Système endocrinien

500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'établissement produisant des rats privés de thyroïde et de parathyroïdes pour d'autres laboratoires. Chaque rat subit l'ablation chirurgicale de ces glandes sous anesthésie, avec des risques de saignement, de mauvaise cicatrisation et de chute de calcémie pouvant provoquer une tétanie. Le résumé indique que la majorité des rats jugés aptes sont expédiés vivants vers des laboratoires clients, les autres étant tués. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer les réactions du "corps vivant entier" et ne fournit aucune justification statistique du nombre d'animaux.

Objectifs

Les rats font partie des animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent un modèle animal de choix dans les domaines tels que les maladies endocriniennes. Ce projet a pour but de fournir des rats sans thyroïde, ni parathyroïde, cela va agir sur le poid, la masse musculaire, la solidité des os, le cholestérole, la glycémie, la température corporelle, le rythme cardiaque, en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année : 100 rats par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu et une mauvaise cicatrisation. Et également les problématiques liées à l'absence de thyroïde et parathyroïdes (perte de poids, diminution du rythme cardiaque, risque d'une chute importante de la calcémie avec risque de tétanie...).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.Les animaux sont supplémentés en lactate de calcium 2% dans l’eau de boisson pendant au moins 5 jours préopératoires et au moins 10 postopératoires, pour pallier a l'hypocalcémie.

Choix des espèces

Les rats sont une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 5 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 10-15 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

140 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La seule intervention sur l'animal vivant décrite est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, les rattes étant ensuite tuées pour prélever l'hypophyse et étudier la régulation de la fertilité femelle. Le porteur affirme que ce geste, bien réalisé, "n'induit pas de nuisance au-delà de l'acte de contention". Il indique retenir la ratte pour la régularité de ses cycles et la richesse de la littérature, aucun modèle in vitro ne recomposant selon lui ce cycle biologique complexe.

Objectifs

Chez le mammifères dont l’espèce humaine, la fonction de reproduction est contrôlée par l'axe gonadotrope, constitué par l'hypothalamus, l'hypophyse et des gonades. Dans l'hypophyse, les cellules gonadotropes jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ces cellules intègrent différents signaux venus de l'organisme et secrètent en réponse deux hormones, la LH (hormone luteinisante) et la FSH (hormone folliculo stimulante) qui régulent les fonctions gonadiques et donc la fertilité. L'un des régulateurs majeurs de la fonction des cellules gonadotropes est le neuropeptide hypothalamique GnRH, mais il est maintenant bien décrit que les cellules gonadotropes sont sensibles à de très nombreux signaux comme les hormones sexuelles secrétées par les gonades, faisant de ces cellules de véritables plateformes d'intégration de signaux. De plus, le cocktail de stimulation que reçoit les cellules gonadotropes varie fortement au cours de la vie des mammifères, entraînant des modifications de secrétions des hormones gonadotropes. Cela permet la mise en place des étapes clefs de la vie reproductive comme la puberté ou le déroulement des cycles sexuelles chez les femelles. Cette stimulation complexe, associée à la complexité structurelle de l'hypophyse, composée de 6 types cellulaires endocrines chez les rongeurs, a cependant longtemps représenté un frein à l'étude des mécanismes moléculaires de l’intégration par les cellules gonadotropes. Etudier ces phénomenes complexes et dynamiques dans des modèles de cellules en culture est cependant difficile : Les modèles de cellule en culture, par nature réductionniste, peinent en effet à cette complexité physiologique, et les résultats obtenus à partir de ceux-ci traduisent donc mal les processus se déroulant dans l'animal vivant. L’avènement récent des techniques en cellules uniques représente une opportunité extra-ordinaire pour étudier les mécanismes régulant la fonction gonadotrope dans toutes leurs complexités physiologiques, dans l’animal vivant. Ces nouvelles techniques de pointe permettent, en effet, de dissequer les méchanismes moléculaires au sein même des tissus, dans toute leur complexité biologique. Ce projet permettera donc de comprendre comment les cellules gonadotropes régulent la fertilité alors que celle-ci décline dans l’espèce humaine et chez de nombreux animaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait, à cours terme, permettre de mieux comprendre comment les cellules gonadotropes intègrent une signalisation complexe et changeante afin de réaliser sa fonction de régulation hormonale de la fertilité femelle. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. A plus long terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.

Procédures

Le projet n'inclu qu'un seul type d'intervention sur l'animal vigil: La réalisation de frottis vaginaux quotidien pendant deux semaines. Chaque frottis est réalisé en moins d'une minute (environ 10 à 30 secondes)

Impact sur les animaux

Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un éventuel inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.

