Système endocrinien

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à un régime riche en graisse pendant treize à seize semaines pour développer obésité, diabète et athérosclérose, avec implantation d'une sonde de télémétrie, mesures de pression artérielle, injections et induction d'une fibrillation cardiaque. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité des souris et que la chirurgie et les manipulations génèrent du stress, les animaux étant mis à mort pour prélever leurs tissus. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études portant sur l'ensemble de l'organisme.

Objectifs

L’obésité est associée avec une inflammation chronique de faible intensité impliquée dans le développement des facteurs de risque du diabète de type 2. La consommation d’un régime riche en graisse s’associe en effet à une inflammation précoce d’une partie du cerveau, l’hypothalamus, contrôlant la dépense énergétique, suggérant son rôle critique dans le développement de l’obésité et de ses conséquences. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation hypothalamique ne sont pas totalement connus. Dans ce projet, en utilisant une nouvelle stratégie ciblant spécifiquement les cellules hypothalamiques, nous cherchons à diminuer l’inflammation associée à la prise d’un régime riche en graisse utilisant différents modèles de souris avec prédisposition à l’inflammation et au diabète. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour améliorer les altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité ainsi que favoriser le développement de thérapies plus effectives.

Bénéfices attendus

Démontrer l'implication de la protéine NLRP3 dans le processus inflammatoire associé au développement de l’obésité et du diabète au niveau hypothalamique. En plus, la confirmation de l’implication de NLRP3 dans la dérégulation hypothalamique de la prise de poids et les dépenses d’énergie impliquerait sa validation en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Six interventions : - Régime riche en graisse : 13 (procédure 1) ou 16 semaines (procédure 2) – Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 minutes (procédure 2) - Mesure pression artérielle : 6 mesures (6 jours, procédure 1) et 12 mesures (28 jours, procédure 2), durée : 10 minutes/mesure - Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime (procédure 1), durée de chaque prélèvement < 5 minutes. - Injections intraveineuses : 2 ou 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 7 jours dans la procédure 1 ou 4 semaines dans la procédure 2), durée de chaque injection < 5 minutes. - Induction d’une fibrillation atriale : une fois (procédure 2), durée 20 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2, athérosclérose ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress liée à la chirurgie après l’implantation de la sonde de télémétrie ; 5) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, pris de la température au niveau rectal, prise de sang de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 288 souris sur 672, qui seront nourris avec le régime riche en graisse. L’effet 4 concerne 168 souris puis l’effet 5 concerne l’ensemble des souris.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité et au diabète, comme la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserions un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon hebdomadaire en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (évolution du poids, suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores. La grille de scoring des points limites est montrée dans chaque procédure. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. Les souris diabétiques étant polyphagiques, polydispisques et polyuriques, elles seront placées avec une litière abondante et absorbante. La fréquence du changement de litière sera augmentée en fonction des besoins des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans la favorisation de l'inflammation au niveau hypothalamique responsables des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement le processus inflammatoire avec le développement de l’obésité et le diabète. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6-8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique pour implanter une minipompe diffusant des inhibiteurs dans le cerveau, puis des tests répétés de tolérance au glucose et à l'insuline, pour étudier un lien entre diabète et marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que l'isolement en cage individuelle peut induire un stress chronique et que tous les rats sont mis à mort au bout de cinq semaines pour des études post-mortem. Il affirme que l'étude d'un organisme vivant "dans son intégralité" est "indispensable" et que des approches in vitro ne renseigneraient que sur les cibles moléculaires.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est associé à la maladie d’Alzheimer (MA). Réciproquement, le DT2 est fréquent chez les patients atteints de la MA. Des marqueurs moléculaires associés à la MA sont présents chez le rat Goto-Kakizaki (GK) spontanément diabétique. La surexpression de ces marqueurs est associée à la MA et au diabète. L’objectif de notre projet sera de rechercher si l’inhibition de ces marqueurs, directement au niveau du cerveau, peut améliorer l’état diabétique du rat GK. Pour cela, nous allons administrer des inhibiteurs de ces marqueurs pendant 14 jours, dans le cerveau de rats diabétiques (GK) et contrôles Wistar (W) de 3 mois. Cette étude nécessitera au total 96 rats mâles et 96 rats femelles et sera réalisée sur une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en avant le rôle de ces marqueurs dans le cerveau sur la régulation du métabolisme du glucose et son implication dans le diabète du rat GK. La modulation de ces cibles moléculaires pourrait ouvrir la voie à un traitement du diabète.

