Système endocrinien

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses pendant seize semaines pour devenir obèses, un protocole de course sur tapis de huit semaines et des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'un risque d'irritation aux points d'injection, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'étude vise à préciser le rôle d'une protéine adipocytaire dans l'obésité, sans bénéfice thérapeutique annoncé au-delà d'une hypothèse.

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 8 semaines. Certaines souris obèses seront renourries avec un régime normal afin de réverser les effets de l'obésité. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.

Objectifs

L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.

Procédures

Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.

Impact sur les animaux

La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.

Raffinement

Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le lendemain de leur naissance, les souriceaux reçoivent deux injections quotidiennes d'une molécule inflammatoire pendant cinq jours, puis subissent des tests de tolérance à l'insuline et au glucose avec prélèvements de sang à la queue et un isolement d'une semaine en cage métabolique. Le porteur indique une mortalité de 5 à 10 % pendant les injections, un retard de croissance, des troubles du comportement et une douleur locale. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou informatique ne peut reproduire les connexions entre le cerveau et le métabolisme et tue tous les animaux pour prélever leurs organes.

Objectifs

La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut entraîner des lésions du cerveau. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.

Bénéfices attendus

Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser ensuite l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les souriceaux recevront deux injections intrapéritonéales (au niveau de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Cette injection prend quelques secondes. Pour savoir si les animaux développent un diabète, un lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose. D’autres animauxseront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement pendant 1 semaine dans des cages individuelles spéciales appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une semaine d’habituation en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant.

Impact sur les animaux

Site 1: - Une mortalité de 5 à 10% peut survenir en période d’injection de la molécule inflammatoire. - LUne douleur due à infection locale dans la zone d’injection intra-péritonéale - Un retard de croissance, - des manifestations de stress : troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...), accélération de la fréquence respiratoire. Lors du test de résistance à l’insuline ou au glucose réalisé à 4 semaines : sensation modérée de faim due à la privation de nourriture pendant 5h, puis douleur légère au bout de la queue pour permettre les prélèvements de sang. Comme il y a une seule incision, il y aura peu d’inconfort pour les animaux, à part le stress généré par la manipulation répétée. - Site 2 uniquement : L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.

Remplacement

Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.

Raffinement

Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Le transport d’une partie des animaux entre deux laboratoires sera nécessaire à 3 semaines. Il sera assuré par un transporteur agréé, garantissant les bonnes conditions de trajet pour les animaux. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.

56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées d'un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n'induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un "organisme entier" en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l'appauvrissement en nutriments et qu'une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l'enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.

Impact sur les animaux

Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.

Devenir

L'ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.

112 souris, dont des invalidées pour le gène du récepteur au froid, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant quatre mois un régime riche en sucres et en gras destiné à provoquer prise de poids et dysfonction cardiaque, puis subissent tests d'effort sur tapis, échocardiographie sous anesthésie, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyser le cœur et des marqueurs inflammatoires. Le porteur indique n'avoir constaté aucun effet indésirable sur seize semaines, tout en attendant une prise de poids importante et un mauvais fonctionnement du cœur. Sur le remplacement, il affirme devoir prouver l'effet protecteur du récepteur dans une étude sur "organisme vivant", les travaux in vitro ayant seulement établi son potentiel.

Objectifs

Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or, le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce projet vise à comprendre le rôle du récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours d’un syndrome métabolique. En effet, nos derniers résultats ont montré un lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid. Nous avons pu montrer que lorsqu’on diminuait la quantité de récepteur au froid, cela induisait une augmentation des graisses insaturées. Nous pensons que le récepteur au froid pourrait jouer un rôle clé dans la modulation des complications cardiaques de la cardiomyopathie diabétique. Plus précisément nous nous attendons à une meilleure résistance des animaux invalidés au récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours du syndrome métabolique. La cardiopathie diabétique est la conséquence des altérations de structure et de fonction du tissu cardiaque survenant chez les diabétiques indépendamment des facteurs de risque. Nous allons utiliser un régime riche en sucres et en gras pour mimer cette pathologie, comparé à un régime contrôle. Les symptômes attendus sont une prise de poids importante, une fatigue accrue et un essoufflement plus important à l’effort. Des souris invalidées ou non pour le récepteur au froid seront soumises à un régime riche en sucres et en gras pendant 4 mois. Cette procédure permettra d’évaluer l’effet de l’absence du récepteur au froid sur la fonction contractile sous régime riche en sucres et en gras, par un test d’effort sur tapis de course, une échocardiographie sous anesthésie gazeuse, ainsi que sur le profil diabétique des souris par des tests de tolérance à l’insuline et au glucose et un test de signalisation à l’insuline. L'inflammation dans le sang et dans les tissus sera évaluée après mise à mort des animaux, en mesurant les taux sanguins de marqueurs inflammatoires et l’infiltration des cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles et lymphocytes) dans le tissu cardiaque.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet nous permettra de comprendre le lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid dans la cardiomyopathie diabétique. A plus long terme, ce travail pourrait ainsi proposer l’utilisation des modulateurs pharmacologiques du métabolisme des graisses, ainsi que des substituts pharmacologiques du récepteur au froid, permettant de rétablir une contraction normale cardiaque chez les patients diabétiques.

