Système endocrinien

29 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour implanter une mini-pompe qui diffuse un édulcorant directement dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile lors de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur signale une perte de poids après l'opération et prévoit la mise à mort de tout animal perdant plus de 10 % de son poids. L'objectif reste de comprendre pourquoi les édulcorants dérèglent le métabolisme du glucose, sans application thérapeutique annoncée.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de décès des personnes atteintes de diabète de type 2 ou d’obésité. Plusieurs études scientifiques ont montré un lien de cause à effet entre l’apparition de ces pathologies et la consommation excessive de sucre. C’est pourquoi, l’utilisation de substituts de sucre, les édulcorants (sucres non nutritifs : SNNs) est en augmentation. L’utilisation de ces édulcorants tout en remplaçant la saveur sucrée n’entraine pas d’augmentation de la glycémie à court terme. Cependant, consommés régulièrement, les substituts de sucres non nutritifs (SNNs) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et une augmentation de la glycémie. Il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces dysfonctionnements métaboliques seraient dus aux récepteurs au goût sucré qui lient ces SNNs. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier dans le cerveau, au niveau de l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) d’un édulcorant à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer si les SNNs diffusés dans le cerveau induisent une augmentation de la glycémie, augmentent l’expression des récepteurs liant les SNNs dans l’hypothalamus et si l’hypothalamus joue un rôle primaire ou secondaire dans la commande qui entraîne le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline et la prise alimentaire. Un ensemble de marqueurs sanguins pouvant également affecter la réactivité des vaisseaux sanguins sera dosé. Ce projet sera réalisé chez 29 rats.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettront de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entraine un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et quel est le rôle de l’hypothalamus.

Procédures

Les 29 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d’antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles sont prévus : 5 fois 55 à 105 µl durant deux heures pour le test de tolérance au glucose pour les 29 rats, quatre jours plus tard, 5 fois 5 µl durant deux heures pour le test de sensibilité à l’insuline pour 20 rats, 5 fois 55 à 105 µl pendant 10 minutes à la fin de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les 29 rats subiront des chirurgies. Des injections ainsi que des prélèvements de sang sur animaux vigiles sont prévus. L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie : c’est pourquoi les rats seront observés quotidiennement, pesés tous les 2 jours après la chirurgie et la consommation de nourriture et de boisson mesurées tous les deux jours. L’état général des animaux sera examiné minutieusement (poids, posture, comportement, cicatrisation, état de la plaie). Dans le cas de signes de douleur (posture, mobilité) le traitement analgésique pourra être prolongé et le début des tests retardés. Si un animal présentait une perte de poids persistante pendant plus de deux jours (10% du poids initial), il sera écarté de l’étude et mis à mort (par inhalation progressive de CO2) si son état ne s’améliorait pas.

Devenir

Les 29 rats ayant subi une chirurgie pour la mise en place d’une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez le rat, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par. Les conditions d’application des analyses seront vérifiées (seront réalisés selon ces conditions. Des études précédentes ont servi à définir le nombre d’animaux par groupe. Les expériences à mener imposent de tester différentes doses d’édulcorants. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, la dose la plus faible sera étudiée en premier. Si celle-ci s’avérait suffisante pour induire une hyperglycémie(différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à bâtonnet de bois et rouleaux de carton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent le bien-être des animaux. Le personnel a été formé et maîtrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les chirurgies seront réalisées par des personnes compétentes sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une injection d’anesthésique local sous cutanée sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection dans la cavité abdominale de liquide physiologique réchauffé sera donnée en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (rouleau de carton et bâtonnet de bois). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.

Choix des espèces

Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront réalisées sur des rats jeunes adultes, âgés de 8 semaines lors de la chirurgie, cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique du rat, et de 12 semaines à la fin des tests ce qui nous permettra de comparer ces résultats à ceux des rats ayant consommés les édulcorants par voie orale que nous avons obtenus dans un autre projet.

