Système endocrinien

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.

66 souris vont être utilisées, chacune passant 48 heures isolée dans une cage de calorimétrie et subissant trois séances de rotarod, de grip test et de marche en équilibre sur une planche à trous, ainsi qu'un open field de 30 minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les prises de sang se font sous anesthésie, et une partie des souris reçoit pendant six mois un régime enrichi en sucres et en lipides, que le porteur dit capable de conduire "à la longue à une obésité". L'équipe a créé une lignée privée d'un gène dont les souris résistent à la prise de poids, et veut comprendre cette résistance en les comparant à des souris témoins. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Le porteur retient des groupes de 12 souris pour deux génotypes et deux régimes, soit 48 souris, et écrit pourtant que "l'étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - Toujours à propose de l’étude du métabolisme, celle-ci nécessite des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 48 heures. Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 66 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 15 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.

Toutes mises à mort vers l'âge de 5 mois pour le prélèvement de plusieurs tissus, dont les reins, le cœur, le pancréas, le cerveau et le foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles naissent d'œufs fécondés dans lesquels l'équipe microinjecte des ARN de spermatozoïdes d'hommes obèses ou non obèses, et peuvent devenir obèses et diabétiques. À 4 mois puis à 4 mois et demi, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de glucose, puis d'insuline, suivie à chaque fois de deux heures de mesures de la glycémie sur du sang prélevé à la queue, toutes les 15 minutes la première heure. Le porteur dit ce matériel biologique "indispensable" et affirme que "seul ce modèle expérimental est disponible" pour savoir si ce mode d'hérédité vaut chez l'homme. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite, ou dont la glycémie reste trop basse deux heures après une injection de glucose lors du test à l'insuline, est mise à mort.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'ablation de dépôts de graisse sous anesthésie, des prises de sang à la queue et des mesures de composition corporelle, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une perte de poids et une douleur à court terme, et fixe la mise à mort à une perte de 20 % du poids. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux n'existe pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier" et juge le recours à la souris "indispensable".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau sous-cutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie et sur la base d'analyses statistiques, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années. Pour cette étude, nous utiliserons des souris wild-type C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries douze semaines avec un régime hyperlipidique et gavées chaque jour de deux souches bactériennes, avec prélèvements fécaux et sanguins, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer l'effet de ces bactéries sur la prise de poids et les troubles métaboliques. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer des hypoglycémies et un stress lié à la contention et au gavage. Sur le remplacement, il affirme que l'écosystème microbien digestif ne peut pas être étudié in vitro et conclut à la "nécessité" du modèle murin.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier dans un modèle murin d’obésité induite par le régime l’impact de l’administration de deux souches du genre Subdogranulinum sur la prise de poids et le développement d’altérations métaboliques, telles que l’insulino-résistance et l’hyper-lipidémie, susceptibles d'altérer la santé des patients souffrant d'obésité ou de syndrome métabolique.

Bénéfices attendus

Nous espérons réduire la prise de poids et les complications métaboliques associées en conditions obésogènes. Si ces résultats sont obtenus, la possibilité de l’utilisation future des souches sélectionnées chez l'Homme peut être envisagée. Si non, des résultats d'amélioration au niveau des paramètres physiologiques liés à la santé générale et à la santé intestinale sont attendus.

Procédures

La moitié des animaux seront nourris avec un régime hyper-lipidique pendant 12 semaines et 72 animaux en état vigile seront gavés quotidiennement rapidement (10 secondes maximum) en pendant toute la durée de l'étude. Des échantillons fécaux (4 fois en tout ; 15 min/prélèvement), des mesures de la composition corporelle avec résonance magnétique nucléaire (toutes les 3 semaines ; 3 min/mesure), des tests de tolérance au glucose (1 gavage et 5 prélèvements de sang de petit volume) et des tests de la sensibilité à l’insuline glucose (1 injection et 5 prélèvements de sang de petit volume) pour une durée totale de chaque test de 2h30 seront effectués avec un laps de temps d’au moins une semaine entre ces interventions. Finalement, un prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie sur tous les animaux avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

