Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
62 764 souris vont être utilisées dans une procédure d'identification et de génotypage impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit un tatouage aux doigts et une amputation du bout de la queue sans anesthésie, la contention constituant la principale source de stress. Le devenir dépend du génotype, une partie rejoignant d'autres protocoles ou l'élevage, une autre étant tuée dès le sevrage faute d'utilisation possible ou une fois trop âgée pour la reproduction. Le porteur affirme que les prélèvements salivaires ou pileux ne sont pas assez fiables et présente le tatouage et la biopsie de queue comme les seules méthodes "aussi performantes".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par tatouage aux doigts et caractérisés à l’aide du prélèvement du bout de la queue. Cette DAP d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres DAP) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour • la formation, • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de DAP).
Bénéfices attendus
Le génotypage est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le génotype est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure, puis leur devenir est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation (hors champs DAP) d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite (par décapitation ou dislocation cervicale selon l'âge)
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours selon la règlementation européenne.
Validation des effets bénéfiques d’ILV01, un composant du sécrétome musculaire, sur la greffe d’îlots pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 167 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant des prélèvements sous anesthésie sans réveil. Un diabète est induit par injection, des cellules pancréatiques sont prélevées chirurgicalement puis réimplantées dans le foie, et chaque animal subit jusqu'à 148 mesures de glycémie, 84 injections d'insuline, 84 injections du traitement testé et 22 prises de sang. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des nécroses de la queue et des hémorragies liées aux prélèvements répétés. Le projet teste une myokine pour réduire le nombre de pancréas nécessaires à une greffe d'îlots, étape présentée comme 'indispensable' avant la clinique.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules β pancréatique (sécrétant l’insuline) et une hyperglycémie. L'une des thérapeutiques proposées pour les patients DT1 est l'injection dans le foie d'îlots pancréatiques. En effet, la greffe d'îlots est une approche prometteuse permettant une quasi-normalisation du contrôle glycémique, qui prévient des évènements hypoglycémiques sévères et qui améliore significativement la qualité de vie du patient DT1. Cependant, cette thérapie se heurte à de nombreux obstacles qui la rende encore difficilement proposable à un grand nombre de patients diabétiques. En effet, durant toute la procédure de greffe, c’est-à-dire du donneur de pancréas, à l’isolement des îlots pancréatiques et jusqu’à la période post transplantation, la quantité d’îlots fonctionnelle ne cesse de diminuer. Cette perte peut s’expliquer par l’induction de mécanismes de mort cellulaire, de la perte de fonction des îlots tout au long des étapes de la greffe, par les réactions inflammatoires, par les réactions de rejets et par la trop longue période de revascularisation des îlots post greffe. Il en résulte qu'en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour greffer un patient et améliorer sa régulation glycémique. Ainsi, il est important de développer de nouvelles stratégies pour améliorer cette approche thérapeutique et réduire ce trop grand nombre de pancréas à utiliser afin de la proposer à un plus grand nombre de patients DT1. Dans cet optique, nous nous sommes intéressés aux myokines, qui sont des molécules sécrétées par le muscle et régulées par l’exercice physique. Parmi celle-ci, nous avons identifié ILV01. Lors d'une étude précédente, nous avons montré que cette myokine représentait un candidat d’intérêt pour améliorer l’efficacité de la greffe d’îlots car, in vitro, elle améliore la survie et la fonction des îlots pancréatiques (Rat et humain) et in vivo (Rat), elle améliore la fonction du greffon, elle permet une prise rapide et durable dans le temps de la greffe. Ainsi pour la suite du projet, nous souhaitons, dans un premier temps, déterminer si ILV01 permet de diminuer la quantité d’îlots à greffer pour réverser le diabète. Dans un second temps, en fonction des données obtenues lors de l’étape précédente, nous souhaitons valider in vivo ILV01 dans le cadre d’une greffe d’îlots humain chez le Rat immunodéficient. Enfin, ce projet est indispensable avant de passer en essai clinique.
