Système endocrinien

256 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine porte, pour certaines couplée à la suppression d'une voie nerveuse spinale, puis une perfusion de solution sucrée sur 24 heures, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie et de troubles de la motilité intestinale liés à la chirurgie. Il étudie comment l'intestin signale le glucose au cerveau et affirme que ces dialogues entre organes ne peuvent s'étudier sur cellules ou organoïdes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de glucose (sucre) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. En effet, le glucose sécrété dans la veine porte (localisée à la sortie de l’intestin) induit un signal nerveux - appelé signal « glucose-portal » - qui cible les régions du cerveau du contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique. Différents circuits nerveux entourent la veine porte et permettent la détection des informations nutritionnelles et leur transmission au cerveau. La détection du glucose dans la veine porte pourrait impliquer les nerfs qui utilisent le transmetteur CGRP (Calcitonin gene related protein). Une partie de ces nerfs passe par une chaine ganglionnaires qui longe la colonne vertébrale pour apporter les informations au cerveau (voie nerveuse spinale). Les objectifs de ce projet sont de déterminer comment la détection du glucose est réalisée dans la veine porte et quelle est la voie nerveuse impliquée. Plus précisément, l’objectif de ce projet est de déterminer : 1/ Le rôle du neurotransmetteur CGRP dans la transmission du signal depuis la veine porte jusqu’au cerveau 2/ L’implication de la voie nerveuse spinale dans cette transmission Pour cela, nous étudierons si une augmentation de glucose dans la veine porte chez des souris transgéniques invalidées pour le neurotransmetteur CGRP, ou chez des souris non transgéniques dont la voie nerveuse spinale est altérée, active les zones du cerveau connues pour réguler la prise alimentaire ou l’équilibre de la glycémie.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. Ce projet nous permettra d’identifier comment la production intestinale de glucose active le cerveau. Trouver des agents agissant sur ces mécanismes pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

- A l’âge de 12 semaines, 32 souris recevront un régime enrichi en protéines et seront mise à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, 64 souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte sous anesthésie et analgésie. Après une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris recevra une perfusion de solution sucrée et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, un groupe de 32 souris subira une chirurgie sous anesthésie et analgésie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une suppression de la voie nerveuse spinale. Un autre groupe de 32 souris subira une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une intervention semblable mais qui ne touche pas la voie nerveuse spinale. Après au moins une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris de chaque groupe recevra une perfusion de solution sucré et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures, à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Il est possible de rencontrer des difficultés lors de la pose des cathéters en veine porte. Les souris subissant cette chirurgie pourront présenter une détérioration du vaisseau ou l’apparition d’une hémorragie. La suppression d'une partie de la voie spinale peut conduire à une altération de la motilité intestinale et des sécrétions et provoquer plus de défécation.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de mesurer l’expression des transporteurs de glucose dans la veine porte en utilisant plusieurs techniques d’imagerie et de quantification. Pour déterminer comment les informations nutritionnelles issues de la veine porte activent le cerveau, l’activation du cerveau sera mesurée par des marquages spécifiques sur des coupes histologiques de cerveaux fixés, obtenus après mis à mort d’animaux profondément anesthésiés.

Remplacement

Le glucose produit par l’intestin est détecté par des senseurs de glucose dans le circuit sanguin situé entre l'intestin et le foie (veine porte). Cette détection va être transmise par un signal nerveux de la veine porte vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux vers la périphérie pour contrôler l'équilibre énergétique. La production de glucose par l'intestin et la détection du glucose dans la veine porte ont donc des impacts sur l’ensemble du métabolisme et impliquent des dialogues entre organes. Pour comprendre comment ces fonctions régulent l'organisme, les étude ne peuvent donc pas être réalisées sur cellules ou organoïdes. Pour comprendre précisément le rôle du signal nerveux entre intestin et cerveau, les études seront réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant un neurotransmetteur.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit au maximum 16 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus Au total, ce projet nécessitera au maximum 256 souris mâles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris contrôles C57BL6J seront commandées à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. L’implantation du cathéter dans la veine porte pour la perfusion de glucose sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les animaux seront observés et pesés régulièrement. L’apport de nourriture et d’eau sera particulièrement suivi et adapté pour palier à un excès éventuel de défécation, qui pourrait être induit par la suppression du système nerveux spinal. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.