La masse grasse et le poids des souris soumises à un régime hyper-lipidique devraient augmenter de façon plus importante que ceux de leurs homologues ayant suivi un régime standard. Ces souris devraient également présenter des altérations du métabolisme, ce qui fait partie du programme expérimental. Certaines procédures puissent entraîner des hypoglycémies, un léger inconfort ou du stress, comme la contention pour la résonance magnétique nucléaire, le gavage ou les challenges métaboliques. L'expérience antérieure d'études menées avec des méthodologies et des produits similaires nous laisse penser qu'aucun autre type d’effet indésirable ne se produira.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour collecter les tissus pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Actuellement, l’étude de l’écosystème microbien digestif et de son impact sur les maladies métaboliques ne peuvent pas être réalisés in vitro. La plupart des bactéries digestives ne survivent pas en dehors de leur hôte, d'où la nécessité d'utiliser le modèle murin. De plus, le projet vise à déterminer l'influence de la modification de l'écosystème microbien sur les grandes fonctions systémiques. Celles-ci jouent un rôle important dans la physiopathologie des désordres métaboliques et ne peuvent pas être évaluées en l’absence de ces systèmes.

Réduction

Afin d'utiliser le moins d'animaux possible et de réduire le nombre de groupes dans les expériences suivantes si les résultats sont conformes aux attentes, le design expérimental correspond au nombre minimal de souris nécessaires afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statistiquement fiables (96 animaux dans 8 groupes). A cet effet, ce nombre a été évalué en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés et de la réplication au sein de chaque groupe. De plus, les groupes sans administration de bactéries seront utilisés comme témoins communs, pour éviter d'utiliser un nombre double de souris comme témoins dans deux expériences différentes. Parallèlement, tous les échantillons obtenus dans le cadre de cette expérience seront stockés en vue d'une utilisation future.

Raffinement

Les manipulations seront effectuées par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire au maximum la durée, la sévérité et l’intensité de la douleur. Parallèlement, le matériel utilisé dans les procédures a été choisi pour limiter le stress. En début d'expérience, les animaux bénéficieront d'une semaine d'acclimatation et d'une semaine d'entraînement afin de les habituer à être manipulés et de réduire leur stress. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour observer leur état général et leur comportement. Un contrôle hebdomadaire de la prise alimentaire et du poids sera aussi effectué pour s'assurer que les animaux sont en bonne santé. De plus, un laps de temps de minimum 1 semaine entre les procédures non continues de classe modérée sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux. Les souris seront regroupées à 4 par cage au maximum et 3 au minimum pour ne pas souffrir du manque d'interactions sociales. Les souris disposeront de matériel en carton pour enrichir l’environnement. De plus, il existe des points limites définis, adaptés aux différentes interventions de la procédure.

Choix des espèces

La souris C57Bl/6J est la plus utilisée dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques en raison de sa propension au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisées et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation. Pour observer les effets sur l’état métabolique des animaux à l’âge adulte, les animaux seront donc âgés de 8 semaines au début du traitement et de la mise sous régime.

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent des injections répétées d'une protéine, la pose d'une pompe osmotique et d'un cathéter sous chirurgie, et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la maladie du foie induite peut provoquer douleur, inconfort, inflammation et troubles du comportement. Le composé testé est présenté comme "prometteur" pour traiter le diabète et les maladies du foie, sur la base de données "préliminaires".

Objectifs

Ce projet vise à mettre en évidence que l'administration de K1K1 ralentit la progression de la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) en réduisant la stéatose et la fibrose hépatique dans deux modèles nutritionnels de souris atteintes. De plus, nous postulons que l'effet antifibrotique de K1K1 dans le foie sera associé à la prévention de certains types de cancers du foie. In vivo, des données préliminaires montrent que l'administration intrapéritonéale de K1K1 pendant 3 semaines améliore fortement la production, la sécrétion et la sensibilité à l'insuline, conduisant à une réduction significative de l'hyperglycémie dans un modèle de souris obèses et diabétiques. Sur la base de données préliminaires fortes et uniques fournissant la preuve du développement d'un mimétique fonctionnel du facteur de croissance hépatique pour une administration in vivo, nous postulons que le mimétique K1K1 est un composé prometteur pour améliorer la transplantation de cellules des îlots, traiter le diabète et les maladies du foie. Nous proposons donc dans cette étude collaborative de valider l'efficacité et la sécurité de K1K1 d'une part dans le traitement de la stéatose et de la fibrose hépatiques, et d'autre part vis à vis de l'Elafibranor, tout cela à l'aide de modèles in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait donc permettre de valider le rôle régénérateur de K1K1 dans la fibrose hépatique