Bénéfices attendus
La transplantation d'îlots est un traitement prometteur pour le diabète de type 1 car elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères, la normalisation des niveaux d'hémoglobine glyquée et permet de retarder ou d’atténuer les complications du diabète. Par ailleurs, cette approche thérapeutique est déjà approuvée et remboursable via divers systèmes nationaux de santé dans plusieurs pays, dont le Canada, l'Australie, le Royaume-Uni, la Suisse, l'Italie et la France. Néanmoins, actuellement, en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour réverser le diabète dû à la grande perte de la masse fonctionnelle d'îlots au cours des différentes étapes du processus de la greffe. Au vue de la grande pénurie d'organe, cette approche est encore difficilement proposable à tous les patients diabétiques nécessitant un greffe (raison vitale). Nos premières études in vitro et in vivo ont démontré qu’ILV01 améliorait considérablement la survie et la fonction des îlots chez le rat. Ce nouveau projet a tout d'abord pour objectif de déterminer si le traitement avec ILV01 permet de réduire la quantité d'îlots à injecter pour normaliser la glycémie du rat diabétique. Au vu de nos premiers résultats, nous supposons qu'avec notre traitement nous pourrions transplanter plus de patient que ce qui est possible aujourd'hui et ce projet pourra répondre à cette hypothèse. Par ailleurs, cette étude permettra de valider in vivo l'efficacité de notre ILV01 sur les îlots humain grâce à un modèle de rat immunodéficient. Enfin, ce projet sera le tremplin vers une étude clinique.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Les cellules pancréatiques seront prélevées par approche chirurgicale sous anesthésie/analgésie profonde sans réveil (durée 5 minutes) et seront ensuite réimplantés 24h plus tard dans le foie par approche chirurgicale sous anesthésie et analgésie profonde (durée 10 minutes par animal). Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de la greffe (148 fois/animal). Une partie de l’évaluation de l’efficacité de la greffe nécessitera de réaliser une injection de glucose aux animaux (8 injections/animal sur 84 jours, durée 1 minute). De plus, les animaux recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après greffe (durée 1 minute). Par ailleurs, 296 animaux de l’étude recevront en plus de ce qui est décrit ci-avant 1 injection quotidienne de notre traitement soit 84 injections/animal (durée 1 minute). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement sur la greffe, 22 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (sous anesthésie locale, 2 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de notre traitement et d'insuline. - Douleurs post-opératoires à la suite des chirurgies (laparotomie puis injection intraportale d'îlots pancréatiques). - Risque d’infection post-greffe. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie post section de la queue. - Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. - Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (Mesures de glycémie, injections, prises de sang). - Périodes de mise à jeun.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons valider notre traitement sur la fonction d'une greffe d'îlots pancréatique chez un sujet diabétique. Or, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier la fonction d'un greffon d'îlots, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux nécessaire pour la réalisation des groupes que nous avons indiqué correspond au nombre nécessaire d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études métaboliques réalisées sur des rats rendus diabétiques dans le cadre de transplantation d’îlots pancréatiques. Cette étude nécessitera 1167 rats.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Concernant les animaux immunodéficients, ceux-ci seront hébergés en cage ventilée. Par ailleurs, la litière, les cages, les éléments d’enrichissement seront stérilisés avant utilisation. De même, il sera utilisé de la nourriture irradiée et de l’eau filtrée. Toute intervention sur ces animaux sera réalisée sous hotte stérile (changes et expérimentations), avec du matériel stérile et une surveillance augmentée par rapport à des animaux standards sera effectuée (au moins 2 fois par jour). Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude. Les actes chirurgicaux et les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie analgésie profonde. De plus, la chirurgie et les tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement, ne seront effectués que 2h après avoir placé les animaux dans la salle où aura lieu l’expérimentation, afin de diminuer le stress. Enfin, tout acte sur l’animal sera réalisé par du personnel expérimenté afin de réduire au maximum la durée des interventions et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète et la transplantation d’îlots pancréatiques. En effet, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, les rats ont été préférés aux souris à cause de leur taille permettant une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. Poids idéal pour le prélèvement des pancréas, la réalisation des chirurgies et de nos tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement.
