Système endocrinien

54 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans une épreuve inflammatoire ultérieure. Chaque animal subit une diète de 48 heures suivie de prises de sang répétées, avec dosages sanguins et laitiers, pour caractériser la réponse métabolique du ruminant laitier. Le porteur affirme que ces modifications biologiques "ne peuvent être étudiées qu'in vivo". Il précise que les chèvres sont habituées aux prélèvements, la mise à mort n'étant prévue qu'en cas de non-récupération de leur santé.

Objectifs

Les changements climatiques impactent les animaux ainsi que les fourrages (Qualité et quantité), l’établissement utilisateur possède des lignes sélectionnées pour leur longévité et résilience au niveau phénotypique. Dans cette saisine nous soumettons les animaux à une épreuve alimentaire qui consiste à substituer une ration standard (foin + concentré) par de la paille pendant 48h. Cette épreuve vise à mimer ce que des chèvres d’élevage pourraient rencontrer à l’avenir Ce changement de régime alimentaire va induire des changements métaboliques au niveau de l’animal, induire un stress transitoire. Les animaux vont mobiliser des réserves. Par cette épreuve alimentaire, nous allons réaliser des prises de sang et de lait préalable à l’épreuve, au cours de l’épreuve et suite à l’épreuve. L’objectif de ces prélèvements est d’identifier des marqueurs biologiques dont la présence serait significative pour identifier des animaux mieux adaptés et plus résilient au sein d’une population. En effet nous souhaitons identifier au sein de nos 54 chèvres qui ont un phénotype longévité plus (LGV+) ou longévité moins (LGV-) des individus ayant montré une meilleur réaction à l’épreuve (perte de poids moindre, diminution de la production laitière moindre, perte d’état corporel moindre) et qui au niveau sanguin et lait contiendrait des marqueurs biologiques d’interet par rapport aux autres. L’objectif est d’identifier ces marqueurs biologiques, de chercher ensuite au niveau génétique des différences. Pour in fine, utiliser ces différences génétiques et phénotypiques en sélection pour les agriculteurs de demain

Bénéfices attendus

A court terme, le projet doit permettre de vérifier que des dosages de certains métabolites du sang (N=7) et du lait (N=13) peuvent prédire la résilience des chèvres à un stress d’origine alimentaire. Ces dosages pourront ensuite être utilisés par les éleveurs pour piloter les pratiques d’élevage (nutrition, soins) et par les organismes de sélection pour améliorer la résilience génétique des chèvres

Procédures

Les animaux sont soumis à des prises de sang en amont de l'épreuve alimentaire (n=5) de 9ml autour de la mise bas sur l'intervalle J-27 à J+14, de prise de sang (n=13) durant l'épreuve alimentaire de J-7 à J+9 et de 3 prises de sang après épreuve alimentaire (en avril, aout et Octobre). Deux prises de sang additionnelles (10 ml) seront nécessaires pour le génotypage des animaux et le dosage de Glycoproteines associé à la reproduction (Pregnancy Associated Glycoprotein= PAG). Soit un volume de sang prélevé inférieur à 140 ml correspondant à moins de 2% du volume total de l'animal sur une période de 15 jours. La prise de sang est effectuée en moins d'une minute et le nombre de prise de sang est de 23 . Les animaux sont soumis à un changement alimentaire de 2 jours (diète à base de paille) avec un retour progressif de l'alimentation contrôle.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve nutritionnelle transitoire correspondant à une diète de 48h. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée de la diète et du retour à une alimentation normale (J-7 à J9 ; 15 jours), au moins 2 fois par jour au moment de la traite, et dans leur lot d’élevage, afin de veiller au bien-être des animaux. En cas de manifestation simultanée de plusieurs signes cliniques (animal prostré, isolé, respirant vite, ayant une forte température >41.5°C pendant plus de 2 heures, anorexique) une intervention vétérinaire aura lieu et l’animal sera sorti du protocole si nécessaire. D’après la bibliographie, nous attendons des réductions de poids de 8% en moyenne pendant la période de restriction alimentaire. A ces pertes moyennes, peuvent s’additionner des variations individuelles parfois importantes (écart type = 4.3% ; variations observées entre -1% et -19% ; données personnelle) mais dans tous les cas, toutes les chèvres avaient récupéré 90% de leur poids initial dès 2 jours après la reprise alimentaire. Des pesées et l’évaluation de l’état corporel seront réalisées tous les jours sur la période d’épreuve alimentaire (J- 7 à J9 ; 15 jours). Une perte de poids >15% s’accompagnera d’un retrait immédiat de l’animal du protocole, et celui-ci intégrera l’alimentation contrôle de façon anticipée

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, les animaux concernés seront sorties du protocole et soignés . Dans le cas de non recouvrement de leur santé, la mise à mort sera opérée par le veterinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimentés et habilités de la structure. Les animaux sont prévus d'être réutilisés pour une épreuve inflamatoire au minimum 1 mois après l'epreuve alimentaire et selon l’avis de la vétérinaire SBEA.