Procédures

Pour la procédure 1 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. Pendant la semaine 3 : tests de tolérance à l'nsuline, injection d'insuline et prélèvements de gouttes de sang à la queue pour mesurer la glycémie (durée 120 minutes). 3 jours plus tard : tests de tolérance au glucose, gavage de glucose puis prélèvements de sang pour dosage d'insuline à t0, t15 et t90 (durée 120 min). Procédure 2 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp. Procédure 3 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Procédure 4 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp.

Impact sur les animaux

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une maladie du foie caractérisée par l'accumulation excessive de graisse dans les cellules du foie. Il peut donc survenir plusieurs effets indésirables au cours de l’étude : L'induction de la NAFLD peut perturber le métabolisme des souris, entraînant une augmentation de la glycémie et une résistance à l'insuline. Elle peut également entraîner une inflammation dans le foie et d'autres tissus, ce qui peut causer de la douleur, de l'inconfort et des troubles du comportement chez les souris. De plus, si celle-ci n'est pas traitée, elle peut évoluer en fibrose hépatique, ce qui peut entraîner une dégénérescence du foie et une insuffisance hépatique. L'accumulation de graisse dans le foie peut également entraîner une production accrue de radicaux libres, qui peuvent endommager les cellules hépatiques et provoquer une réponse de stress oxydatif.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes et/ou étude de la radioactivité

Remplacement

Le remplacement par des études in vitro (avec l'études de cellules d'hépatocytes en culture par exemple) ne semble pas possible au vue de cette étude: nous souhaitons étudier principalement l'effet du peptide K1K1 sur la stéatose hépatique mais avant tout les bénéfices de celui-ci sur un organisme complexe, avec des effets sur des voies métaboliques intégrées telle que la sensibilité à l'insuline. De plus, l'utilisation de souris est nécessaire, avant les tests chez l'Homme, pour suivre des effets actuellement inconnus (nous souhaitons par exemple vérifier en parallèle si ce traitement permet d'éviter un développement tumoral induit par la NASH, phénomène que l'on peut observer exclusivement dans un organisme vivant complexe, regit par bons nombres de cascades de signalisation inter organes, hormonales, neurales,etc...). Des approches in silico et in vitro ont déjà été mises en oeuvre afin de s'assurer que le peptide K1K1 lie bien le récepteur Met et active la voie de signalisation, ainsi l'utilisation d'animaux est l'étape suivante pour s'assurer d'un effet biologique in vivo. Selon les résultats de l'étude, d'autres approches in vitro pourraient être utilisées afin de disséquer sur des modèles de cellules les mécanismes d'action (on pourrait envisager l'utilisation d'organ-on-chip afin de faire cohabiter les différents types de cellules hépatiques).

Réduction

Plusieurs études au sein de notre laboratoire ont précédemment montré que des groupes de 10 souris étaient necessaire au minimum pour obtenir des résultats optimaux. Afin de réduire le nombre d'animaux contrôles, nous utiliserons des souris contrôles sous régime normal pour comparer aux souris génétiquement diabétiques ou ayant une résistance à l'insuline induite par un régime hyper-lipidique.

Raffinement

Enrichissement environnemental, consistant à fournir un environnement plus stimulant pour les souris, en ajoutant des objets tels que des tunnels, des matériaux de nidification, etc. Cela permet de réduire le stress et l'ennui chez les souris en captivité, tout en favorisant leur comportement naturel. Anesthésie et analgésie : il est important d'utiliser des protocoles d'anesthésie et d'analgésie efficaces pour minimiser la douleur et la détresse chez les souris lors de procédures chirurgicales ou invasives. Suivi régulier de l'état de santé des souris : il est important de surveiller régulièrement l'état de santé des souris pour détecter rapidement tout signe de maladie ou de détresse et agir en conséquence.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle d'étude de l'homéostasie glucidique (physiologie et pathophysiologie très similaires à l'Homme).