Procédures

Le protocole dure au total 16 semaines. Toutes les 2 semaines un suivi du poids et de la glycémie sera effectuer sur les souris (prise de la glycémie ~1min). Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline seront effectués à 8 et 16 semaines (durée d’un test : 1h). Deux tests d’endurance seront également effectués à 16 semaines sur tapis de course, avec 5 jours d’intervalle (de repos) entre les deux tests (durée de chaque test : 1h maximum). Une échographie sera effectuée à 16 semaines sous anesthésie (durée anesthésie générale :30min) et un prélèvement de sang de 50uL sera réalisé à la fin de la 24ème semaine de régime (durée : 2mn).

Impact sur les animaux

Comme précisé dans le déroulé du projet, nous nous attendons, en réponse au régime riche en sucres et en gras, à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque, raison de l’étude. Nous n’avons pas constaté d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (16 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes

Remplacement

Le récepteur au froid dont il est question dans ce projet a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années. Ces études ont permis d’établir le potentiel de ce récepteur au froid comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver que l’implication de ce canal dans la modulation du métabolisme lipidique a un effet protecteur au cours de la cardiomyopathie diabétique, dans une étude physiologique sur organisme vivant.

Réduction

Les effectifs ont été calculés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats statistiquement exploitables. En outre, l’expérience et le recul de l’équipe concernant les régimes alimentaires utilisés et les examens prévus, permettent de prévoir un très faible taux de mortalité et d’échec. Par ailleurs, nous utiliserons les souris mâles et femelles pour optimiser les animaux issus de l’élevage. Ceci constitue en outre un effort de réduction à long terme, car les conclusions de ce projet permettront à l’avenir aux utilisateurs de cette lignée de clarifier l’effet du sexe sur la régulation du récepteur au froid au cours de la cardiopathie diabétique

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisés sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis.

Choix des espèces

Les modèles pathologiques développés chez la souris de cardiopathie diabétique miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid). De plus, au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, le fond génétique dont il est question dans ce projet est le plus utilisé pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet ont d’ailleurs été développés sur ce fond génétique). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines lors de la mise en place de la diète pour 4 mois, menant à un âge de 22-24 semaines à l'issue de la procédure. Le fait de réaliser des échographies sur des sujets jeunes va permettre de limiter l’intensité des cônes d’ombres dus aux côtes pendant les examens d’échocardiographie.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale reproduisant une ischémie-reperfusion rénale, plusieurs anesthésies générales, des injections et des prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever organes et tissus. Le projet étudie une molécule censée limiter les lésions rénales lors d'une transplantation. Le porteur annonce des atteintes transitoires de la fonction rénale et une perte de poids, et affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité de ces mécanismes.

Objectifs

La transplantation rénale est le traitement de choix de l’insuffisance rénale terminale. Lors d’une transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence indissociable de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui peuvent contribuer au dysfonctionnement et au rejet du greffon. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine et donc des apports en oxygène et en métabolites (tels que le glucose et le lactate). La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en métabolites et oxygène. Il est nécessaire de développer des thérapies afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, tels que les troubles métaboliques (notamment la dérégulation des voies du métabolisme énergétique dépendantes du glucose et du lactate), et donc d’améliorer la qualité du greffon. Des travaux récents ont montré qu’un traitement avec une molécule thérapeutique, ayant une action sur la régulation du métabolisme du lactate, a permis de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. L’objectif de notre projet est de décrypter le mécanisme d’action, en lien avec le lactate et ses transporteurs, induit par le traitement thérapeutique. Nous proposons de réaliser cette étude dans un modèle d’ischémie reperfusion rénale chez la souris.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par un traitement avec une molécule protectrice des lésions l’ischémie-reperfusion. A plus long terme, ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles voies et cibles thérapeutiques permettant de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et donc d’améliorer notamment les taux de réussite en transplantation rénale. Ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le cœur, le cerveau. Ces cibles thérapeutiques pourront ensuite être évaluées dans d’autres contextes pathologiques impliquant une ischémie/hypoxie, tels que l’infarctus, l’accident vasculaire ischémique ou la chirurgie vasculaire chez l’homme.

