cellules bêta du pancréas entraînant une carence en insuline, tandis que le DT 2 est causé par une baisse de la production d’insuline ou l’apparition d’une résistance à l’insuline produite. Le DT 1 est une maladie auto-immune, en effet, il fait suite au dysfonctionnement des cellules immunitaires (lymphocytes T), qui se mettent à identifier les cellules bêta du pancréas comme des cellules étrangères et à les éliminer. Le DT1 représente environ 10 pour cent des cas de diabètes, dont la moitié se déclare avant l’âge de 20 ans. Il a une incidence d’environ 15 cas pour 100 000 enfants de moins de 15 ans. L’insulinothérapie est le traitement de référence du DT1, qui consiste à des injections sous-cutanées d’insuline plusieurs fois par jour. Un traitement bien suivi permet le plus souvent de réguler la glycémie, néanmoins, c’est un traitement lourd et chronique, nécessitant en même temps une mesure de la glycémie par le patient plusieurs fois par jour. A noter que c’est un traitement qui permet une prise en charge, et non une guérison, et donc à prendre à vie. Par ailleurs, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter au rythme de 3 à 4 % par an. Ainsi, la recherche continue, soit à décrypter les mécanismes de la maladie pour mieux la prévenir, soit en améliorant les traitements. Ce projet a donc pour objectif de tester des nouveaux candidats médicaments pour le traitement du DT1 chez le rat ou chez la souris.

Bénéfices attendus

Depuis une vingtaine d’année, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter tous les ans, tandis que le traitement de référence reste l’insulinothérapie, un traitement lourd et à vie. Ce projet vise à rechercher et sélectionner les candidats médicaments efficaces pour traiter le DT1 chez l’animal, afin d’obtenir une preuve d’efficacité pour d’éventuels essais cliniques chez l’homme par la suite.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à tester, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. Tout type d’administration sur animal vigil, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute. L’administration à l’aide d’une pompe osmotique dure moins d’un quart d’heure. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour, pendant 1 à 48 semaines). - Une administration intrapéritonéale de streptozocine si le modèle animal requiert l’induction du diabète de type 1. Ce traitement durera 5 jours au maximum avec une administration par jour, réalisé par des personnels tutorés, et dure moins d’une minute. - Un test de supplémentation au glucose ou en insuline (comme réalisé chez l’homme). Ce test consiste à une administration de glucose ou d’insuline, puis à des prélèvements sanguins permettant le dosage de glucose et ou d’insuline dans le sang. Le test est réalisé une seule fois pour chaque animal, et les prélèvements sont réalisés au maximum 5 fois chez la souris et 7 fois chez le rat, dans les 2 heures qui suivent la supplémentation. Chaque prélèvement sanguin par des personnels tutorés dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, et l’implantation de pompe osmotique si besoin - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux vont avoir un diabète de type 1 et ou vont recevoir un traitement contre cette maladie. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Les composés testés dans ce projet sont ceux ayant montré au préalable des effets positifs dans des tests in vitro (screening).

Réduction

Tout d’abord, seuls les composés ayant montré des effets positifs lors des sélections in vitro seront étudiés dans ce projet, limitant le nombre d’animaux à utiliser. Ensuite, selon la littérature et notre expérience, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Et en prenant en compte les exclusions ou pertes potentielles tout au long de l’étude (environ 20 pour cent), 12 animaux par groupe seront étudiés. En considérant que pour l’étude d’un composé pharmacologique, 6 groupes seront nécessaires, et que l’analyse des résultats sera réalisée en 4 mois, 3 sélections sont prévues par an sur 5 ans. Ainsi, le nombre estimé d’animaux est de : 6 groupes d'animaux x 12 animaux par groupe x 3 sélections par an x 5 ans. Soit un total de 1080 animaux, rats et souris confondus. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les animaux sont hébergés à au moins 2 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Une anesthésie, anesthésie et un traitement antibiotique prophylactique sont réalisées si la procédure d’implantation de pompes osmotiques est réalisée.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du diabète. Les rats et les souris sont bien décrites sur le plan physiologique et comportemental, et pour lesquels il existe de nombreux modèles répondants à l’approche thérapeutique envisagé (diabète de type 1). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. L’étude du diabète nécessite l’apparition des caractéristiques qui sont stables et établies au-delà du stade juvénile.

346 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 336 tuées à l'issue et 10 réutilisées comme femelles-stimulus. Elles sont soumises à un régime obésogène et à un mélange de phtalates, à des suivis de glycémie, à une ablation des ovaires puis à des tests comportementaux de cycle œstral, de lordose, de locomotion et de préférence olfactive. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne des douleurs post-opératoires et que gavages et injections provoquent un inconfort. Il précise que des mâles intacts sont utilisés pour les tests sans être comptés dans les effectifs, et conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses comportementales et physiologiques.