Rôle de l’hépatokine FGL1 dans le foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
4 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le rôle d'une protéine du foie dans les maladies hépatiques et la surcharge en fer. Elles subissent régime gras, injections intrapéritonéales, gavages, prélèvements de sang par amputation du bout de la queue, ponctions au plexus oculaire, irradiation et injections pour créer des chimères. Le porteur ne décrit qu'une 'douleur légère de courte durée' malgré ces gestes répétés, et justifie l'effectif par la variabilité biologique. Les modèles murins sont présentés comme la 'seule solution' pour obtenir des données pertinentes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la physiopathologie des maladies hépatiques (NAFLD, NASH, hépatocarcinome) et de l’anémie afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La stéatopathie non alcoolique ou NAFLD (Nonalcoholic fatty liver disease) est une manifestation hépatique du syndrome métabolique qui affecte 25% des adultes dans le monde. Cliniquement, la NAFLD se définit par une accumulation de lipides dans plus de 5% des hépatocytes (les principales cellules du foie) en l’absence d’atteintes hépatiques et une cascade pathologique d’une stéatose asymptomatique vers une stéatohépatite ou NASH (nonalcoholic steatohepatitis). La NASH associe la stéatose à une inflammation, une ballonisation des hépatocytes et des processus cicatriciels conduisant à une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire (CHC). Alors que les stades NAFLD et NASH sont réversibles, le stade de cirrhose est irréversible et menace le pronostic vital du patient. A ce jour, il n’existe pas de traitement pharmacologique efficace contre le CHC. Des niveaux élevés de FGL1 (Fibrinogen like 1 protein) ont été observés chez des patients atteints de NAFLD et les taux sériques de FGL1 sont corrélés à un mauvais pronostic chez les patients atteins de cancers. En effet, FGL1 favoriserait la progression tumorale et l’échappement immunitaire dans de nombreux cancers (prostate, poumon, mélanome…). L’invalidation de Fgl1 chez la souris conduit au développement d’une obésité associée à une intolérance au glucose. Cependant, le rôle de FGL1 dans l’installation et la progression de la NAFLD et la carcinogenèse hépatique est inconnu. Le premier objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de FGL1 dans la stéatose et la carcinogénèse hépatique. D'autre part, FGL1 joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme du fer. Une augmentation de la synthèse de FGL1 contribuerait à l’installation d’une surcharge en fer dans le foie et le cœur avec pour conséquences des dommages tissulaires irréversibles chez les patients atteints de thalassémies. Cette surcharge en fer constitue la première cause de mortalité chez ces patients et il n’existe pas de traitement efficace à ce jour. Le second objectif du projet est de confirmer le rôle de FGL1 dans la régulation du métabolisme du fer et de tester le potentiel thérapeutique de son inhibition dans un contexte thalassémique.
Bénéfices attendus
On estime que 1 million de personnes seront atteintes d’un cancer du foie en 2025 dont 90% de CHC. De même, des centaines de milliers de personnes souffrent de thalassémie dans le monde. Face au manque de traitement efficace, il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques. Ce projet explorera pour la première fois la contribution de FGL1 au cours du développement de la stéatose vers le CHC et au cours de l'installation de la surcharge en fer en contexte thalassémique. La manipulation de FGL1 pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique pour ces pathologies.
Procédures
Stéatose: régime western diet . Hépatocarcinome: Injection intra-péritonéale hebdomadaire + régime western diet. Mise à jeun : aucun traitement. Traitement FGL1 : injection intra-péritonéale. Tolérance au glucose : gavage oral et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Tolérance à l’insuline : injection intra-péritonéale et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Tolérance au pyruvate : injection intra-péritonéale et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Sécrétion des lipoprotéines hépatiques : injection intra-veineuse et prélèvement de sang par amputation distale de la queue. Clairance des triglycérides : gavage oral et prélèvement de sang par amputation distale de la queue. Phlébotomies : prélèvement au plexus oculaire et injection intra-péritonéale. Chimères hématopoïétiques : Irradiation et injection intra-veineuse. Mises au point ASO : injection intra-péritonéale. ASO thérapie : injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Les animaux seront traités par injection intrapéritonéale, IV, gavage ou prélèvement sanguin et ressentiront potentiellement une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire.
Remplacement
Le développement et la mise en place de la NAFLD et de la surcharge en fer chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeux de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins génétiquement modifiés miment les pathologies humaines et sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une pertinence physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (thalassémie, NAFLD, NASH ou CHC). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris ont accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum. Elles ont du papier ou du coton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Néanmoins, nous avons mis en place des critères d'arrêt par rapport à la souffrance potentielle des souris durant l'expérimentation. Les souris sont contrôlées tous les jours, voire deux fois par jour. Les critères suivants sont pris en compte : - perte de poids est supérieure à 20% du poids initial - activité extrême (grattage ou léchage anorml) - posture prostrée - aspect (amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures et écoulements) - absence de toilettage et diminution de l'appétit - anomalies de la respiration (rythme et mouvements) - hypo ou hyperthermie Si l'un de ces critères est atteint, l'expérimentation est immédiatement arrêtée et les souris sont euthanasiées. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal).