Pour étudier l'effet d'un régime riche en graisses sur les rythmes de 24 heures et la mémoire des mâles et des femelles, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang. Elles vivent seules en cage pendant deux mois et demi, et la moitié reçoit ce régime pendant cinq mois et demi. Un groupe passe trois périodes de deux semaines sous des éclairages modifiés, l'autre cinq jours en cage métabolique et deux tests de comportement, et toutes subissent une brève chirurgie pour un prélèvement de sang terminal. Le porteur reconnaît un "stress d'isolement" chez un "animal grégaire" et indique que les tests "pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée", sans dire lesquels.

Objectifs

Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles.

Bénéfices attendus

La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental.

Devenir

L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.

Réduction

Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, la pose d'une pompe pour des perfusions dans le cerveau et des tests de tolérance au glucose, une partie soumise à un régime gras, pour étudier une voie moléculaire liée au diabète de type 2. Elles sont hébergées seules et tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. Le porteur qualifie de "besoin crucial" la recherche de nouvelles cibles et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité participe au développement de pathologies chroniques tel que le diabète de type 2 (DT2). Le DT2 se caractérise par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion et d’action de l’insuline. Au cours de l’obésité, une saturation de la capacité de stockage du tissu adipeux (TA) favorise une hyperlipidémie qui conduit à l’accumulation des acides gras en excès dans les tissus périphériques insulino-sensibles favorisant l’altération de leur fonctionnement. Cette lipotoxicité peut notamment être induite via la synthèse de dérivés lipidiques tels que les céramides : des médiateurs clés de l’insulino-résistance (IR) qui constitue le principal facteur de risque du DT2. Le traitement du DT2 est une priorité de santé publique mondiale, un certain nombre de médicaments antidiabétiques sont arrivés sur le marché mais ont échoués en raison de problèmes de toxicité. Nous avons un besoin crucial de nouveaux paradigmes pour développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Aussi, il est actuellement reconnu que l’hypothalamus joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et le contrôle de l’homéostasie glucidique via l’intégration de signaux métaboliques périphériques tels que la leptine et l’insuline. L'homéostasie glucidique est principalement contrôlée par la sécrétion d'insuline qui maintien la glycémie en favorisant le stockage du glucose en excès dans la circulation sanguine dans les tissus cibles insulino-sensibles. Il est également reconnu que l’expansion du TA au cours de l’obésité s’accompagne d’une altération de la sécrétion d’adipokines (molécules produites par le TA) notamment la résistine, une hormone connue pour son rôle causal dans le développement de l’IR et du DT2. La résistine agit au niveau de l’hypothalamus en promouvant l’IR et de la neuro-inflammation participant ainsi à la dérégulation de l’homéostasie glucidique. Compte tenu de l’implication de l’hypothalamus dans la pathogénèse du DT2, il est primordial de comprendre quels sont les mécanismes sous tendant des dysfonctionnements hypothalamiques induits par l’action de la résistine et comment ils précèdent et provoquent la survenue de l’IR et du DT2. Nous évaluerons l’implication potentielle de la synthèse de novo des céramides dans la médiation des effets insulino-résistants et inflammatoires de la résistine au niveau hypothalamique et leurs conséquences sur le contrôle de l’homéostasie glucidique.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’implication de la synthèse de novo des céramides hypothalamiques dans l’inflammation hypothalamique et la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Cette étude vise à mettre en évidence la synthèse de novo des céramides comme nouvelle voie de signalisation participant à la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par l’action hypothalamique de la résistine en situation d'obésité. Cette voie de signalisation contribuerait ainsi à la dérégulation du contrôle hypothalamique de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Le rôle de la synthèse de novo des céramides a été clairement établit dans la lipotoxicité touchant les tissus périphériques. Des recherches préliminaires déjà effectuées au laboratoire laissent apparaitre un nouveau concept dans les dysfonctionnements moléculaires hypothalamiques qui impliquent une interaction entre une adipokine, la résistine, et la synthèse de novo des céramides. Ainsi, cibler la synthèse de novo des céramides au niveau central permettrait de prévenir l’insulino-résistance et l’inflammation hypothalamique et d’en éviter les répercussions néfastes sur l’homéostasie glucidique. Il apparait alors que comprendre plus en profondeur le rôle du métabolisme des céramides hypothalamique permettrait de générer de nouveaux inhibiteurs moléculaires ciblant la synthèse de novo des céramides ou ses dérivés pour prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du DT2.