Procédures

Les 192 animaux subiront une procédure chirurgicale, par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux dans le cadre de tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline et lors du suivi de la glycémie. Chacun de ces tests dure 2h. Pour le test de tolérance au glucose, des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour le test de tolérance à l'insuline, une goutte de sang (10 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés de 2 jours pour permettre la récupération.

Impact sur les animaux

L’isolement des animaux en cage individuelle après l'implantation de la minipompe reliée à une canule dans le cerveau pourrait induire un état d’anxiété tel qu’un stress chronique qui pourrait se manifester par une modification de la réactivité comportementale des rats. La pose de la minipompe entraîne une gêne et une possible douleur pour l'animal. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqûre. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre du test de tolérance à l'insuline, mais cela est très rare chez le rat.

Devenir

A l’issue de notre procédure, au bout des 5 semaines, tous les animaux seront mis à mort pour des études post-mortem.

Remplacement

Le métabolisme glucidique dont nous cherchons à mettre en évidence la régulation suite à la modulation de cibles dans le cerveau nous conduit à devoir travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in silico et in vitro, notamment sur des neurones en culture, ou ex vivo, sur une structure cérébrale spécifique isolée telle que l’hypothalamus, nous permettraient uniquement de mettre en évidence la modulation de nos cibles d’intérêt (DYRK1A et GSK3β) par les traitements pharmacologiques (EMD92 et LiCl respectivement), mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements suite au dialogue entre le cerveau et les tissus périphériques. Ainsi pour atteindre les objectifs spécifiques de notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques paramétriques et non paramétriques montrant au mieux la différence entre les groupes, et il permet de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse au traitement.

Raffinement

Afin de réduire au mieux l’apparition d’une éventuelle douleur, angoisse et stress chez les animaux nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Pendant la chirurgie, la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Une injection en sous cutané d'anesthésique local, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la chirugie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Des points limites adaptés d’évaluation de la douleur et des critères d'arrêt de souffrance seront déterminés. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 3 mois. A cet âge, le diabète s’est bien développé et stabilisé chez les rats GK.

8 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour être réutilisés dans un autre projet. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trois heures pour la pose de cathéters, puis trois séances de prélèvements sanguins de sept heures après ingestion d'une farine d'insectes, pour mesurer la vitesse de digestion d'un ingrédient protéique destiné à l'alimentation humaine. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs abdominales dans les jours suivants, et fixe un point limite de mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que la biodisponibilité des nutriments "ne peut pas" être reproduite in vitro et présente le miniporc comme un modèle proche de l'appareil digestif humain.

Objectifs

Cette étude entre dans le cadre de la caractérisation de la qualité nutritionnelle d’un nouvel ingrédient protéique obtenu à partir d’insectes comestibles. Ce nouvel ingrédient est destiné à la consommation humaine. Au-delà de la composition en acides aminés indispensables et de la digestibilité dans l’intestin grêle, la qualité nutritionnelle d’une protéine dépend de la vitesse à laquelle elle est digérée, paramètre qui va influencer l’efficacité d’utilisation métabolique des acides aminés qui la compose. Ce projet a pour objectif d’évaluer la vitesse de digestion des protéines du nouvel ingrédient à base d’insecte en suivant l’évolution de la concentration en acides aminés dans le sang, suite à un repas test contenant cet ingrédient protéique, chez le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cibler un ensemble de produits alimentaires dans lesquels, la farine pourra être introduite et ceci pour répondre à des besoins spécifiques. Elle va également nous permettre de préconiser la temporalité de la consommation de ce produit. En effet, l’ingrédient à tester ne répondra pas de la même manière, selon certaines conditions physiologiques et selon la cinétique d’absorption. Les résultats de cette étude permettront d’envisager les prochaines investigations pour compléter la caractérisation de l’ingrédient. Eventuellement, imaginer une étude sur modèle in vivo dans l’objectif d’étudier ses effets à plus long terme sur une situation physiologique ou physiopathologique précise. La notion de qualité protéique est aujourd’hui très recherchée par le particulier et notamment chez le sportif. Aussi on accorde également de l’importance à la qualité des protéines dans d’autres conditions, comme le vieillissement, la dénutrition, en post chirurgies lourdes. Cette première étude d’analyse de la qualité des protéines permettra de préciser les futures investigations concernant cet ingrédient.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours est laissée pour chaque animal, entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 3 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des modalités à tester (TM, TMB ou WB). Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h, soit au total 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 54 ml par cinétique (2.7 mL x 2 cathéters x 10 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 35 kg.