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (thalassémie, Obésité, NAFLD, NASH et CHC). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Cibler la signalisation mTORC1 des cellules gliales pour limiter la neuroinflammation hypothalamique dans le développement de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 356 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie du crâne ou une chirurgie vasculaire, des tests métaboliques avec prélèvements sanguins, un régime gras, des mises à jeun de vingt-quatre heures et une exposition au froid, ainsi que des isolements en cage individuelle, avant mise à mort pour prélever des tissus. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires liées à l'incision du crâne et un stress d'isolement et de contention, l'objectif étant d'étudier le rôle des cellules immunitaires du cerveau dans l'obésité. Sur le remplacement, il affirme que ces interactions entre le cerveau et les organes ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Dans le cerveau, on trouve des neurones qui sont sensibles à des signaux (hormones, sucres, graisses…) qui les renseignent sur l’état énergétique global de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses entraîne une inflammation du cerveau. La microglie, qui forme les cellules immunitaires du cerveau, est impliquée dans la régulation du poids corporel. Elle participe à la mise en place de l’'inflammation cérébrale lors de la consommation d'un régime gras. Son activation est variable en fonction de la longueur de la consommation du régime (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués restent mal connus. Nous allons étudier deux molécules qui agissent sur l'activation de la microglie afin de déterminer si elles sont importantes pour la mise en place de l'inflammation cérébrale.
Bénéfices attendus
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires du cerveau (microglies) dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime gras riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.
Procédures
Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1356 animaux). 2) Neuro-chirurgie : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (60-75 minutes, 384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une deuxième chirurgie (60-75 minutes, 96 animaux) et une troisième anesthésie (45 minutes, les mêmes 96 animaux). 3) Chirurgie vasculaire : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule chirurgie vasculaire sera effectuée dans la vie de l’animal (30 minutes, 204 animaux). 3) Test de tolérance au glucose/insuline/pyruvate et clamp hyperglycémique : réalisé sur souris vigiles. Maximum 10 prélèvements sanguins de 10µl. Un seul test de chaque type sera réalisé durant toute l’étude (120 minutes, 492 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (288 animaux concernés au maximum) : isolement de l’animal vigile en cage individuelle enrichies (pendant deux semaines).
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Certains animaux subiront un stress métabolique lors de la mise à jeun pendant 24h et les 24h à une température de 4°C. Les prélèvements sanguins (maximum de 44 µl prélevés en une journée) peuvent induire une gêne passagère. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.
Devenir
À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, nous avons adapté le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 24 semaines et seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique et une chirurgie vasculaire, qui seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
LLa régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 24 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 ou 25 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.
Rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire chez la souris femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
144 souris femelles vont être utilisées dans une chirurgie terminale menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune subit un acte unique de vingt minutes suivi du prélèvement du cerveau, pour analyser la morphologie des neurones de l'hypothalamus à différents âges entre le dixième et le soixantième jour de vie. Le porteur décrit un inconfort limité à la contention et à l'injection, et renvoie les retombées à de meilleurs traitements des troubles de la puberté et de troubles psychiatriques. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un réseau neuronal complexe dans l'"organisme entier" exige l'animal vivant.
Objectifs
La puberté est une période critique de développement aboutissant à la maturité sexuelle. C’est un moment de plasticité cérébrale intense, associé à de considérables changements hormonaux, neuraux et comportementaux. Cela est d’autant plus important que la perturbation de l’initiation de la puberté est associée à un risque plus élevé de développer de nombreuses maladies neurologiques. La puberté est déclenchée par la réactivation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. L'augmentation pubertaire de la sécrétion des stéroïdes sexuels et la localisation cérébrale des récepteurs des œstrogènes suggère un rôle clé de l’œstradiol dans les changements qui ont lieu à la puberté. L'objectif de ce projet est d'étudier les changements de plasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire. Des souris femelles seront utilisées afin d’étudier la morphologie neuronale au cours du développement hypothalamique et d’identifier les périodes les plus sensibles aux changements hormonaux.
Bénéfices attendus
Les données obtenues contribueront à déterminer les périodes clés de plasticité du cerveau et le rôle des œstrogènes pubertaires dans ces processus. Ceci est particulièrement pertinent dans le contexte du développement de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Les animaux (n=144) subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. Les produits administrés pour l’anesthésie, l’analgésie et l’euthanasie n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection (piqure de l’aiguille).
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et morphologiques.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire femelle nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives..