Procédures

Les souris de toutes les procédures (P) subiront 2 chirurgies stéréotaxiques, sauf la moitié des souris de la P1 qui, après les 10j suivant l'injection de l'adénovirus, seront soumises à un régime riche en graisse : - Une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter les adénovirus dans le troisième ventricule. - Une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) 10j plus tard pour poser le système de pompe et de canule ALZET pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (15j). Les souris de la P1 subiront, à la fin des 15j de perfusion ou de régime riche en graisse, un test de tolérance au glucose (GTT) (120 min). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P2 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de sensibilité à l’insuline (ITT) (120 min) ainsi qu’un GTT 2 jours après l’ITT. Pendant l’ITT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Pendant le GTT, aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P3 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de tolérance au pyruvate (PyTT) (120 min) ainsi qu’un test de tolérance au glycérol (GyTT) (120 min) 2 jours après le PyTT. Pendant le PyTT et le GyTT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie (7x5µl de sang = 35µl). Les souris de la P4 subiront, en parallèle de la pose des pompes, l’implantation d’un cathéter intraveineux dans la jugulaire de chaque souris de la procédure dans le but de réaliser un clamp euglycémique hyperinsulinémique (2h) : prélèvement de sang toutes les 20min pendant 2h pour suivre la glycémie. Les souris de la P5 subiront, à la fin des 15 jours de perfusion, une mesure de l’activité nerveuse autonome au niveau de la branche thoracique du nerf vague et du tronc sympathique le long de l’artère carotide (20 min) grâce à une incision de la peau et de la couche musculaire.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions stéréotaxiques, chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaire, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter les tissus pour de réaliser des RTqPCR sur l'hypothalamus et le foie, des immunohistochimies sur coupes de cerveau, une analyse lipidomique de l'hypothalamus et estimer l'incorporation du glucose par les tissus insulino-sensibles.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, des données préliminaires ont été obtenues sur une culture cellulaire in vitro sur une lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA) afin de mettre en évidence l’implication du métabolisme des céramides dans l’inflammation et l’altération de la sensibilité à l’insuline chez ces modèles cellulaires, il nous reste à démontrer que cela est bien le cas in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous avons effectué un travail préliminaire qui nous a permis d’identifier l’enzyme SPT, première enzyme de la synthèse de novo des céramides comme étant impliqué dans la médiation des effets pro-inflammatoire et insulinorésistant de la résistine dans la lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA). Le nombre d’animaux a été calculé pour que le test statistique de Kruskal-Walllis puisse être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental lors de l'analyse d'un GTT ou d'une RTqPCR par exemple, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline (NaCl 0,9%, 10ml/kg/h) en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose 5% (2g/kg). De plus, en période post-opératoire, pour suivre l'antalgie, dès la fin des sutures, du Ketoprofene (2mg/kg) est injecté en sous-cutané, ainsi que le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de score et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour injecter un produit dégradant un réseau de molécules cérébrales, un isolement individuel pendant toute l'étude, une contention en tube pour mesurer la composition corporelle et un test de glycémie, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle de ce réseau dans l'obésité et le diabète, dans une perspective thérapeutique que le porteur renvoie au "plus long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour ces interactions complexes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Le poids corporel d’un individu est fortement influencé par l’activité de différents neurones, qui agissent sur la prise alimentaire, le stockage de graisse, la dépense d’énergie et participent à la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang). Certains de ces neurones sont entourés d’un réseau de molécules qui forment comme un filet autour d’eux. Ce filet est appelé filet périneuronal (FPN), et participe à la fonction et la maturation des neurones qu’il enveloppe. Dans le contexte de l’obésité, le rôle de ce FPN est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est de dégrader le FPN dans une région cérébrale impliquée dans le contrôle du poids, de la prise alimentaire et de la régulation de la glycémie, afin d’en étudier les conséquences, en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons notamment connaître le rôle joué par le FPN dans la susceptibilité à développer une obésité et à dérégler le contrôle glycémique. Pour ce faire, nous utiliserons au total 80 souris mâles et femelles, chez lesquelles nous injecterons un produit qui dégrade le FPN par neuro-chirurgie. Certaines de ces souris seront nourries avec une alimentation hypercalorique pour rongeur et comparées à celles qui resteront sous une alimentation standard. Nous mesurerons l’évolution du poids, de la prise alimentaire, de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre), ainsi que le contrôle glycémique. À la fin de l’étude, nous récupèrerons les cerveaux de ces souris pour des analyses in vitro complémentaires.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle du filet périneuronal dans le développement de l'obésité et du diabète de type II, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, le FPN est présent aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration du FPN, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. Tous les animaux de cette étude (80) sont concernés par l’ensemble des gestes suivants : 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 3 semaines. 2) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 3) Test de régulation de la glycémie : ce test nécessite de réaliser sur les souris une injection après un jeûne de 5 heures, puis de mesurer leur glycémie à 7 temps différents temps post-injection, par pélèvement d'une goutte de sang. Ce test est réalisé sur souris vigiles, avec un intervalle de temps d’au moins 15 minutes entre chaque mesure. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude. 4) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle, pour nous permettre de mesurer la prise alimentaire de chaque animal. L’isolement débutera dès l’arrivée des souris et jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Pour réduire au maximum le stress ressenti par les animaux, nous avons prévu une période d’habituation d’une semaine à l’expérimentateur. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Au-delà de du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. Notre protocole d’analgésie le jour de la chirurgie et les jours suivants permet cependant une prise en charge efficace des douleurs post-opératoires liées à l’incision de la peau du crâne. Les animaux seront suivis quotidiennement la semaine suivant la chirurgie et toute aggravation de leur état fera l’objet d’une évaluation, avec des points limites précoces qui déclencheront une prise en charge analgésique supplémentaire et des points limites terminaux qui entraîneront la mise à mort immédiate de l’animal pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