Impact sur les animaux

Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.

Devenir

Tout les animaux seront gardés en vie dans l'objectif d'être réutilisés pour un autre projet de recherche faisant l'objet d'une autre demande d'autorisation de projet.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental (6 animaux inclus dans le schéma expérimental) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux par conditions expérimentales est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.

Raffinement

Les douleurs potentielles que pourraient ressentir les animaux pendant l’expérimentation sont liées à l’acte chirurgical. Celui-ci est réalisé sous anesthésie gazeuse, avec l’injection d’un dérivé morphinique avant l’incision cutanée, toutes les précautions sont ainsi prises pour éviter la douleur pendant le temps opératoire. Celle-ci peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération. Afin de la prévenir et de la limiter au maximum, les animaux reçoivent un traitement antalgique systématique à base d’AINS. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ces animaux sont utilisés dans la très grande majorité des études réalisées auparavant dans notre équipe de recherche, ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'intervention.

10 chèvres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ovariectomie chirurgicale d'environ une heure, puis est tuée pour prélever les organes olfactifs, l'utérus, les ovaires et le cerveau. Le porteur décrit un risque de douleur, d'hématome et d'infection postopératoires, ainsi qu'une irritation respiratoire possible liée à l'intubation. Il affirme que la question n'est "pas modélisable" autrement et rattache le bénéfice attendu à la gestion de la reproduction dans la filière caprine.

Objectifs

La chèvre est une espèce à reproduction dite "saisonnée", ce qui signifie que son activité de reproduction est naturellement restreinte à une période de l'année. C'est une espèce dite de "jours courts", c'est-à-dire que son activité sexuelle se déclenche en automne lorsque la durée du jour diminue. Cette saison sexuelle est suivie d'une période de repos sexuel (ou "anœstrus saisonnier") pendant laquelle les variations hormonales responsables des chaleurs et de l'ovulation sont stoppées lorsque la durée du jour augmente au printemps. La durée du jour n'est cependant pas le seul facteur environnemental pouvant impacter la reproduction de la chèvre. En effet, plusieurs études décrivent une modification de l'activité sexuelle de la femelle en fonction des contacts sociaux entretenus avec le mâle. Un phénomène nommé "effet mâle" a notamment été caractérisé chez cette espèce ainsi que chez les ovins. Ce phénomène permet, par l'introduction d'un mâle parmi des femelles en période de repos sexuel, une reprise des mécanismes hormonaux menant à l'ovulation. Les indices sensoriels, notamment olfactifs, pourraient jouer un rôle important dans le déclenchement de ce type de phénomène. Chez la souris, l'exposition à un mâle ou à son odeur déclenche une puberté précoce chez les femelles exposées. Chez la chèvre, l'exposition de femelles pendant l'anœstrus saisonnier à des stimuli olfactifs de mâle permet de stimuler les mécanismes hormonaux, pouvant mener à l'ovulation (50% des femelles adultes dans le cadre de l'effet mâle). Pour étudier la sensibilité des chèvres aux composés olfactifs de boucs, notre équipe a développé une approche basée sur une culture cellulaire, produite à partir de la récupération des tissus olfactifs de chèvre après euthanasie. Chez la souris, le statut hormonal influence le seuil de détection des odeurs et leur discrimination. Puisque la chèvre subit des variations hormonales drastiques au cours de l'année, nous aimerions explorer l'hypothèse que le statut physiologique de la femelle va modifier la sensibilité de ses tissus olfactifs aux composés de mâles.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de l'influence des hormones sexuelles sur la sensibilité olfactive des femelles aux composés odorants de mâles chez un modèle à reproduction saisonnée. A terme, cette étude pourrait apporter des bénéfices à la filière d'élevage caprine via une meilleure gestion de la reproduction par les interactions sociales mâles/femelles et l'utilisation des indices sensoriels olfactifs, tout en limitant l'apport d'hormones exogènes.