Réduction
Les effectifs utilisés (144 animaux au total) ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...) et de données dans la littérature permettant, d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Ce projet utilisera des femelles à différents jours postnataux (JPN) : JPN10, JPN15, JPN20, JPN25, JPN30, JPN35, JPN40, JPN45 et JPN60. Cela apportera de nouvelles connaissances quant aux changements cérébraux qui ont lieu en particulier dans l’hypothalamus au cours du développement postnatal et pubertaire.
Etude des interactions entre la signalisation oestrogénique et circadienne pour l’amélioration du traitement de la ménopause
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 248 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant cinq jours, une partie subissant l'ablation des ovaires pour reproduire la ménopause et la pose d'une capsule hormonale sous la peau, avec isolement en cage individuelle pour mesurer l'activité sur roue. Le porteur indique un stress comportemental lié à la modification des rythmes et à l'isolement, sans douleur selon lui, avant mise à mort pour prélever foie, utérus, aorte et cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets multiples des oestrogènes ne sont pas modélisables in vitro et qu'aucune stratégie de remplacement ne répond au projet.
Objectifs
De nombreuses études ont montré un lien potentiel entre la signalisation oestrogéniques et les rythmes circadiens mais les mécanismes moléculaires sont inconnus, ce qui pourrait pourtant avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. Afin de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, les objectifs de ce projet sont de : 1) Evaluer l'impact d'un traitement oestrogénique sur les rythmes circadiens ; 2) Evaluer le rôle de la régulation circadienne sur la signalisation des oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. En effet, l'interaction entre la signalisation oestrogénique et les rythmes circadiens représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions cardiovasculaires et métaboliques ainsi que les symptomes climatériques et le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées et les travailleurs de nuit.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à la procédure d'injection de tamoxifène (5 jours d'injection par IP). De plus, certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène seule ; 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène et l'ovariectomie et 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène, l'ovariectomie et la pose de pellets.
Impact sur les animaux
La modifications des rythmes circadiens ainsi que l'induction d'un syndrome métabolique par une régime hypercalorique va challenger la physiologie des souris et peut donc induire un stress comportemental chez les souris mais pas de douleurs. De plus, l'étude des rythmes circadiens nécessite l'isolement en cage individuelle des souris afin d'avaluer leur activité locomotrice sur roues. En effet, cet appareillage est présent dans l'établissement utilisateur et il n'existe pas d'alternative dans l'établissement utilisateur, sachant que le statut sanitaire des animaux (hébergés en animalerie conventionelle) ne permet pas de les transférer dans un autre établissement.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (foie, utérus, aorte, cerveaux) et réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. De même, les rythmes circadiens font intervenir de nombreux tissus dont l'horloge centrale dans l'hypothalamus intégrant le signal jour/nuit régulant les rythmes circadiens. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques circadiens des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons uniquement les femelles car ce projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques (procédures 1 à 6) alors que pour les études d'expression génique uniquement (procédures 7 à 12), les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 5 animaux étaient requis.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. L'étude des rythmes circadiens nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur rythme circadien car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront hebergés dans une pièce spécifique en cycle inversé afin de manipuler les animaux pendant leur phase d'éveil quand la lumière est éteinte. Cette inversion du cycle jour/nuit plus adapté à l'expérimentation sur les animaux nocturnes participera au bien-être animal. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes et des gènes REVERBs. De plus, afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.
Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux suite à une injection unique
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.
Procédures
1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Carbamylation et stockage tissulaire du Sodium chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit du cyanate de sodium dans l'eau de boisson et subit des séances d'IRM une à deux fois par semaine de la dixième à la vingt-et-unième semaine, huit autres subissant une ablation partielle du rein pour reproduire une insuffisance rénale chronique, avant mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et une modification des protéines de ce tissu, au bénéfice d'une meilleure compréhension de l'insuffisance rénale chronique renvoyée à un horizon lointain. Sur le remplacement, il indique que l'IRM humaine ne serait pas assez sensible et que le phénomène ne peut pas s'analyser in vitro, concluant à la contrainte d'utiliser la souris.
