Système endocrinien

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour injecter un produit dégradant un réseau de molécules cérébrales, un isolement individuel pendant toute l'étude, une contention en tube pour mesurer la composition corporelle et un test de glycémie, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle de ce réseau dans l'obésité et le diabète, dans une perspective thérapeutique que le porteur renvoie au "plus long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour ces interactions complexes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Le poids corporel d’un individu est fortement influencé par l’activité de différents neurones, qui agissent sur la prise alimentaire, le stockage de graisse, la dépense d’énergie et participent à la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang). Certains de ces neurones sont entourés d’un réseau de molécules qui forment comme un filet autour d’eux. Ce filet est appelé filet périneuronal (FPN), et participe à la fonction et la maturation des neurones qu’il enveloppe. Dans le contexte de l’obésité, le rôle de ce FPN est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est de dégrader le FPN dans une région cérébrale impliquée dans le contrôle du poids, de la prise alimentaire et de la régulation de la glycémie, afin d’en étudier les conséquences, en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons notamment connaître le rôle joué par le FPN dans la susceptibilité à développer une obésité et à dérégler le contrôle glycémique. Pour ce faire, nous utiliserons au total 80 souris mâles et femelles, chez lesquelles nous injecterons un produit qui dégrade le FPN par neuro-chirurgie. Certaines de ces souris seront nourries avec une alimentation hypercalorique pour rongeur et comparées à celles qui resteront sous une alimentation standard. Nous mesurerons l’évolution du poids, de la prise alimentaire, de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre), ainsi que le contrôle glycémique. À la fin de l’étude, nous récupèrerons les cerveaux de ces souris pour des analyses in vitro complémentaires.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle du filet périneuronal dans le développement de l'obésité et du diabète de type II, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, le FPN est présent aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration du FPN, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. Tous les animaux de cette étude (80) sont concernés par l’ensemble des gestes suivants : 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 3 semaines. 2) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 3) Test de régulation de la glycémie : ce test nécessite de réaliser sur les souris une injection après un jeûne de 5 heures, puis de mesurer leur glycémie à 7 temps différents temps post-injection, par pélèvement d'une goutte de sang. Ce test est réalisé sur souris vigiles, avec un intervalle de temps d’au moins 15 minutes entre chaque mesure. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude. 4) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle, pour nous permettre de mesurer la prise alimentaire de chaque animal. L’isolement débutera dès l’arrivée des souris et jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Pour réduire au maximum le stress ressenti par les animaux, nous avons prévu une période d’habituation d’une semaine à l’expérimentateur. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Au-delà de du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. Notre protocole d’analgésie le jour de la chirurgie et les jours suivants permet cependant une prise en charge efficace des douleurs post-opératoires liées à l’incision de la peau du crâne. Les animaux seront suivis quotidiennement la semaine suivant la chirurgie et toute aggravation de leur état fera l’objet d’une évaluation, avec des points limites précoces qui déclencheront une prise en charge analgésique supplémentaire et des points limites terminaux qui entraîneront la mise à mort immédiate de l’animal pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