Devenir

La finalité de l'expérience est de prélever l'hypophyse. Ceci ne peut être fait sur animal vivant. L'ensemble des animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prelevement de l'hypophyse.

Remplacement

Les modèles cellulaires in vitro ne peuvent se substituer aux modèles animaux dans ce projet car nous nous interessons à des phénomenes physiologiques qui se déroulent aux cours d'un cycle biologique complexe, impossible à recapituler fidelement in vitro. Le modèle rat est particulierement approprié car c'est le modele animal dans lequel les connaissances en physiologie de l'axe gonadotrope sont les plus pointues d'un part, et d'autre part, les rattes présentent des cycles oestriens extrêmement répétables et réguliers, en comparaison d'autres especes comme la souris. Ceci permet de selectionner des animaux de façon fiable et donc de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe en cellule unique permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permettra donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Un projet pilote montre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis. Des expériences de confirmation des résultats ainsi acquis seront cependant necessaire et necessiteront des animaux supplementaires. Notre recul expérimental nous permet de penser que, pour les verification de l'expression des genes et des proteines, 3 hypophyses par groupe de ratte seront suffisantes. Pour les expériences necessitants des cultures primaires de cellules hypophysaires, notre experience montre que les résultats sont fiables à partir de 10 rattes par culture primaire.

Raffinement

Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. Conditions d'environement: Les rattes seront hébergées dans les conditions suivantes: deux femelles par cage, cage enrichie de materiel de nidification et de rongeage, nourriture et eau ad libitum, cycle jour nuit 12H-12H. Points limites: L'aspect global des animaux sera évalué quotidiennement (pelage propre, présence de blessure...). En cas de signe de déterioration de l'état de santé (perte de poinds, pélage sale, prostration), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuels et 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. Nous utiliserons des rattes femelles adultes de 8 semaines puisque nous nous intéressons à la régulation du cycle estrien qui se met en place après la puberté (7-8 semaines chez le rat Wistar)

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras de douze semaines, elles subissent une constriction chirurgicale de l'aorte pour provoquer un stress cardiaque, puis des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, afin d'étudier le rôle de l'enzyme PIKfyve. Le porteur indique que cette chirurgie a déjà entraîné 10 % de mortalité post-opératoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de se passer du modèle animal en physiopathologie cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique, dont la prévalence augmente fortement, principalement à cause de l’obésité et du diabète de type 2. Nos études précédentes ont montré que l’enzyme PIKfyve est un acteur majeur dans la progression de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, son rôle exact reste à élucider, notamment dans le contexte de l’insuffisance cardiaque liée à l’obésité. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque liée au diabète en utilisant un modèle de souris dont le gène PIKfyve est non-fonctionnel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque en lien avec l'obésité et le diabète de type 2, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2 (n=96, pendant 12 semaines); 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque (n=96, durée de l’intervention : 1h); 3/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux (n=192, durée de l’intervention 15min); 4/ une mesure de la composition corporelle (n=192, durée de la procédure : 2min); 5/ un test de tolérance au glucose afin de mesurer le métabolisme glucidique (n=192, durée de l’intervention : 3h); 6/ un test de tolérance à l'insuline afin d'étudier la sensibilité des animaux à l'insuline (n=192, durée de l’intervention : 3h).

Impact sur les animaux

Le régime riche en gras induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche en gras auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La procédure chirurgicale de constriction transverse de l'aorte (TAC, ou aortic banding) peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Afin de limiter la douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. La lignée invalidée pour PIKfyve dans le cœur est une lignée déjà établie et qui a fait l'objet d’une étude rétrospective démontrant aucun effet néfaste chez la souris. L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale afin de limiter la douleur occasionnée à l'animal, à 2 semaines d'intervalle afin de garantir un repos suffisants aux animaux. Les volumes prélevés conformes aux BPL. Une surveillance sera assurée par un zootechnicien afin de s'assurer de l'absence de saignements après réintroduction des animaux dans les salles d'hébergement.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements d'organes nécessaires.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s’affranchir du modèle animal pour les études de physiopathologie cardiaque.

Réduction

Le critère principal de jugement de la fonction cardiaque sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal, traitement analgésique après réveil et 24h après l'opération. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux obèses et diabétiques dont un gène a été rendu non-fonctionnel. A ce jour, seul le modèle de souris (Mus musculus) permet de réaliser ces études. Les animaux utilisés seront âgés de 2 mois, correspondant au stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature car ils sont les plus réceptifs à la procédure chirurgicale et au régime riche en gras.