Objectifs
Le corps humain est composé de 60% de liquide. Classiquement on considère que c’est la différence entre les entrées de sel (alimentation, boisson) et les sorties de sodium (urines, sueur, selles) qui permet de maintenir à l’équilibre les différents compartiments liquidiens. Cette vision classique fait donc un lien simple entre le stock en sodium et le stock en liquide, où un bilan positif en sodium s’accompagne d’une augmentation du volume liquidien en dehors des cellules. Cependant, différentes études ont mis en évidence que l’augmentation du stock en sel n’entraine pas systématiquement d’augmenation du stock de liquide. Ces constations ont conduit à la mise en évidence de zones de stockage de sel au niveau cutané et musculaire . Les voies de régulation de ces stocks sont semblent être modifiés dans différentes maladies. Les objectifs de notre projet visent à étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et la carbamylation des protéines de ce tissu . Nous faisons l’hypothèse que la carbamylation de ces protéines modifie le stockage du sodium dans ce tissu. . Le CDP le plus caractéristique est l'homocitrulline. Les protéines carbamylées s’accumulent dans la peau et les muscles avec l’âge, cette accumulation s’intensifie dans certaines conditions pathologiques comme la maladie rénale chronique.
Bénéfices attendus
En analysant l’effet de la carbamylation des tissus sur le stockage du sel sous la peau, notre projet permettra de poursuivre la caractérisation de ce compartiment de réserve en sel de l’organisme. La carbamylation étant amplifiée au cours de l’insuffisance rénale chronique nous pourrons envisager l’impact de cette modification biochimique sur l’accumulation cutané de sel dans cette pathologique et sa répartition entre peau et muscle, ce qui permettra de mieux comprendre cette maladie au cours de laquelle la gestion du sel de l’organisme est d’une grande importance (problème d’oedèmes, d’oedème aigu du poumon, d’hypertension artérielle).
Procédures
Pour les animaux avec le régine cyanate de sodium, les 6 animaux alimentés en cyanate de Na (0,5 mM) via l’eau de boisson et les 6 animaux alimentés en NaCl (0,5 mM) via l’eau de boisson seront eront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21) Si les résultats obtenus avec le cyanate démontrent une modification des concentrations sodiques tissulaires par IRM (imagerie par resonance magnétique), un protocole d'IRC (insuffisance rénale chronique) sera alors envisagé. Pour cela, 8 animaux seront opérés (néphrectomie subtotale), et 6 animaux seront nécessaires pour les animaux contrôles IRC, donc au total : Les 12 animaux seront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21)
Impact sur les animaux
Les animaux seront sous anesthésie générale (Isoflurane) durant les manipulations, puis euthanasiés en fin de protocole, nous ne pensons pas qu'il y aura des complications ou d'effets secondaires suite au régime sous cyanate de sodium. Par ailleurs, le modèle basé sur l'ajout de cyanate de sodium dans l'eau de boisson des souris a déjà été validé et utilisé précédemment dans d'autres projets de l'équipe. Les souris recevant ce traitement n'ont jamais montré quelconque signe de souffrance ou effet secondaire
Devenir
Les animaux seront euthanasié en fin de procédure afin de recupérer les tissus nous permettant de réaliser des expériences d'immunohistochimie.
Remplacement
Ce projet ne peut pas être remplacé par une étude clinque basée sur l'utilisation de patients insuffisants chroniques car la sensibilité des IRM pour l'imagerie humaines n'est pas assez sensible. Nous étudions un système complexe qui ne permet pas d’analyser le phénomène in vitro également. En effet l’accumulation de sodium tissulaire est régulée par les systèmes immunitaire et lymphatique. Un régime riche en sodium augmente la synthèse, la polymérisation et la sulfatation des glycosaminoglycanes et stimule la croissance des vaisseaux lymphatiques ce qui favorise la clairance du sodium stocké en sous-cutané. L’impact de la carbamylation des protéines de la matrice extra cellulaire sur ce phénomène n’est pas connu.
Réduction
Un calcul de puissance statistique a été effectué pour utiliser le nombre minimal mais suffisant pour observer une une différence significative entre les différents groupes. Nous prévoyons d'utiliser pour cela, au maximum, un nombre de 26 animaux.
Raffinement
Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages à raison de 3 souris par cage au maximum. En cas d'affrontement entre les animaux, le nombre de souris par cage sera réduit en conséquence. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (igloos, tubes en carton, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 10 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du bien-être animal et les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de l'expérience , de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié. L'utilisation de l’IRM est également à la base de ce projet . Il s'agit d' une technique d’imagerie préclinique non invasive permettant de réaliser un suivi longitudinal du même animal. Concernant les animaux IRC, une injection d'analgesique sera réalisée avant le début de l’intervention pour la néphrectomie et sera répétée après 12h (2x/jours) et appliquée sur une durée de 3 jours).
Choix des espèces
Le modèle de nephrectomie a été développé chez la souris et l'antenne Na de l'IRM également ce qui nous contraint a utilisé uniquement cette espèce. En référence à nos résultats antérieurs, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines pour réaliser la néphrectomie.
