Système endocrinien

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 100 d'entre elles et modérés pour 70. Elles sont soumises pendant deux à trois mois à un régime gras et sucré pour induire l'obésité, puis à des croquettes contenant une substance opioïde destinée à provoquer un comportement addictif, avant des tests de comportement motivationnel. Le porteur reconnaît que ces croquettes peuvent générer un état de stress ou de manque et revendique un "besoin de stratégies innovantes" contre les troubles métaboliques. Il conclut au recours aux souris car les invertébrés n'ont pas les structures cérébrales équivalentes aux mammifères, et toutes les souris sont tuées pour prélever des tissus.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un groupe de projets qui visent à identifier, si et comment certains composés alimentaires agissent directement ou indirectement sur le système de récompense pour modifier le plaisir associé à l’alimentation mais aussi les troubles compulsifs et addictifs qui leur sont associés.

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Des recherches approfondies sur l'obésité et la prise excessive de certains aliments, décrivent l’existence, dans un nombre important des cas, d’un composant de type addictif qui pourrait partager des mécanismes neurobiologiques communs. Ce travail permettra d’identifier formellement si une ou plusieurs composés alimentaires sont responsable de la mise en place de consommation compulsive.

Procédures

Les animaux ne subiront aucune procédure invasive, ils seront soumis à un régime riche en gras et sucre (2-3 mois) pour induire l’obésité et des régimes spécifiques (1-2 semaines) pour induire un comportement addictif. Ils seront aussi soumis à des tests de comportement motivationnel (1-2 semaines).

Impact sur les animaux

L’exposition à des croquettes contenant une drogue pour induire le comportement addictif peut générer des situations de stress chez les rongeurs ou une situation de manque. Nous surveillerons de près tous les jours le comportement de chaque souris pour détecter des signes de détresse ou une perte de poids importante( >15% du poids d'une souris contrôle). Le cas échéant, nous arrêterons le traitement et nous écarterons la souris qui montre un état de santé dégradé, pour qu’elle récupère. Basée sur notre expertise et sur la littérature nous prédisons que l’exposition relativement courte aux substances opioïdes devrait augmenter l’appétence pour la nourriture mais ne devrait pas créer de situation de manque trop rapide ni trop aigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux et le nombre d'animaux ont été déterminés par une approche statistique en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons des tests paramétriques et si nécessaire des tests non paramétriques.

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs ont pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).

Raffinement

Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendus dyslipidémiques par un régime gras et sucré, ils subissent des tests de tolérance au glucose, des gavages et, pour une partie, une course sur tapis roulant où une stimulation électrique les oblige à courir, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie. L'objet du projet est d'évaluer des compléments alimentaires à base de micro-algues destinés à la nutrition humaine et à une "valorisation" commerciale. Le porteur affirme que le modèle rat est "nécessaire", notamment pour disposer d'assez de sang et de tissus.

Objectifs

La sédentarité augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires en association avec des troubles du métabolisme pouvant induire des dyslipidémies voire un diabète. Plusieurs mécanismes cellulaires sont impliqués dans l’installation de ces troubles. Parmi ceux-ci, peuvent être cités, les mécanismes de l’inflammation, le stress oxydant, les troubles hormonaux ou une dérégulation du métabolisme des lipides ou des glucides. De nombreuses études nutritionnelles ont déjà montré l’intérêt d’utiliser des compléments alimentaires contenant des molécules à activité biologique pour prévenir l’installation de ces troubles. Parmi ces compléments alimentaires, des sources animales et végétales d’origine marine, riches en oméga-3, caroténoïdes et phytostérols, sont bien connues pour avoir des effets préventifs sur les risques cardiovasculaires, les dyslipidémies et les troubles du métabolisme des glucides. L’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets bénéfiques d’une activité physique modérée, combinée avec la prise de compléments alimentaires d’origine marine sur la prévention de l’installation d’une dyslipidémie.

Bénéfices attendus

Amélioration des paramètres physiologiques et biochimiques associés à une dyslipidémie d'origine nutritionnelle. Effets combinés d'une activité physique d'endurance et de compléments alimentaires. Au-delà du modèle animal, cette étude a pour objectif de valoriser certains compléments alimentaires en nutrition humaine, afin de limiter l'installation d'un syndrome métabolique voire d'une obésité chez des sujets prédisposés à ces pathologies. De façon plus précise, les bénéfices sont les suivants: - observer les potentiels effets des compléments alimentaires sur l’amélioration de la performance physique et sur les adaptations du tissu musculaire. - observer les potentiels effets des compléments alimentaires pour limiter le développement d’une obésité issue d’un régime riche en gras et sucre. - observer les effets des compléments alimentaires couplés à de l’exercice physique pour prévenir l’obésité.