Choix des espèces

Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Deplus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.

60 microcèbes, primates non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés dans l'élevage. Chaque animal subit une mise à jeun et deux séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie, IRM puis TEP avec traceur radioactif, pour évaluer l'effet des matières grasses laitières sur le métabolisme cérébral au cours de la croissance et du vieillissement. Le porteur signale les risques d'hypothermie et d'arrêt respiratoire liés à l'anesthésie. Il affirme que ces interventions nutritionnelles portant sur l'organisme entier ne peuvent être remplacées par des expériences sur cellules.

Objectifs

Les preuves scientifiques permettant de démontrer l'intérêt de l'introduction de matières grasses laitières dans l'alimentation des jeunes et des plus âgés sont peu nombreuses. Toutefois, les études chez les rongeurs laissent penser que la matière grasse laitière pourrait avoir des effets bénéfiques tout au long de la vie, lors de la croissance mais aussi, lors du vieillissement. Des études pilotes suggèrent même que l’ingestion de produits laitier au plus jeune âge pourrait avoir un impact à long-terme bien au-delà de la période pendant laquelle ils sont consommés. Ce projet permettra de mieux comprendre si l’ingestion de matières grasses laitières à différents âges de la vie peut avoir un impact positif sur les fonctions cognitives tout au long de la vie, incluant la phase critique du vieillissement, période pendant laquelle les fonctions cognitives déclinent naturellement. Nous émettons ici l'hypothèse que la matière grasse laitière pourrait avoir un impact favorable sur les fonctions cérébrales, et en particulier sur les fonctions cognitives, à plusieurs moments de la vie. Cet impact positif pourrait être procuré notamment grâce aux acides gras oméga-3 à longue chaîne qu’elle contient, contrairement à la matière grasse végétale qui n’apporte que des acides gras oméga-3 à courte chaîne. Ces acides gras oméga-3 pourraient permettre une meilleure utilisation par le cerveau de sa principale source d’énergie, le glucose. Pour tester notre hypothèse, nous proposons une étude pour déterminer si l'introduction de matières grasses laitières dans le régime alimentaire de primates non-humains omnivores, par rapport à un régime à base d'huiles végétales, a un impact sur le fonctionnement cérébral et en particulier sur l’utilisation par le cerveau de l’énergie apportée par les matières grasses) lors de deux périodes de la vie : la croissance (allant de la conception jusqu’à la maturité sexuelle, soit environ l’âge d’un an) et le vieillissement. Par conséquent, le projet aura pour objectif de démontrer que l’introduction de matière grasse laitière dans l’alimentation de modèles animaux âgés permettrait d’améliorer l’utilisation du glucose par le cerveau. Cette dernière partie sera étudiée en utilisant l’imagerie cérébrale TEP (Tomographie par émission de positrons) afin d’identifier des changements locaux d’activité métabolique cérébrale.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront pour la première fois d’évaluer l’impact de la matière grasse laitière sur le fonctionnement cérébral dans deux contextes importants pour la physiologie humaine en s’appuyant sur les résultats obtenus avec un modèle primate non-humain : 1) au cours de le croissance (jusqu’à l’âge de 12 mois) et 2) au cours du vieillissement. L’étude au cours de la croissance permettra d’évaluer les effets à long terme de la matière grasse laitière. L’étude chez les animaux âgés est aussi importante que celle réalisée en période périnatale. En effet, cette étude visera à décrypter les mécanismes cérébraux associés au vieillissement. Ce projet présente l'avantage d'étudier l'impact de la matière grasse laitière au cours des périodes clés ciblées (croissance et vieillissement). Il s'agit d'un projet unique, original et pertinent, qui permettra d'étudier l'impact de la matière grasse laitière sur les fonctions cognitives mais aussi de décrypter les mécanismes métaboliques, physiologiques et moléculaires qui les sous-tendent. Ces travaux sont menés chez un primate omnivore afin de pouvoir être mieux appliqués à l’Humain par la suite et de participer à élaborer des conseils nutritionnels adaptés à tous les âges de la vie pour une meilleure santé cognitive.