Procédures

Chez les animaux vigiles : 2 à 13 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 1 à 5 injections sous-cutanées d’antalgique par animal, acte d’une durée de 1 minute. 2 à 5 anesthésies générales par voie gazeuse par animal, avec : Sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + anesthésie locale : 1 à 2 injections intraveineuses d’un traceur fluorescent et 1 à 2 poses et retraits d’un capteur cutané de fluorescence par animal, pour analyse de la fonction rénale, acte d’une durée de 2 fois 10 min. 2 prélèvements sanguins par voie intraveineuse par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute et 1 injection sous-cutanée de sérum physiologique par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute. 1 injection intraveineuse d’une molécule thérapeutique par animal, acte d’une durée de 1 minute. Et sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + antalgie locale : 1 chirurgie abdominale par animal (au cours de laquelle sera réalisée l'ischémie-reperfusion) avec 2 injections d’anesthésique local par voie dermique, acte d’une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée et l’injection sous cutanée d’analgésique sur animal vigile pourront induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un inconfort transitoire au réveil. Suite à la chirurgie et à l’ischémie/reperfusion rénale, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité très légèrement réduite, ainsi qu’une légère perte de poids, ces effets indésirables seront transitoires et ne dureront pas plus de 72h après chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organe et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

L'étude de l'ischémie-reperfusion in vitro est limitée par l'absence de vascularisation des cellules en culture et l'impossibilité d'étudier les multiples conséquences qui impliquent des interactions entre les différents types cellulaires. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement la physiologie rénale notamment associée à une modulation du métabolisme d’un rein vascularisé. Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes physiologiques impliqués lors d’une séquence d’ischémie-reperfusion. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux objectifs du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être réduit; en effet certaines procédures ne seront pas réalisées selon les premiers résultats obtenus. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Pour ce faire, les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les animaux feront l’objet d’un suivi de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation) et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les prélèvements sanguins, les injections intraveineuses et les chirurgies seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale + anesthésie locale et/ou antalgie sur tapis chauffant, une prise en charge antalgique sera mise en place en post-chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion rénale chez la souris, est un modèle validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles âgées d'environ 11 semaines, puis la chirurgie sera réalisée chez des souris âgées d'environ 12 semaines, ce qui correspond à un âge adulte approprié pour l’expérimentation.

180 animaux non-humains, 90 cochons et 90 moutons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des anesthésies générales et des interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures pour l'implantation de dispositifs médicaux, avant une autopsie et une analyse des tissus. Le projet évalue des dispositifs et techniques chirurgicales pour la santé gynécologique et obstétricale des femmes. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et d'"incontournable", en le présentant comme une obligation réglementaire pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités et domaines de la médecine s’intéressant à diagnostiquer, soigner et guérir les troubles, désordres, pathologies ainsi que leurs suites, comme les affections gynécologiques et de la sphère génitale (organes génitaux internes et externes et appareil suspenseur), les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité, les pathologies de la glande mammaire comme le cancer du sein et ses conséquences, ou à assurer le suivi des cycles hormonaux ou de certains états physiologiques comme la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques chirugicales en faveur de la santé de la Femme, pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynécologiques et obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patientes, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections par le recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. La réponse tissulaire, les cycles hormonaux et les modifications anatomo-physiologiques correspondantes en particulier durant la grossesse ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patientes représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s'assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de la femme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles. L'atteinte de l’objectif scientifique passe par l'utilisation d'animaux ayant une anatomie et/ou un contexte clinique (création de défect, modèle lésionnel) comparables à ceux observés chez la Femme.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes chargés en phosphate, passent deux fois 24 heures en cage métabolique et reçoivent des injections de tétracycline. Le porteur décrit ces contraintes comme des stress légers déjà bien supportés lors d'un projet antérieur. L'objectif se limite à confirmer des résultats précédents et à tester si la source du phosphate alimentaire modifie le métabolisme phospho-calcique.