Procédures

Les 10 femelles du lot OVX subiront une unique procédure chirurgicale d'ovariectomie (retrait des ovaires). La réalisation de cette procédure nécessite environ une heure.

Impact sur les animaux

Pour les animaux des lots SAISON et ANOESTRUS, les seuls effets indésirables attendus sont du stress lors des manipulations précédant l'enthanasie. Pour les animaux du lot OVX : stress possible lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible (hématome au niveau de la plaie), ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais ce cas reste rare. De plus, les différentes injections en intraveineuse peuvent engendrer un hématome.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les 10 femelles du lots OVX retourneront en élevage. Dès que possible, ces femelles seront euthanasiées afin de récupérer les organes sensoriels olfactifs (épithélium olfactif principal et organe voméronasal) pour mesurer l’activité cellulaire sur des neurones en culture. L'organe voméronasal est un organe tubulaire du nez présent chez la plupart des mammifères et permettant la détection de molécules odorantes. Les résultats seront comparés à ceux obtenus sur les lots SAISON et ANŒSTRUS (non concernés par la procédure expérimentale faisant l'objet de cette saisine). Ceci nous permettra d'évaluer les effets des variations hormonales saisonnières sur la sensibilité olfactive des chèvres aux stimuli de mâle. Le tractus reproducteur (utérus/ovaires) et le cerveau seront également récupérés pour d'autres types d'expériences.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé dans ce projet étudiant les effets de la saisonnalité sur la réponse des neurones olfactifs aux stimuli de mâle chez la chèvre car ceci n'est pas modélisable par des modèles alternatifs.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés (34 femelles) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs (10 à 13 individus par groupe) a été choisi grâce à un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sur paille et bénéficieront d'enrichissement comme des caisses en bois et des ballons. Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. Pour les animaux du groupe OVX, la douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours malgré le traitement sera euthanasié. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, polypnée en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