Remplacement

La réponse suite à la diète nutritionnelle du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo

Réduction

Nous demandons une nouvelle saisine pour 54 chèvres. Ces 54 chèvres étaient prévues dans une precedente saisine mais du fait du covid et de changements sur l'etablissement utilisateur , cela n’a pu avoir lieu et nous n’avons pas utilisé ces 54 animaux dans la précédente saisine (autorisant 100 chèvres au total). Cet effectif de 100 se justifie comme suit. Nous voulons observer des différences entre 0.5 et 1 x l’écart type de la valeur du dosage de métabolite. Il s’agit de 7 variables pour des dosages sanguins et 13 variables pour des dosages de lait. Ceci implique que nous ayons entre16 et 63 animaux par groupe (2 lignées LGV+ et LGV-), soit un total de 32 à 126 chèvres. Au vu des possibilités expérimentales nous avons donc proposé d’évaluer 100 chèvres au total sur 2 années. Les analyses statistiques des métabolites s’appuieront sur des analyses de variance, intégrant les effets de l’année (100 chèvres sur 2 années), du jour de mesure et de la lignée. Des classifications non supervisées seront également conduites (ACP, clustering hiérarchique) pour identifier des types de réponse différents, indépendamment de l’appartenance aux lignées.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur une litière paillée. Le milieu sera enrichi avec des brosses et des plateformes en bois. Elles seront nourries à volonté (hors diète de 48h et retour progressif +24h à la ration normale). Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être manipulés. Les prélèvements seront réalisés alternativement à gauche et droite du cou pour ne pas sensibiliser la zone de ponction. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué, en massage sur les veines, en cas de besoin. Un apprentissage aux prises de sang sera mis en place avant la période où la fréquence des ces prélèvements sera élevée, soit durant le mois précédent la diète. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance journalière pendant la durée de la diète (48h) et pendant les 7 jours suivants. Des points de limites ont été mis en place -hyperthermie >41,5 °C pendant plus de 2 heures -décubitus sternal -anorexie Un animal presentant 2 des signes suivants sera traité et écarté de l’essai et placé sous surveillance jusqu’à son rétablissement complet. Par ailleurs une perte de poids >15% s’accompagnera d’un retrait immédiat de l’animal du protocole, et celui-ci intégrera l’alimentation contrôle de façon anticipée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse métabolique des ruminants sont particulières à ces especes. Nous utilisons des chèvres primipares non gestantes en lactation, afin d’évaluer la réponse à une épreuve nutritionnelle (diete de 48h) mais également l’impact de l’épreuve sur la production de lait et le métabolisme énergétique en phase productive.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras pendant dix semaines pour provoquer obésité et diabète, et toutes reçoivent jusqu'à vingt-deux injections sous anesthésie locale et une dizaine de prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur cherche à neutraliser une protéine pour traiter la prise de poids provoquée par un médicament de la schizophrénie. Il affirme l'usage d'animaux vivants "indispensable", l'appétit et le comportement alimentaire étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Le médicament étudié est utilisé pour le traitement de la schizophrénie. Contrairement à d’autres molécules, ce produit ne provoque pas d'effets secondaires notables. Cependant, le traitement par ce médicament a été associé à des augmentations de poids cliniquement significatives et à l’induction du diabète. Il a récemment été découvert qu'une protéine libérée par les cellules et les organes agit comme un stimulateur. L'augmentation systémique de cette protéine augmente de manière extracellulaire l'apport alimentaire, réduit la glycémie et favorise la génération de graisses au niveau systémique. La neutralisation de cette protéine apparaît comme une cible d'intérêt dans la lutte contre l'obésité, du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de cette étude expérimentale est de déterminer si la neutralisation de cette protéine peut traiter l'obésité induite par le médicament étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie thérapeutique dans des modèles précliniques pour prévenir ou traiter l'obésité induite par certains médicaments.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections (pour un groupe 22 injections (sur 11 semaines), pour un un groupe 4, et pour un groupe 5 injections, durée 1 minute, sous anesthésie locale). La moitié des souris sera soumise à des régimes riches en gras pendant 10 semaines. Tous les animaux seront soumis à 10 micro-prélèvements de sang (durée 1min) et à 1 prélèvement de sang plus important en fin de procédure (durée 2min, sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les régimes riches en gras induisent une prise de poids et peuvent être obésogènes et induire le diabète. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort local et transitoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, leur score sera déterminé, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antiinflammatoire non stéroïdien (metacam). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour le projet proposé, la physiologie et la génétique de la souris sont suffisament proches de celles de l'être humain pour pouvoir tirer des conclusions valides des procédures envisagées. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de phalange, des injections intrapéritonéales, une chirurgie de dénervation chimique par injection d'une toxine dans le tissu adipeux, un régime hypercalorique et une exposition au froid à 6 °C, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur répète que ces gestes n'entraînent "aucune nuisance supplémentaire", la fonction étudiée étant présentée comme "bénéfique". Les retombées, une nouvelle cible thérapeutique contre l'obésité, restent renvoyées à l'avenir, et le porteur justifie le prélèvement de tissus non utilisés par une banque censée réduire le recours futur à d'autres animaux.