À l’issue de l’unique procédure de cette étude, tous les animaux (80) seront mis à mort par une injection d’euthanasiant. Nous récupérerons par la suite leur cerveau, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les changements neuro-moléculaires associés à la dégradation du filet périneuronal.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de la dégradation du filet périneuronal sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différentes expériences sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de mofication de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, le filet périneuronal est présent à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par leur alimentation, elles reçoivent une supplémentation en poudre de baie de goji et subissent des prises de sang par incision de la queue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage et injection, et des isolements temporaires que le porteur relie à un stress social. Les souris sont ensuite tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que l'effet d'une telle supplémentation ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Les effets santé des baies de goji ont été partiellement étudiés et plusieurs travaux rapportent un effet protecteur vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. La baie de goji est également riche en phytomicronutriments comme les caroténoïdes ou les composés phénoliques. Cependant, le rôle de ce cocktail de phytomicronutriments dans les effets santé de la baie de goji reste mal compris. En particulier, les interactions entre phytomicronutriments et fibres pourraient jouer un rôle majeur sur la bioaccessibilité et la métabolisation des phytomicronutriments par le microbiote. De plus, les baies en provenance de la Chine sont essentiellement consommées sèches, et les modalités de séchage induisent sans doute des modifications de l’état d’oxydation des phytomicronutriments, de la structure physique et chimique des polysaccharides ainsi que des interactions phytomicronutriments-polysaccharides.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact des conditions de culture et des traitements post-récolte sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la baie de goji avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage (dans le cas du test de tolérence au glucose), et une injection intrapéritonéale (test de tolerance à l'insuline). Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie apres micro-incision du bout de la queue. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution de FITC-dextran. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose (test de tolerance au glucose), ou une dose de FITC-dextran (perméabilité intestinale) et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (test de tolérance à l'insuline). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant dans le cerveau une substance bloquant la réaction inflammatoire, puis leur comportement alimentaire est mesuré sous régime standard puis gras. Le porteur étudie le rôle de l'inflammation cérébrale après un repas sur la satiété, avec un lien aux troubles alimentaires humains présenté comme une perspective. Il indique que l'implantation de la pompe empêche toute réutilisation, ce qui justifie selon lui la mise à mort de toutes les souris.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire après un repas (PIR) sans fièvre ni douleur est bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs pro-inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Dans les cellules, les nutriments activent un senseur moléculaire. Ce senseur active la caspase1, une enzyme qui transforme la pro-interleukine 1β (pro-IL-1β) en sa forme active l’interleukine 1β (IL-1β). Tant qu’elle n’est pas chronique, la production d’IL-1β semble exercer un rôle positif sur le contrôle glycémique périphérique, stimulant la sécrétion d’insuline et l’utilisation de glucose). Cependant, le rôle de la PIR dans un contexte physiologique reste mal compris. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, en particulier dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. La PIR est faible et presque indétectable après un repas standard, mais elle devient visible après un repas riche en graisses. La PIR cérébrale pourrait constituer une réponse physiologique en favorisant le maintien de l’homéostasie énergétique. Dans l’hypothalamus, elle serait impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire et favoriserait la sensation de satiété, freinant ainsi la consommation de calories en excès lors d’un repas gras. Le projet de recherche consistera à bloquer la PIR au niveau central chez la souris puis à étudier les effets de cette inhibition sur le comportement alimentaire. Nous pourrons ainsi évaluer si la PIR modifie la fréquence et/ou la taille des repas, dans différentes conditions nutritionnelles (alimentation standard ou grasse/hypercalorique). Il s’agira d’administrer dans le cerveau, une substance empêchant la formation du senseur moléculaire, ou une substance bloquant l’action de l’IL-1β sur les cellules cibles, ou un inhibiteur de l’enzyme produisant l’IL-1β. L’étude prévoit 162 souris.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de définir pour la première fois le rôle de l’inflammation cérébrale transitoire postprandiale sur le comportement alimentaire. En particulier nous définirons le rôle de certains acteurs moléculaires de la réaction inflammatoire : un complexe protéique, une enzyme et un composé B activé par cette enzyme. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d'antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux des groupes « traitement » subiront une chirurgie stéréotaxique et un traitement pharmacologique qui devraient impacter le comportement alimentaire en comparaison avec les groupes « témoin » subissant la chirurgie mais ne recevant pas les antagonistes. Nos travaux précédents conduisent à l’hypothèse selon lequel les animaux traités auront un comportement alimentaire non modifié sur alimentation standard équilibrée (mesurée pendant 3 jours) mais présenteront une hyperphagie par perte de satiété sur alimentation HFD (mesurée pendant 3 jours). Aucune anorexie et/ou anhédonie ne sont attendues en réponse à la chirurgie, aux différents traitements pharmacologique, ou à l’individualisation.

Devenir

Les 162 souris ayant subi une chirurgie mettant en place une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La procédure décrite, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. De plus, les animaux seront leur propre témoins en étant exposés au régime standard puis au régime enrichi, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet également de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. En l’absence de données dans la littérature, les expériences pharmacologiques à mener imposent de tester différentes doses de différents agents pharmacologiques. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, les concentrations les plus faibles pour chaque agent pharmacologique seront étudiées en premier. Si celles-ci s’avèrent suffisantes pour conclure quant à l’implication de la voie de signalisation antagonisée (différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et de carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une voie anesthésiante locale sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection de liquide physiologique sera administrée dans la cavité abdominale en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (dôme de nidation et coton). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. L’équipe maîtrise la chirurgie stéréotaxique chez le rongeur, comme en attestent des publications depuis plus de 20 ans, et elle a installé un environnement technique dédié qui fait référence (vidéo-monitoring, développement de masque anesthésique spécifique, gestion de la douleur, etc). Ce savoir-faire accroît le raffinement des procédures. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris C57BL/6J jeunes adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique de la souris.