Objectifs

Les facteurs externes ou environnementaux, tels que l'exposition à des perturbateurs endocriniens ou le régime alimentaire peuvent interférer avec les effets liés aux stéroïdes sexuels, issus des gonades, sur différents comportements et notamment avec les comportements de reproduction. Les phtalates, dont le principal est le DEHP (Di (2-éthylhexyl) phtalate), sont des perturbateurs endocriniens entrant dans la composition des plastiques et qui contaminent ainsi les aliments ou les produits d’hygiène et de cosmétique. L’exposition orale à l’âge adulte de souris femelles au DEHP, à des doses correspondant à une contamination environnementale, provoque une altération des comportements de reproduction. Ces effets sont associés à une modification des réseaux neuraux de l’hypothalamus impliqués dans le contrôle de ces comportements. Les données concernant l’influence du régime alimentaire, et plus particulièrement de l’obésité, sur les comportements de reproduction sont moins nombreuses bien que l’obésité soit souvent associée à un dysfonctionnement de l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. L’objectif de ce travail s’inscrit dans la perspective de créer un nouveau modèle de « malbouffe » des pays occidentaux en y intégrant les interactions entre le contenant (récipient plastique contenant des phtalates) et le contenu (alimentation riche en lipides et en sucres). Il s’agit d’explorer les effets comportementaux, moléculaires et cellulaires de l’association de ces deux types de perturbation environnementale : l’exposition à des perturbateurs endocriniens et le régime alimentaire obésogène/diabétogène.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans la perspective d’étudier les conséquences d’une des caractéristiques du mode de vie occidental, les effets combinés de l'alimentation et des phtalates, sur la santé reproductive et son contrôle, dans un modèle murin adulte. Il permettra ainsi de faire émerger de nouvelles hypothèses concernant l’origine des altérations de la santé reproductive auxquelles sont confrontées les sociétés occidentales en combinant deux facteurs de l’exposome (régime alimentaire et exposition aux polluants chimiques).

Procédures

336 femelles seront soumises pendant 16 semaines à un régime obésogène/diabétogène et une exposition à un mélange environnementale de phtalates. Ce régime n’induit pas de nuisance particulière si l’accès à la nourriture et à la boisson n’est pas restreint. Ces souris seront soumises à des suivis de glycémie effectués par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue (durée du suivi : 180 minutes maximum et 4 tests de tolérance au glucose et 4 tests de sensibilité à l’insuline répartis sur les 16 semaines de traitement). Parmi ces souris (240), ainsi que pour un groupe-stimulus (10), subiront une ovariectomie et une supplémentation en oestradiol et progestérone. La durée de la chirurgie est au maximum de 10 minutes et elle est pratiquée une seule fois. Les femelles d’étude sont soumises à différents tests comportementaux afin de suivre leur cycle oestral (1 frottis par jour de la semaine 12 à la semaine 16), et d’étudier les paramètres de leur comportement d’accouplement (2 tests de lordose de 30 minutes en semaines 12 et 14, 1 test de locomotion de 2h en semaine 13 et 1 test de préférence olfactive de 3 fois 10 minutes en semaine 15) avant d’examiner les modifications des structures cérébrales les contrôlant.

Impact sur les animaux

Lors des tests de tolérance au glucose le gavage oral peut engendrer un inconfort, tout comme l’administration d’insuline IP (douleur au point de piqure) lors des tests de sensibilité à l’insuline. Le suivi de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue qui peut engendrer une douleur légère et passagère au moment de l’incision. La procédure d’ovariectomie donne lieu à des douleurs post-opératoires. L’administration sous-cutanée de progestérone peut entrainer une légère douleur au point de piqure. Les souris-stimulus utilisées pour les expériences de comportement peuvent subir une légère douleur au point de piqure lors de l’anesthésie par voie IP.

Devenir

souris euthanasiées pour prélèvement de tissus et dosages biologiques (total : 336).

Remplacement

Il s'agit d'un projet comportant des analyses comportementales et des mesures de paramètres physiologiques : il n'est pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Les effectifs (total : 346 femelles) ont été calculés au plus juste afin de pouvoir obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de tests pertinents. Cohorte 1 : 4 groupes de 8 femelles, expériences répétées 3 fois soit un total de 96 femelles Cohorte 2 : 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications protéiques et 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications des acides nucléiques, soit un total de 240 femelles. A ces deux cohortes expérimentales, s’ajoute un groupe supplémentaire constitué de femelles-stimuli (femelles ovariectomisées et supplémentées en œstradiol et progestérone) nécessaires au test de préférence olfactive : 10 femelles. Les procédures de comportement sexuel et de préférence olfactive nécessitent d'utiliser des mâles intacts : ce sont des mâles qui ne subissent aucune contrainte ; ils n’ont donc pas été inclus dans le décompte des animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux ad hoc, respectant la Directive 2010/63/UE. Les animaux sont surveillés quotidiennement et tout signe de mal-être est immédiatement signalé aux responsables du projet qui prennent la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement. La durée du jeûne lors des tests de glycémie a été réduite afin de limiter l’hypoglycémie. Pour les animaux subissant une procédure chirurgicale, des points limites adaptés permettent de gérer la douleur post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour ces études : c'est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet ainsi de comparer les résultats obtenus avec la littérature et d'affiner nos hypothèses de travail. Il s’agit d’une étude chez l’adulte.