Objectifs

L’obésité, qualifiée d’épidémie depuis 1997 par l’OMS, touche plus de 1,9 milliards d’adulte dans le monde. De plus, l’OMS prévoit qu’un quart de la population mondiale sera obèse d’ici 2045. L’obésité se caractérise par une surcharge pondérale et favorise le développement de nombreuses complications et qui impliquent le dysfonctionnement de nombreux organes, tels que le foie et le tissu adipeux. Dans ce contexte, contrairement aux effets délétères associés à une augmentation de la production de glucose (sucre) par le foie, la production intestinale de glucose (PIG) est une fonction particulièrement intéressante, puisqu’elle améliore le métabolisme. En effet, le sucre produit par l’intestin active un signal nerveux qui se traduit, au niveau du cerveau, par une induction de la satiété (diminution de la prise alimentaire), une augmentation de la sensibilité à l’insuline et une diminution de la production de glucose par le foie. Le rôle important de la PIG dans la régulation du métabolisme a été démontré grâce à la caractérisation du phénotype de deux modèles murins : d’invalidation ou d’induction de la PIG. Ainsi, les résultats montrent que la PIG est capables de favoriser ou de protéger de l’apparition de nombreux troubles métaboliques tels que l’obésité, le diabète, la stéatose hépatique ou encore la dyslipidémie. Plus particulièrement, ces études ont permis de mettre en évidence le rôle de la PIG dans la régulation du métabolisme du tissu adipeux, et notamment sur sa fonction de production de chaleur (thermogenèse) qui est un poste de dépense d’énergie important dans la résistance au froid, mais également dans le maintien de la balance énergétique (et par conséquent du poids corporel). En effet, de nombreuses études visent à augmenter la dépense d’énergie en modulant la thermogenèse du tissu adipeux, dont on sait qu’elle est diminuée au cours de l’obésité. Puisque cette fonction est principalement sous le contrôle du système nerveux sympathique (SNS), cette étude vise à déterminer si les effets de la PIG sur le métabolisme du tissu adipeux passent une activation du SNS et préciser les mécanismes impliqués. Cette étude est réalisée dans différentes conditions nutritionnelles afin de nous d’étudier les effets métaboliques de la PIG dans un état physiologique (régime standard) et pathologique (régime hypercalorique riche en gras et en sucre).

Bénéfices attendus

La PIG est une fonction qui exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique lorsque les souris sont soumises à un régime hypercalorique pendant 5 mois. De plus, l’activation de la PIG améliore le métabolisme du tissu adipeux en diminuant l’adiposité et en augmentant la thermogenèse (production de chaleur) par le tissu adipeux brun (TAB) et le tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), se traduisant par une amélioration de la tolérance au froid. Néanmoins, alors que les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la PIG sur la résistance au froid et la protection contre l’obésité restent encore mal compris, nous proposons ici que le système nerveux sympathique innervant les tissus adipeux jouerait un rôle essentiel. Ainsi, grâce à ce projet, une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu permettra à l’avenir de proposer la PIG comme une nouvelle cible thérapeutique contre l’obésité, dont la prévalence à l’échelle mondiale a considérablement augmenté ces dernières années.