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée à la patte, avec injections cinq jours sur sept pendant quatre semaines et suivi par imagerie, pour tester des molécules contre un cancer pédiatrique, le rhabdomyosarcome. Le porteur précise n'utiliser que des femelles, notamment pour limiter les bagarres entre mâles. Il affirme que le modèle animal est le seul à intégrer les facteurs physiologiques en jeu, les retombées cliniques étant renvoyées à un transfert ultérieur.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, le rhabdomyosarcome (RMS) représente 5% des tumeurs pédiatriques solides. Ces tumeurs malignes d’origine musculaire se développent dans diverses localisations, principalement dans la tête et le cou (40%), la vessie et les organes reproducteurs (20%), les membres (20%) et le tronc (10%). La survie à cinq ans des patients est d'environ 75 %, alors qu'elle est inférieure à 30 % chez les patients dont la maladie s'est propagée à d'autres parties du corps (maladie métastatique). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. Une famille de nouvelles molécules ciblant la production d'énergie a été identifiée dont il faut démontrer qu’elles possèdent les caractéristiques de candidats médicaments anti-tumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale des RMS chez l’enfant et l’adolescent. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité anti-tumorale de ces molécules, c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume des tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (rhabdomyosarcomes) et de confirmer les résultats déjà obtenus en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) et au niveau de la queue en intra-artérielle (Durée : 20 min maxi) ; 2x avant l’imagerie par l'échographie pour la préparation des animaux (Durée : 5 min maxi par point d’acquisition) ; 2x (lors du constat de la prise de greffe et en point final) pour l'imagerie par échographie (Durée : 10-20 min maxi par point d’acquisition) ; 13x max pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 5 jours/7 injection des molécules pendant 4 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (1x/semaine) pendant 91 jours maximum.

Impact sur les animaux

Implantation intra-musculaire (IM) : Avant l’implantation IM, l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. Puis, l’implantation IM sous anesthésie entraine une douleur légère. Le suivi de l'évolution du volume tumo va engendrer un stress léger lors de la mesure au pied à coulisse de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Implantation intra-veineuse ou intra-artérielle : L’implantation va entrainer une douleur légère. Développement des tumeurs/dissémination et imagerie : Le suivi dudéveloppement de tumeurs et/ou leur dissémination (métastases) peut engendrer une douleur modérée. Uniquement pour l’imagerie par bioluminescence, les animaux vont devoir recevoir en vigile une injection de luciférine en intra-péritonéale qui va engendrer une douleur légère. Traitements : Les animaux des procédures (3 et 4) reçoivent une injection en intra-péritonéale du traitement standard (Doxorubicine) ou des composés d’intérêt (MS-C2 et MS-C3) qui génèrent une douleur légère au début qui peut évoluer vers une douleur modérée suite à la répétition des injections (5J/7 des composés à tester ou 2J/7 le traitement standard) pendant les 4 semaines de traitement. Les effets secondaires pour le traitement standard et l’administration des composés d’intérêt sont connus et n’entrainent pas de douleur. La toxicité des molécules a été évaluée précédemment in vivo chez la souris et n’a pas montré de souffrance des animaux aux doses que nous allons utiliser. Les molécules MS-C2 et MS-C3 sont resuspendus dans du DMSO (= véhicule) et lors des traitements, seront injectées en présence d’un excipient lipidique (huile raffinée) dédiée et certifiée pour l’usage vétérinaire en injection. La concentration finale de DMSO dans l’excipient est ~1% et aucun signe particulier de souffrance ou d’irritation n’a été relevé chez les souris ayant reçu ce traitement lors des expériences réalisées selon le même protocole. Elles ont permis de déterminer la Dose Maximale Tolérée (DMT) utilisable pour un protocole de traitement incluant une injection intra-péritonéale 5J/7 pendant 4 semaines. Avec le traitement standard, nous allons observer une diminution de la taille des tumeurs donc une diminution potentielle de la douleur mais nous ne savons pas avec les composés d’intérêts.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Des études précédentes sur des cellules cancéreuses et sur des embryons de poulet ont montré qu'une nouvelle famille de molécules était efficace sur la tumeur et les métastases. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’intervenir dans les effets de la molécule testée. Aucune donnée bibliographique n’est disponible sur ces molécules à l'heure actuelle.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, deux lignées cellulaires humaines, qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir à le mettre à mort. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Deux lignées cellulaires humaines qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dont le système immunitaire est altéré est nécessaire pour étudier l’efficacité du nouveau traitement sur des cellules de cancers pédiatriques humaines sans rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté, toutefois très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Les premières expériences de greffes en intra-musculaire au niveau de la patte ont été menées avec des femelles et ont permis l’obtention de tumeurs dans 90% des cas. Uniquement des femelles sera utilisée afin d’être dans les mêmes conditions que le projet précédent et aussi de limiter le risque d’agressivité/bagarre inter-individu par rapport aux mâles dans les cages et être obligé d’écarter des individus ou les mettre à mort suite à des blessures. Les essais chez le mâle seront ultérieurement envisagés en fonction d’effets endocriniens potentiels car actuellement aucune information n'est disponible. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est plus fiable et donne des résultats clairs pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.