Chez la chèvre, la présence d'un mâle sexuellement actif impacte la physiologie de la reproduction et les comportements sexuels de la femelle. Les indices olfactifs du mâle pourraient jouer un rôle assez important dans le déclenchement de ces divers phénomènes décrits, notamment dans le cadre de l'"effet mâle". Le statut hormonal d'un individu semble influencer le seuil de détection des odeurs et leur discrimination (données rongeurs). Ainsi, il serait donc intéressant de comprendre si les variations hormonales causées par la saisonnalité de reproduction de la chèvre conduisent également à une modification de la sensibilité de ses organes olfactifs aux stimuli de bouc. Nous utiliserons des femelles sexuellement matures (nées entre janvier et février 2021) pouvant donc afficher les variations hormonales saisonnières attendues pour comparaison.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dix-huit injections de thioacétamide sur six semaines, une hépatotoxine qui provoque une fibrose puis une cirrhose du foie, avec une perte de poids et une mortalité pouvant atteindre 15 % des animaux traités. Le porteur indique tuer les souris par ponction cardiaque pour prélever le foie, l'objectif étant de mettre au point une méthode d'imagerie 3D de la fibrose sur foie rendu transparent. Il affirme qu'aucun modèle de fibrose hépatique in vitro n'existe et qu'il est "contraint" de recourir à l'animal.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la première cause de maladie chronique du foie et sa prévalence ne cesse d’augmenter. La NAFLD inclus différents stades allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non-alcoolique (NASH) caractérisée par de l’inflammation et une progression rapide de fibrose. Les patients atteints de NASH présentent un risque accru de développer une cirrhose ou un hépato- carcinome. De nombreux facteurs augmentent le risque de progression de la NAFLD à la NASH, mais les mécanismes sont encore peu connus. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucun traitement contre la NASH. Les modèles précliniques d’étude de la NASH sont encore peu nombreux et ne récapitulent pas parfaitement les lésions observées chez les patients. Dans l’objectif de mieux caractériser le développement de réseau de fibrose, et avec l’émergence des nouvelles technologies d’imagerie, nous proposons de mettre en place une méthode pour caractériser et quantifier le réseau de fibrose hépatique en 3-dimensions par microscopie bi-photonique sur foie transparisé, c’est-à-dire rendu transparent. Pour rendre le foie transparent, nous utiliserons un protocole décrit nommé CUBIC pour « clear unobstructed brain/body imaging cocktails » ou cocktail pour l’imagerie du cerveau/corps clair et non obstrué. Suite à cela, nous visualiserons le réseau de fibrose en 3-dimensions sur des coupes d’organes de plus de 2 mm d’épaisseurs avec un microscope multi-photonique. Le projet vise ensuite à publier cette méthode dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avec les prélèvements de foie fibrosé, nous envisageons de développer une méthode de transparisation de foie murin avec le réactif CUBIC, suivie de visualisation des fibres de collagène en microscopie multi-photonique en 3 dimensions (sur foie jusqu’à 2 mm d’épaisseur). La microscopie bi-photonique est une méthode d’imagerie basée sur la propriété de certaines molécules à générer des signaux seconde harmonie (SHG, pour second harmic generation) lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique. Le collagène, la molécule caractéristique de la fibrose est une molécule décrite comme étant propice à la microscopie SHG. Ainsi, la méthode que nous souhaitons développer devrait permettre : 1) Une caractérisation spatiale du réseau de fibrose plus sensible et plus complète que les analyses classiques actuellement utilisées. 2) Une meilleure connaissance de la nature des fibres, avec la possibilité d’orienter l’angle de polarisation du laser pour discriminer différentes fibres. La microscopie bi-photonique avec le SHG est une méthode « label-free », c’est-à-dire qu’elle n’utilise pas de colorants ou d’anticorps. Cela implique donc qu’en plus de réduire les coûts, d’éviter l’exposition à des colorants et produits chimiques nocifs, cette méthode d’imagerie pourrait être couplée à des méthodes d’immunofluorescences classiques sur le même échantillon. On peut donc imaginer d’étudier la colocalisation entre les fibres de collagène hépatique et l’expression de protéines d’intérêt. A la suite de la mise au point de cette méthode, nous envisageons de la publier dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Procédures

Pour mettre au point cette nouvelle méthode d’imagerie en 3 dimensions, nous proposons d’utiliser du foie de souris issues d’un modèle de fibrose hépatique induite par hépatotoxine à savoir la thioacétamide (TAA). Le TAA est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. Les souris seront soumises à 3 injections intra-péritonéales de TAA par semaine pendant 6 semaines (18 au total). Ces injections visent à induire une fibrose hépatique dans le but de notre étude. A la fin du protocole, un prélèvement de sang sera effectué par ponction cardiaque après anesthésie/analgésie chimique.

Impact sur les animaux

Le thioacétamide (TAA) est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. L’administration de TAA provoque des lésions hépatiques, celles-ci peuvent atteindre le stade de cirrhose, avec ses complications associées. Cependant, celles-ci sont rarement sources d’inconfort pour les animaux. Une perte de poids modérés peut être observée. La mortalité peut atteindre 15% des souris traitées au TAA.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le foie.

Remplacement

La fibrose hépatique est un processus physiologique complexe, multi-cellulaire et dont la spatialisation du réseau de fibrose dans le foie a un impact physiologique (la fibrose péri-portale et différente de la porto-centrale). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de fibrose hépatique in vitro, c’est pourquoi nous sommes contraints d’utiliser un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. L’injection de TAA ne nécessite pas d’injection d’analgésique. Les souris sont hébergées par 2 à 5 par cage pour limiter l’isolement, et les cages seront enrichies en frisotis et d’un dôme en carton. Une observation quotidienne des souris et une pesée hebdomadaire seront effectuées. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose hépatique induite par TAA chez les C57Bl/6J mâles est un modèle de choix et reconnu pour le développement de fibrose. Avec ce modèle, il est très probable que la totalité des animaux traités au TAA soient atteints de fibrose hépatique après 6 semaines de traitement ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 8 semaines au début des injections. Les injections de TAA s’étaleront sur 6 semaines. Ce sont les durées généralement utilisées dans la littérature pour induire de la fibrose hépatique au TAA.