Procédures

Les animaux suivront les différentes procédures comme détaillées et seront manipulés par un personel qualifié, ce qui ne va pas induire de nuisance particulière. En ce qui concerne les différentes interventions sur animaux vigiles, celles-ci sont détaillées ci-après: Pour les rats sédentaires, deux tests sur la résistance à l'insuline (durée de 2 heures) et la réponse à un test d'hyperglycémie orale (durée de 2 heures) permettront d'obtenir des informations sur les mécanismes de régulation de l'utilisation du glucose et donc de la régulation de la glycémie - Un autre test va permettre de suivre la synthèse des protéines, ce marqueur étant d'importance puisqu'il s'agit d'un marqueur étrotiement lié à l'exercie physique (durée 20 minutes). Enfin, l'anesthésie générale est nécessaire afin de pouvoir prélever totalement le sang (environ 10 minutes) pour analyser différents paramètres biochimiques. Une fois l'animal mort, différents organes sont aussi prélevés pour analyses biochimiques et moléculaires. Pour les rats « coureurs », les interventions sont identiques à celles précisées ci-dessus avec en plus, un entrainement de course sur tapis roulant (30 à 90 minutes), afin d'évaluer les capacités physiques des animaux soumis à différents régimes alimentaires contenant des molécules susceptibles d'être efficaces sur les paramètres biochimiques mesurés.

Impact sur les animaux

Cette étude se base sur des expériences antérieures acquises dans notre laboratoire, au cours desquelles, il n'a pas été observé de nuisances ou d'effets indésirables. En effet : 1) le passage d'un régime équilibré à un régime hyperlipidique n'induit pas de modifications comportementales (alimentation, activité, interactions, développement) ou de phénomènes de stress ou d'anxiété 2) en ce qui concerne les animaux devant courir sur un tapis roulant, une semaine d'acclimatation est prévue afin de limiter tout phénomène de stress lié à l'équipement qui sera utilisé et afin de déterminer les animaux coureurs. De plus, des points limites établis et les observations faites durant les protocoles de course permettent d'éviter l'installation d'un stress. En effet, ces points limites adaptés seront établis sur la base des observations faites précédemment dans notre laboratoire. Au cours du protocole d’entrainement (30 à 90 minutes), afin d’obliger les animaux à courir, une stimulation de courte durée peut être appliquée. L'intensité de la stimulation électrique sera adaptée au poids des rats. De plus, il est possible de réduire l’intensité du choc électrique pendant la course individuellement pour chaque rat.

Devenir

Six procédures sont utilisées dans ce projet. Cinq procédures où les animaux sont réintroduits dans les lots expérimentaux avec leurs congénères. En effet, cinq procédures ne nécessitent pas d'anesthésie locale ou générale, ni de chirurgie, ni de geste invasif, ce qui permet de maintenir en vie les animaux,chaque animal étant utilisé dans ces 5 procédures. A l'issue des ces 5 procédures, les animaux sont tous mis à mort: cela est fait sous anesthésie générale de l'animal qui précède son exsanguination. Cette procédure de mise à mort par exsanguination est nécessaire pour le prélèvement de différents tissus: sang, muscles squelettiques, foie, coeur.

Remplacement

La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, le projet nécessite des séances d'entrainement de course, ce qui oblige l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

Un nombre de 8 animaux par lot testé est un nombre minimum afin de pouvoir valider les résultats par le traitement statistique utilisé. Cette analyse nécessite un nombre minimum de 8 animaux pour avoir un lot homogène expérimental lors d’une étude nutritionnelle. Ce nombre d’animaux permettra de déterminer des moyennes associées à des écarts types.