Procédures

Les différents modèles de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet seront obtenus par modification génétique. Ainsi, une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours est nécessaire pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation génétique de la PIG ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Néanmoins, l’invalidation de la PIG sera réalisée par un traitement injecté (dans le péritoine) à l’âge de 6-8 semaines (5 jours de suite). Les souris de type naturel (contrôle) recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Afin de déterminer si les effets bénéfiques de l’induction de la PIG passent par le système nerveux sympathique du tissu adipeux brun interscapulaire (TAB) ou du tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), nous réaliserons des chirurgies de dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine directement dans l’un de ces tissus. Ces chirurgies seront réalisées chez des souris contrôles ou ayant une PIG activée, nourries avec une alimentation standard ou hypercalorique. Cette intervention est très rapide n’excédant pas 15-20min par animal. Les effets de la dénervation sur la résistance au froid seront évalués après une exposition des souris à une température froide. Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal , 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier les tissus adipeux et l’intestin.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en PIG présentent un phénotype anxieux léger (comportement exploratoire diminué et plus forte résignation). Néanmoins, d’après notre expérience, l’hébergement en groupe et l’apport d’enrichissement est suffisant pour atténuer l’anxiété. Les souris chez lesquelles la PIG est activée seront nourries avec un régime standard ou riche en graisses et en sucres. Ce dernier favorise la prise de poids et le diabète, néanmoins, avec le temps de régime prévu dans ce projet, les souris seront étudiées à un stade précoce afin de limiter les complications liées à ces maladies. De plus, la PIG étant une fonction bénéfique, aucune nuisance supplémentaire n’est attendue. Nous réaliserons une dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine dans les différents tissus adipeux (l’un ou l’autre) de souris contrôles ou chez lesquelles la PIG est activée (nourries avec un régime standard ou hypercalorique). Cette dénervation sympathique est une bonne alternative à la dénervation chirurgicale qui est plus invasive et moins spécifique. De plus, l’injection locale restreinte à un tissu n’entraine aucun effet délétère ou douloureux (ni aucun problème de cicatrisation). Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal, 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. Une dénervation du TAE sera réalisée chez des souris nourries avec une alimentation standard. Dès le lendemain de la chirurgie, les souris seront soumises à un régime hypercalorique pendant 1 mois (4 semaines). La dénervation du TAE ne devrait pas entrainer d’effets indésirables supplémentaires par rapport à celle du TAB. De plus, l’apport d’un régime hypercalorique pendant seulement 4 semaines permet de limiter les dommages sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la production de sucres (glucose) par l’intestin. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la fonction étudiée, la production de glucose par l’intestin, a des impacts sur l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté au niveau des senseurs de glucose (détecteurs) dans les vaisseaux sanguins entre l’intestin et le foie, et qui vont transmettre un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie, régulant en particulier le métabolisme du tissu adipeux.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique pertinente, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, 160 souris mâles transgéniques et de type naturel (contrôles). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe 3-4 souris par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Les procédures sont maitrisées par les personnes en charge de l’expérimentation animale. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Dans les conditions d’hébergement (groupe et enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris déficientes en production intestinale de glucose. Cependant, une attention particulière sera portée sur cette lignée ayant une susceptibilité à l’anxiété augmentée dans des conditions de challenge du stress. Une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera mise en place lors des chirurgies .

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production endogène de glucose, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet a été largement caractérisé au laboratoire depuis de nombreuses années. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J, lignée murine choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Cette souche a également été choisie car c’est une bonne souche pour l’étude du diabète et des maladies métaboliques. Les animaux provenant d’un éleveur agréé (souris de type naturel: C57BL/6J) seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Cela permet de limiter les biais expérimentaux dus à des conditions d’hébergement différents. A l’âge de 6-8 semaines, les souris (qui vont devenir déficientes en PIG) recevront des injections pour induire la modification génétique. Ces injections se font à l’âge adulte pour limiter les effets de la molécule sur le métabolisme des jeunes souris. L’activation de la PIG ne nécessite aucune intervention, mais les souris seront étudiées aux mêmes âges pour pouvoir comparer les résultats. Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ainsi, à l’issu des différentes procédures, les souris âgées de 13, 14, 17 ou 34 semaines, seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser.

Une partie des souris est invalidée pour le gène Slc20a2 et ne produit pas la protéine PiT2, que l'équipe pense impliquée dans la production de chaleur par les tissus adipeux. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la pesée et l'analyse de leurs organes. Une partie reçoit jusqu'à 14 semaines un régime riche en graisse, certaines à thermoneutralité, et les souris subissent à jeun une prise de sang à la veine mandibulaire, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec cinq microprélèvements en deux heures par incision de la queue, sans anesthésie. Le porteur fixe le point limite à une prise de poids de 50 à 60 %, et prévoit une "légère réduction de la mobilité non dommageable".