Procédures

Ce projet comporte 1 procédure, comprenant 2 actes expérimentaux par animal, chacun appliqué aux animaux jeunes et âgés. Le premier acte expérimental consiste en une cartographie par imagerie par résonnance magnétique (IRM) de l’anatomie cérébrale des individus (environ 1h), étape nécessaire et préalable au deuxième acte qui consiste en la réalisation d’une mesure de l’utilisation cérébrale du glucose par tomographie par émission de positrons (TEP, environ 1h). L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé sur une période maximale de 4 semaines, incluant les temps d'acclimatation, la mise à jeun, l’imagerie, la décroissance radioactive et la récupération post-anesthésie.

Impact sur les animaux

Le présent projet nécessite la mise à jeune et l'anesthésie d'animaux. Les anesthésies nécessaires aux protocoles d'imagerie IRM et TEP constituent une nuisance potentielle, comme la mise à jeun, ou le risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire, Cependant, les protocoles d’anesthésies sont bien maîtrisés au sein du laboratoire et validé par le vétérinaire. , En en plus, les paramètres physiologiques comme la température corporelle et la respiration sont suivis sur chaque animal sous anesthésie afin d’évaluer en continu l’état de profondeur de l’anesthésie.

Devenir

Les actes expérimentaux décrits ci-dessus n'induisant pas d'effet indésirable à long terme, le replacement de l'ensemble des animaux dans l'élevage est prévu.

Remplacement

Ces expériences ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives puisqu’elles nécessitent l’exposition précoce au régime alimentaire pré-définiet notamment l’allaitement des petits par les mères. Les interventions nutritionnelles ayant par définition des effets sur l’organisme entier (de la digestion à l’utilisation des micronutriments et de leurs métabolites par les différents organes), ces expériences ne sauraient être remplacées par des expériences in vitro sur cellules.

Réduction

Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, ces expériences seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (10 animaux par condition expérimentale, soit un total maximal de 60 animaux). Ces animaux sont issus d’une cohorte, dont le descriptif a été détaillé lors d’une précédente saisine. Ce nombre est suffisant pour évaluer les effets de régimes car les deux procédures (IRM et TEP) sont hautement sensibles et répétables. Les effectifs, déterminés à partir d’un test , prennent en compte la variabilité interindividuelle attendue au sein des groupes expérimentaux pour les mesures d’IRM et TEP (paramètres qui présentent la plus grande variabilité) et permettront de réaliser des tests statistiques avec assez de puissance

Raffinement

Les conditions générales de l’élevage seront conservées (fréquence de nourrissage, enrichissement, maintien des groupes sociaux) et les procédures appliquées seront organisées de sorte à laisser des temps de récupération longs entre deux procédures. Toute procédure entraîne un suivi attentif de chaque animal afin de s’assurer de leur bien-être. Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (12 mois an) pour le groupe « jeune » et à l’âge de 7 ans pour le groupe « âgé ». L’objectif scientifique du projet étant d’étudier l’impact des matières grasses laitières sur les fonctions cérébrales au cours du développement et du vieillissement, ces deux catégories sont nécessaires. Les interventions nutritionnelles nécessitent l’exposition périnatale au régime et notamment l’allaitement des petits. Le microcèbe gris présente la particularité d'être omnivore, se nourrissant aussi bien de végétaux (feuilles et fruits) que d'animaux (petits mammifères ou reptiles, insectes). En tant que mammifère, il se nourrit naturellement de lait maternel (contenant donc naturellement de la matière grasse animale) pendant les 2 premiers mois de sa vie. Les altérations liées à l'âge, comparables à celles observées chez l'homme, apparaissent dès l'âge de 5 ans. De nombreuses études ont montré les similarités des changements cérébraux liés à l’âge entre ces deux espèces. Ce modèle représente donc un parfait compromis entre une longévité relativement longue, des facilités d'élevage dues à sa taille et une bonne proximité phylogénétique et physiologique avec l'homme.