Objectifs

Le premier objectif est de confirmer les résultats issus des études précédentes réalisées dans le laboratoire sur l’homéostasie du métabolisme phospho-calcique. La première étude était constituée de souris sauvages et génétiquement modifiées (pour l’expression de protéines impliquées dans la régulation de la minéralisation osseuse) pour la BSP (Bone Sialoprotein) et/ou l’OPN (Osteopontin), ces souris recevaient un régime classique. La seconde étude a été réalisée avec ces mêmes souris, cependant, les souris recevaient des régimes avec diverses concentrations de phosphate (Pi) : standard, riche ou pauvre en Pi. Etonnamment, la régulation du métabolisme phospho-calcique des animaux a été impactée par le type de régime reçu : régime classique ou régime standard. Pourtant dans ceux-ci, la quantité de Pi est sensiblement égale (0.55%vs0.58%), mais, la source d’apport du Pi était différente (minérale vs organique). De ce fait, nous souhaitons valider que la source de Pi alimentaire (organique/minérale) modifie le contrôle du métabolisme phospho-calcique dans nos modèles. Le second objectif est de visualiser l’impact du fond génique des souris sur la régulation du métabolisme phospho-calcique. En effet, l’absorption intestinale est la voie d’entrée du Pi dans la circulation sanguine générale. Elle peut être effectuée par voie paracellulaire ou transcellulaire, le choix de la voie est dépendant de la charge alimentaire en Pi. En effet, la littérature démontre, qu’en condition d’apport faible en Pi, la voie transcellulaire domine, via une activation majeure d’un transporteur de Pi dans l’intestin : Npt2b. Lors d’une étude antérieure nos souris ont reçu un apport alimentaire faible en Pi, cependant le niveau d’expression du récepteur Npt2b a été réduite par rapport à un apport de Pi dit standard. Cette observation est donc en total contradiction avec les résultats de la littérature obtenus sur des souris C57Bl/6. Plusieurs hypothèses : la source de Pi du régime (minérale ou organique – objectif 1), ou alors le fond génique des souris (CD1/129sv) ne possède pas les mêmes mécanismes de régulation du métabolisme du phosphate. Pour répondre à cette hypothèse, des souris contrôles (C57Bl/6) et des souris (CD1/129sv) seront soumis aux mêmes régimes dans les mêmes conditions. Si la régulation est différente, cela signifie que le fond génique impact la réponse aux changements de l’apport alimentaire en phosphate.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider nos résultats préalablement obtenus sur les souris sur fond génique CD1/129sv, mais également de déterminer si les données divergentes avec la littérature, proviennent du fond génique ou de la source de phosphate dans l’alimentation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une charge alimentaire en phosphate via des régimes spécifiques. De plus, les animaux passeront par deux, 24h en cage métabolique de manière à récupérer les urines et les fèces pour doser les marqueurs du métabolisme phospho-calcique. De plus, les animaux recevront deux injections de Tétracycline en intrapéritonéale (5 secondes par injections-30mg/kg) à 5 jours d’intervalle. La tétracycline est un antibiotique utilisée comme marqueur en histologie (marquage des fronts de minéralisation).

Impact sur les animaux

Les injections de tétracycline par voie intrapéritonéale, le passage en cage métabolique inférieur à 24h et le changement de régime alimentaire peuvent êtres des sources de stress pour les animaux. On s’attend donc à une légère modification du comportement (agitation/baisse de la consommation de la nourriture). Cependant, ces expériences ont déjà été effectuées lors de projet antérieur, et tous les paramètres (contrôle du poids/comportement) indiquent que les animaux supportent très bien les différents stress légers de ce projet. Enfin, la mise à mort des animaux sera effectuée par une personne habilitée et compétente et sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse (Isoflurane)) pour qu’aucune douleur ne soit ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la régulation du métabolisme phospho-calcique, et ce contrôle est effectué à travers divers organes : l’intestin, l’os et le rein. La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

5 génotypes de souris seront nécessaires à l’étude et 4 régimes seront testés : classique, standard, pauvre et élevé en phosphate. Il y a donc 4 conditions par génotype et 5 génotypes ce qui fait 20 groupes expérimentaux. D’après nos études antérieures, un nombre de 8 points est jugé robuste et suffisant, mais sachant que les souris sont placées par 2 en cage métabolique pour réduire leur stress (permettant une meilleure homogénéisation des données, et une amélioration du bien-être notamment en réduisant la sensation de froid des animaux), il faut donc 16 souris par groupe. De ce fait, 16*4 (régime)*5 (génotype)= 320 animaux. En prenant compte, des expériences complémentaires/répétées qui pourront être nécessaires, 400 animaux seront nécessaires. Ainsi, le nombre d’animaux est réduit au juste nécessaire pour obtenir une puissance statistique robuste en tenant compte de la variabilité inter-individu.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Les actes qui pourront produire un stress chez les animaux (cage métabolique/injections) seront réalisés dans des salles dédiées et par un expérimentateur habilité. La nourriture et l’eau seront à volonté. L’acte de mise à mort sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (Isoflurane) et réalisé rapidement par un manipulateur expérimenté. Les animaux qui proviennent de fournisseur agréé recevront la même attention que les animaux issus de l’élevage interne. De plus, ils seront inclus dans l’étude uniquement après une période d’acclimatation dans l’animalerie.

Choix des espèces

Les précédentes études de notre laboratoire ont été effectuées sur ces même souris avec le fond génique CD1/129 sv. L’ajout des souris sur fond génique C57BL/6 provient des résultats obtenus dans les données de littérature. L’étude sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population. De plus, c’est à cet âge que les précédentes expériences ont été menées.