240 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à une restriction alimentaire allant jusqu'à 50 % de leur ration pendant trois semaines avec accès à une roue d'exercice, elles subissent des injections intrapéritonéales et des prélèvements de glycémie, avant une mise à mort par perfusion d'un fixateur sous anesthésie pour prélever les organes. Le porteur reconnaît que la restriction induit une sensation de faim et choisit des femelles jeunes pour mimer l'anorexie mentale humaine. Le bénéfice annoncé, mieux prendre en charge la maladie, reste hypothétique face à ce modèle de privation alimentaire imposée.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est une maladie qui touche majoritairement les jeunes filles et les femmes, et se caractérise par une prise alimentaire très diminuée, souvent associée à une activité physique exagérée et une préférence pour une alimentation riche en protéines. Beaucoup d’études se focalisent sur les aspects psychiatriques de la maladie, mais il est également intéressant d’en explorer les aspects métaboliques afin de mieux traiter, voire prévenir, cette maladie. En particulier, les patients atteints d’AM maintiennent une glycémie proche de la normale et un poids faible mais constant, malgré un très faible apport calorique et une forte dépense énergétique, ce qui suggère une forte adaptation de leur métabolisme vers la conservation de l’énergie. Nous proposons dans cette étude que la production endogène de glucose par la voie de la néoglucogénèse joue un rôle fondamental dans cette adaptation : il s’agit de la formation de glucose à partir de substrats non glucidiques (phénomène qui entre normalement en jeu au cours d’un jeûne) par le foie essentiellement, mais aussi par les reins et l’intestin. Nous testerons l’hypothèse du rôle « renforçateur comportemental » de la néoglucogénèse intestinale (NGI) dans un modèle de souris femelles qui réplique les aspects métaboliques de l’AM : faible prise alimentaire et exercice physique volontaire, en imposant une restriction alimentaire aux souris et en leur laissant un libre accès à une roue d’exercice.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes qui permettent de maintenir le poids et la glycémie de personnes en situation d'anorexie mentale pourrait déboucher sur une meilleure prise en charge tant sur le plan médicamenteux que sur les recommandations nutritionnelles et d'hygiène de vie. En effet un régime riche en protéines stimule la production intestinale de glucose, et nous pensons mettre en évidence également que l'exercice physique stimule cette voie.

Procédures

Procédures 1 à 4 : les animaux subiront une restriction alimentaire, pendant 3 semaines. Procédure 3 : les souris seront mises à mort par perfusion transcardique d'un produit fixateur, le paraformaldéhyde 4%, sous anesthésie générale (le décès survient en 1 à 2 minutes). Procédure 4 : les souris subissent 3 tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique, ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après une injection intrapéritonéale de pyruvate, glycérol ou glutamine, ces différents tests seront réalisés avec au minimum quatre jours d'intervalle. Les tests durent 120 minutes entre l'injection du produit et le dernier prélèvement de sang pour la glycémie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la restriction alimentaire susceptible de conduire à une sensation de faim. Cependant la restriction se fera de manière progressive avec une restriction de 30% de leur ration calorique pendant 3 jours, puis passage à 50% pendant 3 semaines. Les animaux subiront également des injections intrapéritonéales qui provoqueront une douleur légère et de faible durée, sans conséquences indirectes du produit injecté, puis des prélèvements de sang (microgouttes) pour mesurer la glycémie.

Devenir

mise à mort pour prélèvements d'organes.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous réaliserons des ANOVA à 2 facteurs pour les tests avec mesures répétées au cours du temps, avec une analyse post-hoc (Bonferroni). Lorsque les statistiques concerneront 2 moyennes (le poids par exemple, ou la prise alimentaire), nous utiliserons un test de Student après vérification de la normalité de nos échantillons.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Npus utiliserons ici des souris femelles "jeunes adultes" (8 semaines au début des procédures) afin de mimer la pathologie humaine de l'anorexie mentale qui touche essentiellement des jeunes filles.