À l’issue de l’unique procédure de cette étude, tous les animaux (80) seront mis à mort par une injection d’euthanasiant. Nous récupérerons par la suite leur cerveau, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les changements neuro-moléculaires associés à la dégradation du filet périneuronal.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de la dégradation du filet périneuronal sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différentes expériences sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de mofication de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, le filet périneuronal est présent à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par leur alimentation, elles reçoivent une supplémentation en poudre de baie de goji et subissent des prises de sang par incision de la queue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage et injection, et des isolements temporaires que le porteur relie à un stress social. Les souris sont ensuite tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que l'effet d'une telle supplémentation ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Les effets santé des baies de goji ont été partiellement étudiés et plusieurs travaux rapportent un effet protecteur vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. La baie de goji est également riche en phytomicronutriments comme les caroténoïdes ou les composés phénoliques. Cependant, le rôle de ce cocktail de phytomicronutriments dans les effets santé de la baie de goji reste mal compris. En particulier, les interactions entre phytomicronutriments et fibres pourraient jouer un rôle majeur sur la bioaccessibilité et la métabolisation des phytomicronutriments par le microbiote. De plus, les baies en provenance de la Chine sont essentiellement consommées sèches, et les modalités de séchage induisent sans doute des modifications de l’état d’oxydation des phytomicronutriments, de la structure physique et chimique des polysaccharides ainsi que des interactions phytomicronutriments-polysaccharides.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact des conditions de culture et des traitements post-récolte sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la baie de goji avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage (dans le cas du test de tolérence au glucose), et une injection intrapéritonéale (test de tolerance à l'insuline). Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie apres micro-incision du bout de la queue. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution de FITC-dextran. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose (test de tolerance au glucose), ou une dose de FITC-dextran (perméabilité intestinale) et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (test de tolérance à l'insuline). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.