Le rat Goto Kakizaki un modèle d’étude du syndrome des ovaires polykystiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces rattes Goto-Kakizaki, présentées comme un modèle spontané du syndrome des ovaires polykystiques, subissent des frottis vaginaux, des injections d'un anticorps pendant la gestation et des prélèvements sanguins répétés, y compris des tests de tolérance au glucose, pour étudier le développement du syndrome et tester un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance des injections et met à mort tous les animaux pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.
Objectifs
Le Syndrome des Ovaires polykystiques (SOPK) est la principale cause d’infertilité féminine et elle est associée à de nombreuses comorbidités telles que le diabète et les maladies cardiovasculaires. Les hommes apparentés aux femmes ayant ce syndrome présentent des taux d’androgènes élevés et des désordres métaboliques. Il s’agit de plus d’une maladie à fort caractère transmissible par les mères à leurs filles et fils, sans qu’aucun diagnostic puisse être établi précocément puisque l'origine de ce syndrome reste méconnu. Or nous avons mis en évidence récemment que les rattes Goto-Kakizaki, modèle de diabète de type 2 très connu, constituent le premier modèle rongeur spontané du syndrome des ovaires polykystiques. Notre projet est d'utiliser ce modèle de rattes GK afin de mieux comprendre l'éthiologie de ce syndrome en analysant le développement de ce syndrome dès le stade foetal. De plus, nous avons développé un anticorps bloquant les effets de l'hormone Anti-Müllérienne (AMH) qui est suspectée d'induire une hyperandrogénie et une anovulation chez les patientes présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Nous proposons donc de traiter des rattes GK avec cet anticorps pendant la gestation pour comprendre le rôle de l'AMH dans le développement du phénotype et à l'âge adulte à des fins thérapeutiques pour normaliser les taux circulants d'androgènes et pour induire une ovulation.
Bénéfices attendus
Pouvoir analyser et comprendre les altérations developpementales chez la descendance de mères SOPK afin d'améliorer par la suite la possibilité de prise en charge des patientes SOPK au cours de la grossesse. Actuellement les patientes SOPK sont traitées de manière symptomatique : soit pour traiter leur infertilité, soit pour traiter l'hyperandrogénie, soit pour traiter les troubles du métabolisme en particulier le diabète. Le traitement que nous proposons de tester permettrait: - d'une part de corriger l'infertilité chez les 25% de patientes SOPK résistantes aux traitements actuels et d'éviter le risque d'hyperstimulation ovarienne induit par les traitements utilisés en PMA (procréation médicalement assistée) - d'autre part de corriger l'hyperandrogénie - d'autre part d'améliorer les anomalies métaboliques.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements de sang de 100 microlitres (environ 5 minutes par prélèvement). Pour l'ipGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres (environ 1 minute par prélèvement) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés. Pour l’ipITT, une goutte de sang (10 microlitres, moins d'une minute par prélèvement) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés d’au moins 3 jours pour permettre la récupération.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection en sous cutanée, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins qui seront nécessaires (100 microlitres/rat une fois par semaine sur 3 semaines pour les gestantes et les traitées et sur 5 semaines consécutives pour le lot étudié entre 4 et 8 semaines) le volume de sang prélevé à chaque prise de sang sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les analyses histologiques de différents tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et l'avantage du rat GK réside dans le fait que c'est un modèle de diabète de type 2 sans manipulation génétique et mimant certains aspects du syndrome SOPK humain. Ainsi sur le plan scientifique il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum grace à l'utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation de sorte à réduire le stress. Les prélèvements sanguins représentent moins de 5% du volume sanguin total et sont suffisamment espacés dans le temps pour ne pas induire une détresse chez l'animal. Les injections d'anticorps ne gènèrent pas de souffrance pour l'animal. Cependant, les animaux seront suivi toutes les 48h durant le traitement et si des signes de mal-être apparaissent tels que, prostration,poils hirsute et perte de poids, les animaux seront isolés et gardés en observation. Si la perte de poids est supérieure à 15% du poids de l'animal il sera eutahanasié.
Choix des espèces
Le rat GK est le seul model rongeur disponible developpant spontanémant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le rat une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour permettre des mesures physiologiques pratiques. Les stades foetal (18,5 jpc), post natal(5 jours), pubertère et adulte ont été choisis puisque l'environnement maternel SOPK est fortement suspecté de contribuer au dévéloppement de ce phénotype qui apparait progressivement depuis le stade foetal.