160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié transférée vivante vers un autre établissement pour la suite du projet. Les animaux subissent des séances de course ou de marche imposées, des pesées répétées, une injection intraveineuse sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle du lactate musculaire dans le vieillissement du cerveau. Le porteur affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité des interactions muscle-cerveau et juge le modèle animal "nécessaire". Il annonce des tests comportementaux d'apprentissage et de mémoire sans en préciser le détail.

Objectifs

La population mondiale vieillit de plus en plus, et a tendance à avoir un mode de vie de plus en plus sédentaire. Ces deux facteurs constituent ensemble la recette parfaite pour l'une des plus grandes menaces pour la santé dans un avenir proche : les troubles cognitifs liés à l'âge. Nos fonctions cognitives se détériorent avec l'âge. L'exercice physique pourrait ralentir l'altération métabolique du cerveau au cours du vieillissement. En effet, différents métabolites sont sécrétés par les muscles squelettiques pendant l'exercice, dont le lactate. Il a été suggéré que le lactate a un effet protecteur qui retarde le vieillissement du cerveau. Des études suggèrent que le lactate pourrait être nécessaire pour l’apprentissage et le maintien de la mémoire à plus ou moins long terme. De plus l'exercice physique pourrait avoir des effets protecteurs sur le cerveau en raison de sa capacité à générer du lactate dans les muscles et le cerveau. L'objectif est donc d’évaluer le rôle du lactate et de son transporteur musculaire durant un exercice physique d’abord sur la performance musculaire elle-même, puis sur le comportement des animaux (capacité d'apprentissage et mémoire). Des tests de comportement permettront d'examiner les fonctions cognitives et la mémoire de l'animal. L'hypothèse est que l’inhibition du transport de lactate provenant des muscles réduirait l’apport du lactate vers le cerveau, induisant des différences de comportement mesurables en raison d'une moindre disponibilité d'énergie pour les neurones du cerveau, sans réduction significative des performances à l’exercice.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus vont nous permettre de mieux comprendre la communication biologique de l’axe muscle-cerveau, dans le but d’établir des stratégies neuroprotectrices afin de limiter les troubles de la mémoire liés à l'âge. À plus long terme, cela nous permettra de mieux prévenir ou guérir les troubles cérébraux causés par différentes pathologies chez l’homme.

Procédures

Sur animaux vigiles : 14 à 16 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 4 à 7 séances d’activités physiques (course ou marche) par animal, séance d’une durée de 5 à 30 minutes. Sur les animaux sous anesthésié générale + anesthésie locale : 1 injection intraveineuse par animal, acte d’une durée de 1 minute. 0 à 2 prélèvements sanguins par animal, acte d’une durée de 1 minute.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale et l’injection intraveineuse, l’effet indésirable attendu est un inconfort très transitoire au réveil. Suite à l’inhibition partielle du transport du lactate provenant des muscles, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une difficulté à apprendre une tâche cognitive complexe et à se remémorer cette tâche, ainsi qu’une fatigue musculaire plus précoce suite à un exercice physique prolongé et imposé. Les exercices physiques imposés aux animaux vigiles peuvent induire un léger stress ou une fatigue musculaire de l’animal lorsque soumis à un exercice physique prolongé, ces effets seront transitoires et « corrigés » par une période de repos prévue après l’exercice physique.

Devenir

La moitié des animaux seront mis à mort. Des prélèvements de tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses métaboliques, biochimiques, moléculaires et histologiques. Et la moitié des animaux seront gardés en vie pour poursuite du projet dans un autre établissement utilisateur.

Remplacement

Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des interactions entre le muscle et le cerveau et permettre l'étude du comportement. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer les interactions entre des cellules musculaires et les neurones, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement les interactions entre le muscle et le cerveau, en effet les muscles et le cerveau ne se limitent pas simplement à des cellules musculaires et à des neurones, chacun de ces tissus est constitué de différents types cellulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés sur les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement). et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les injections intraveineuses seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale et locale. Les prélèvements sanguins seront réalisés en asepsie stricte sous anesthésie locale. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix du modèle de souris est basé sur les critères suivants : 1. Les tests physiologiques musculaires et les évaluations des tests comportementaux dans cette espèce sont des procédures validées et adaptées pour répondre aux objectifs. 2. La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles et femelles âgées de 2 mois minimum. Puis 4 semaines après, des tests d’activité physique/musculaire et de comportement seront réalisés chez ces mêmes animaux. Ces tests d’activité physiques et ces tests de comportement se dérouleront pendant 2 à 15 semaines. Cela correspond à un âge et un poids adulte, qui sont appropriés pour les expériences.

400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Bénéfices attendus

De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Procédures

Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.

Remplacement

Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".

Objectifs

Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.

Réduction

Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.