Raffinement

En ce qui concerne le protocole d'entrainement: les rats seront mis en adaptation sur un tapis roulant équipé de cinq pistes de courses, pendant une semaine. Afin d'obliger les rats à courir, chaque piste de course est munie d'une grille au niveau de laquelle une stimulation de faible intensité électrique peut être administrée. Afin de limiter tout phénomène de stress ou d'angoisse, une grille d'évaluation de la réponse du rat vis-à-vis de cet apprentissage est mise en place. Un suivi de la prise alimentaire est effectué chaque jour et le suivi de la prise de poids est effectué régulièrement. Celai permettra d'avoir un suivi de l'état sanitaire régulier des animaux. Il nous sera possible d’observer le comportement et l’intégrité physique. En cas de problème observé (non prise de poids ou comportement non adapté (agressivité, posture recluse, poil hérissé, absence de réponse à des stimuli) l'animal présentant un de ces signes sera isolé des congénères et sera suivi de façon plus attentive. En cas d'une non reprise d'activité normale, le rat sera exclu du protocole. Les animaux seront hébergés dans une animalerie contrôlée. Quatre animaux sont placés par cage adaptée à leur poids, avec changement de litière régulier. Le milieu sera enrichi en objets permettant aux animaux de créer un environnement propice à leur développement et à leur épanouissement. La nourriture étant changée tous les jours, il n’y aura pas de risque d’avoir une altération de la qualité des régimes mis à disposition. Les injections lors des tests de tolérance à l'insuline et de synthèse protéique sont effectuées en intrapéritonéal, avec une aiguille adaptée au poids et à la taille de l'animal et par du personnel compétent. Le gavage pour le test d'hyperglycémie provoquée oralement est effectué avec une sonde adaptée à la taille et au poids des rats et effectués par du personnel habilité. Durant les temps d'attente précédant les prélèvements, les rats sont remis avec leur congénères. Les rats sont anesthésiés par voie intrapéritonéale, avant exsanguination. La totalité du sang est prélevée par ponction aortique abdominale. Il s'agit d'une procédure classe "sans réveil" avec l'utilisation d'un anesthésique adapté au modèle animal utilisé, ce qui ne génère aucun stress ou aucune douleur.

Choix des espèces

La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, les rats ont un métabolisme et une structure musculaire proche de l’humain et sont couramment utilisés dans des études pré-cliniques pour tester l’efficacité de compléments alimentaires. Les rats utilisés sont des rats jeunes en cours de développement. L'objectif de l'étude étant de tester l'efficacité de compléments alimentaires lors de l'exercice physique chez le jeune jusqu'à l'âge adulte, et le protocole d'entrainement durant 8 semaines, à terme, les animaux seront toujours à l'âge adulte, sans que le facteur vieillissement vienne interférer dans l'expérience.

2 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transplantations de matière fécale par gavage et subissent des colites provoquées, soit par un produit dans l'eau de boisson soit par injection de cellules, avant le prélèvement de plusieurs organes. Le porteur décrit une inflammation intestinale douloureuse qu'il estime de quelques heures, et tue les souris qui perdent plus de 15 à 20 % de leur poids. Il affirme qu'aucun système in vitro comme les organoïdes ne recrée la complexité d'un "organisme entier", et justifie l'effectif de 2 340 par des groupes de dix répétés sur au moins deux expériences.

Objectifs

L'hypothèse principale du projet est que l'altération du microbiote intestinal dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Les objectifs sont donc (i) d'identifier les composants du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie humaine est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet aux multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : - la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; - l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; - l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie aux développements de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant-garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.

Procédures

*Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Transplantation fécale: un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours *Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) *Gavage intragastrique (2 secondes) une fois par jour durant 4 à 5 semaines ou 8-12 semaines +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) Chaque point (*) représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administration basique (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère ou modérée au maximum et qu’à ce niveau, sa durée sera de quelques heures au maximum.

Devenir

L’ensemble des animaux (n= 2340) sera euthanasié à la fin de la période de maintien afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.

Réduction

Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 2340 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (4-6 souris/cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Les souris recevront à volonté un aliment standard et de l’eau stérilisé. La litière sera constituée de copeaux stérilisés. Points limites en dehors des situations d’inflammation intestinale: Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids > 15% par rapport à la première mesure - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection avec agitation anormale ou trouble de la respiration/saignement après le geste. Points limites dans les deux modèles d’inflammation intestinale : Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids >20% sur la durée de l'expérimentation en comparaison avec le poids de J0 (début de la procédure DSS ou injection cellules). - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection IP avec agitation anormal ou trouble de la respiration/saignement après le geste.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines. Les souris axéniques seront colonisées avec les microbiotes d’intérêt dès leur sevrage (3-4 semaine de vie) mais les autres étapes ne se feront qu’à partir de l’âge adulte (minimum 6 semaines de vie). La colonisation le plus proche possible du sevrage permet d’éviter les altérations du système immunitaire observée chez les souris axéniques colonisées à l’âge adulte Apres colonisation de souris axéniques, il est nécessaire d’attendre 3 semaines pour que le microbiote et le système immunitaire se stabilise.