Effet curatif de deux plantes médicinales, MA et AA, issues de la tradithérapie tunisienne, sur l’amélioration des paramètres métaboliques chez le rongeur présentant un diabète de type 2.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 72
442 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques puis gavés quotidiennement pendant cinq semaines, avec une quinzaine de prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. L'objectif est de tester deux plantes de la tradithérapie tunisienne comme antidiabétiques. Le porteur affirme que l'équilibre énergétique et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro et que le rongeur reste un "modèle de référence".
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) touche 90% des personnes diabétiques, principalement au-delà de 40 ans, souvent en surpoids ou obèse, qui ont un régime alimentaire déséquilibré (trop riche en gras et en sucres) et/ou dont l’activité physique est insuffisante. Cette maladie métabolique est caractérisée par un excès chronique de sucre dans le sang Parmi les nouveaux axes de recherche pour traiter le DT2, émergent des alternatives thérapeutiques, préventives et curatives. Parmi ces alternatives thérapeutiques, la tradithérapie offre un panel de substances naturelles méconnues dont les effets n’ont été que très peu caractérisés de façon préclinique et clinique, bien qu’elles soient, localement, couramment utilisées par l’Homme. Ainsi, deux plantes médicinales ont été identifiées comme ayant des caractéristiques phytochimiques intéressantes pour prévenir et traiter le DT2 (ces plantes sont nommées ici MA et AA pour des raisons confidentielles). Spécifiquement, le but du projet sera d’établir chez l’animal diabétique: 1) Si le traitement par MA ou AA présente un effet-dose sur l’amélioration de la glycémie et de comparer ce traitement chronique à des anti-diabétiques déjà sur le marché. 2) Si une unique dose de la plante est suffisante pour améliorer la tolérance au glucose 3) Si les fractionnements successifs des composés de la plante reproduisent les effets anti-diabétiques observés, en vue d’isoler le(s) principe(s) actif(s).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser un nouvel antidiabétique issu de plantes pris par voie orale et d’isoler le (les) principe(s) actif(s)
Procédures
Les animaux seront soumis au traitement antidiabétique par gavage : un par jour pendant 5 semaines, avec un volume de 250 µl/souris ou un volume de 1,5 ml chez le rat. des prélèvements de sang seront effectués : un par semaine afin d'évaluer l'effet du traitement, 5 les jours de test : soit 15 prélèvements au total pour 3 tests.
Impact sur les animaux
Les nuisances dues aux déifférents traitements seront : Au début du traitement par gavage : du stress, Une douleur locale et passagère lors de l'injection intrapéritonéale ainsi que lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les tissus gluco-sensibles seront prélevés pour divers dosages
Remplacement
L’étude des variations de la glycémie, de l’insulinémie ne peut être réalisée que sur des animaux vivants, ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L’étape de caractérisation des effets sur la sécrétion d’insuline a déjà été faite sur des lignées de cellules pancréatiques mais les effets sur les autres organes insulino-sensibles sont indispensables à caractériser. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. L’étude du métabolisme implique plusieurs organes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ce projet sera réalisé chez la souris mais aussi chez le rat, qui constituent des modèles de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques.
Réduction
Nous utiliserons des tests statistiques permettant de détecter les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour calculer l’échantillon représentant la population, et suffisant pour détecter des différences. Chaque fois que ce nombre pourra être réduit, le nombre d’animaux utilisé sera diminué. Chaque fois que cela est possible, les mêmes animaux seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux : tous les tests métaboliques sont faits chez les mêmes animaux après un temps de repos et de récupération.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton pour les souris ou des bâtonnets de bois et rouleaux de carton pour les rats qui permettent l’expression de comportements innés. Ils seront répartis à quatre par cage pour les souris et à deux pour les rats. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences de manière à diminuer leur stress et inconfort au moment des expériences. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés quotidiennement de manière à s’assurer du bon état de santé des animaux. Douleur et/ou souffrance des animaux sont rendues tolérables lors des prélèvements de sang en effectuant une application d’anesthésique local avant une incision minimale puis désinfection à l’eau oxygénée qui a un fort pouvoir coagulant (en plus d’être un antiseptique). Un animal présentant une perte de poids (
Choix des espèces
Le rongeur est l’animal le plus fréquemment étudié dans les études métaboliques précliniques avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. Les animaux, rats et souris spontanément diabétiques et ceux au régime gras et sucré seront âgés de 14 semaines.