Objectifs

Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de PiT2 comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité

Procédures

Les souris seront pesées une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (Les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue, limitant le stress des animaux). Un prélèvement de 50µl de sang sera réalisé sur souris à jeun par ponction de la veine mandibulaire. Une semaine puis deux semaine avant la fin de la procédure, 5 micro-prélèvements seront réalisés sur une durée de 2h à l'aide d'une légère incision, maîtrisée par les expérimentateurs de ce projet et sous contrôle du personnel de la SBEA.

Impact sur les animaux

Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Pour les mesures de tolérance au glucose et à l’insuline, les prélèvements de sang sont faits à l'extrêmité de la queue, à l'aide d'une légère incision sur animaux vigiles : douleur légère et de courte durée. Une prise de 50μl de sang sera réalisée au niveau de la veine mandibulaire pour les dosages hormonaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)

Remplacement

Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.

Réduction

D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).

Raffinement

Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène Slc20a2 qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de PiT2 dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras et sucré, une chirurgie du cerveau sous anesthésie, des injections sous-cutanées, dans le ventre et directement dans le cerveau, des prélèvements sanguins sur animal éveillé et des jeûnes de 6 à 16 heures, pour étudier le rôle d'un récepteur dans la régulation du poids. Le porteur renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier un "organisme vivant intègre" que ni les cultures cellulaires ni aucun modèle informatique ne pourraient remplacer.

Objectifs

Le système endocannabinoïde représente une cible thérapeutique potentielle pour combattre l’obésité et le diabète de par sa capacité à réguler la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Le récepteur aux cannabinoïdes CB1, qui fait partie de ce système, est présent dans plusieurs organes impliqués dans le métabolisme énergétique et glucidique. Il est notamment présent dans certains neurones du cerveau et dans certaines cellules pancréatiques. Ce récepteur a différentes localisations subcellulaires (à la surface ou à l'intérieur de la cellule). Ces cellules sont aussi très sensibles aux changements d’alimentation et participent activement à la régulation du métabolisme pour maintenir à terme un poids et une glycémie stable. Une étude récente suggère un rôle d'un sous-type de récepteur CB1 dans la modulation de la fonction des neurones et des cellules pancréatiques. Notre objectif général est de comprendre le rôle de ce récepteur CB1 dans la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Nous combinerons des approches pharmacologiques, comportementales, métaboliques, moléculaires et neuro-anatomiques.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir des informations sur comment l'organisme répond à la surcharge calorique, ainsi que de trouver de potentielles cibles thérapeutiques. Les bénéfices attendus à long-terme sont de permettre l'élaboration de nouveaux traitements pour l’obésité et le diabète.

Procédures

- Changement de régime alimentaire : le nouveau régime est plus gras et plus sucré. Il est palatable pour les animaux mais induit une obésité à long-terme. La consommation de ce régime durera entre une et 12 semaines. - Tests métaboliques avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles : le suivi de la glycémie implique que les animaux soient non anesthésiés. - Chirurgie stéréotaxique (= cérébrale) et vasculaire, sous anesthésie générale, avec protocole d'analgésie post-chirurgicale. - Injections sous-cutanées, intra-péritonéales et intra-cérébro-ventriculaires : cela nécessite de prendre les animaux en contention pendant quelques secondes. - Jeune de 6h ou 16h

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’isolement en cage individuelle : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (6h ou 16h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10 à 15% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau du scalp et le périoste devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La perte de poids ne devrait pas durer plus de 3 jours (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Le but de notre activité de recherche est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant à l’obésité. Lors d’un déséquilibre énergétique, plusieurs structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé par des techniques in vitro. Toutefois, nous réaliserons des tests pharmacologiques in vitro sur îlots pancréatiques en culture, ce qui limitera le nombre d’animaux. Cependant, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la balance énergétique restent inconnus. Enfin, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour tester notre hypothèse sont largement développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement (le calcul est détaillé en 3.4.10). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil à résonnance magnétique nucléaire, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide d’un test t de Student (2 groupes) ou par analyse de variance (ANOVA) à 2 facteurs, suivie si nécessaire d’un test post-hoc de Tukey (plus de 2 groupes). Dans le cas des mesures répétées (évaluation de la prise alimentaire, du poids corporel dans le temps), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et les métabolismes glucidique et lipidique sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités sont développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité du génome murin et humain fait de la souris un bon modèle prédictif lors d’études d’inactivation de gènes. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 3 semaines. Les procédures expérimentales débuteront après au minimum 1 semaine d’habituation. Etant donné l’impact significatif de l’âge sur le métabolisme énergétique et glucidique, ces expériences seront réalisées sur des souris jeunes (4 semaines) ou plus âgées (24 semaines).

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.