17 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées. Chacune subit une ovariectomie et la pose d'un implant d'estradiol sous anesthésie, la pose répétée de cathéters dans la veine jugulaire et jusqu'à 24 prélèvements de sang sur dix heures, répétés six fois, pour tester des analogues de kisspeptine destinés à maîtriser la reproduction des animaux d'élevage. Le porteur présente ce projet comme une piste pour supprimer les traitements hormonaux qu'il juge éthiquement contestables. Il affirme que la reproduction ne peut s'étudier que sur organisme entier et que le passage à l'animal reste incontournable.

Objectifs

Actuellement, la maîtrise de la reproduction des animaux d'élevage repose principalement sur la stimulation de l'ovulation par des hormones. Des systèmes considérés plus « naturels », tel l'effet mâle, sont aussi utilisés mais leur efficacité est moindre. Pour différentes raisons, ces deux approches ne répondent pas de façon satisfaisante aux attentes sociétales (absence de contaminant dans les produits consommés et de pollution de l'environnement) et à celles des producteurs (efficacité et rentabilité). Nous avons, dans un projet précédent, développé des analogues à partir d’un neurotransmetteur endogène, la kisspeptine (Kp) comme piste originale pour réduire voire éliminer l’utilisation d’hormones. Ce neurotransmetteur joue un rôle clé dans la stimulation de la reproduction, mais son instabilité métabolique, et par conséquent sa durée d'action trop courte, empêche son utilisation sur le terrain. Nous avons donc conçu et synthétisé des analogues avec une durée d'action plus importante que la molécule naturelle. Le présent projet vise à étudier l'effet de différentes formes de Kp humaine sur la fonction de reproduction des brebis, pour développer l'analogue le plus efficace possible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont 1) comprendre la différence d'effet de différentes isoformes de Kp entre deux organismes, 2) mettre en place une forme de Kp optimale pour stimuler la reproduction de la brebis et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction des animaux d'élevage (notamment ici, la brebis). De façon plus globale, ce projet vise à élaborer une stratégie d’élevage des animaux de rente avec une meilleur prise en compte du bien-être animal et des attentes sociétales en supprimant les traitements hormonaux et en trouvant des alternatives aux traitements actuellement mis en place et éthiquement contestables.

Procédures

- Ovariectomie et pose d’implant d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis (environ 2 heures) - Retrait d’implants d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis - Pose et dépose de cathéters dans la veine jugulaire sur animal vigile : 2 fois chez 17 brebis - Prélèvements de sang sur animaux vigiles par ponction de la veine jugulaire via un cathéter : 24 prélèvements sur 10h pour 17 brebis, répété 6 fois.

Impact sur les animaux

La kisspeptine est une molécule employée à de nombreuses reprises dans notre laboratoire dans le cadre de projets antérieurs. De plus, le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les ovins. D'après notre expérience, suite à une injection aigüe de kisspeptine aucune nuisance ou effet indésirable n'est observé. En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets peuvent être observés, notamment suite à l'ovariectomie ou la pose des cathéters, des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'analgésiques au moment des procédures.

Devenir

Les animaux auront été ovariectomisés, soumis à l'implantation d'un cathéter dans la jugulaire et injectées avec des isoformes de kisspeptine avec une durée de vie courte (de l'ordre de quelques minutes/heures), les animaux pourrons alors aisément être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La reproduction est un mécanisme physiologique intégré extrêmement complexe qui ne peut être étudié que par une approche in vivo. Il en est de même pour toutes les études visant à la contrôler. Notre niveau de connaissances actuelle est largement insuffisant pour espérer mettre en place par exemple une approche de modélisation informatique afin de prédire comment le système répond à un stimulus donné ou pour une quelconque approche de substitution, comme des cultures cellulaires, capable de reproduire les phénomènes complexes d’intégration qui ont lieu au niveau de l’organisme entier. Cependant, l'activité des molécules à tester in vivo dans ce projet a déjà été caractérisée in vitro. Le passage à l'animal reste incontournable en l'état actuel de nos connaissances.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement. Dans le souci de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre d'injections et de prise de sang réalisées sur chaque animal, nous prévoyons de tester plusieures molécules par animal à minimum 3 jours d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de laisser le temps aux molécules injectées de ne plus être détectable dans le sang et de pouvoir tester la molécule suivante sans crainte d'avoir une interaction avec la molécule précédente. Chaque groupe test d'une forme de Kp (composé de 7 animaux) sera comparé avec un groupe contrôle (composé de 17 animaux répartis sur chaque série de tests) pour assurer la validité scientifique et la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et seront également en groupe lors des procédures afin de minimiser au maximum le stress lié à la contention dans des cages individuelles qui sont souvent employées pour ce genre de procédures. Les méthodologies utilisées dans le cadre de ce projet ne dépasseront pas une douleur de classe modérée et nous mettrons en œuvre tout notre possible afin de garantir le bien-être de l’animal en lui apportant les soins adéquats en fonction des besoins. Dans cet optique, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (notamment isolement) et l'apparence des brebis (notamment au niveau des plaies chirurgicales et implantation du cathéter) sera suivi avec attention et les animaux seront pesés (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après l'ovariectomie. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). En cas de douleur les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux (baisse d'appétit, prostration, décubitus prolongé). Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés (par exemple prostration, décubitus prolongé, anorexie...) les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux. En cas d’hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l’animal serait réanesthésié et nous rechercherions le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

La brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Nous avons choisi d’utiliser la race Ile de France pour les brebis parce que c’est le modèle sur lequel nous avons obtenu nos résultats précédents et parce que c’est une race d’élevage d’intérêt économique important. Adulte pour étudier un animal sexuellement développé avec un axe gonadotrope actif.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 sur la langue, elles subissent un régime obésogène, des mises à jeun répétées, des tests de préférence au gras, un gavage au glucose et des prélèvements de sang, avant le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'obésité induite entraîne un inconfort et de possibles complications. Le bénéfice annoncé se limite à décrire une nouvelle souche génétiquement modifiée servant de modèle pour de futures questions sur le goût du gras.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récepteurs aux acides gras dont l’un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Cette étude a pour but d’étudier le rôle spécifique de CD36 au niveau de la langue. Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas le récepteur CD36 au niveau de la langue.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang) (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), et une individualisation ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test double choix (2 tests par semaines). Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les tests de préférence rapide au gras (mesure des lapements pendant 5 minutes) nécessiteront également une mise à jeun de 12h avant chaque test avec une pesée avant mise à jeun et après test permettant l’évaluation du poids des souris. Les souris seront soumises à un test nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes et gavage de 100 µL pour 10g de masse corporelle) et 5 prélèvements sanguins de faible volume (5 µL à chaque temps soit 25 µL au total) seront réalisés sous anesthésie locale. A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent être sous stress, des suites de prélèvements répétés lors de la glycémie ou encore des suites d’individualisation pour les tests double-choix.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’obésité est une pathologie faisant intervenir une communication inter-organes in vivo qui se caractérise par des altérations du métabolisme des lipides, des glucides et du comportement alimentaire. Ces paramètres métaboliques et comportementaux ne peuvent s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. De plus, les souris sont habituées à la contention pour les pesées hebdomadaires, et après la mise à mort des souris la collecte des tissus permet de construire une banque d’organes. Enfin, chaque geste technique est réalisé par les personnels qualifiés et entrainés ce qui diminue le stress.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène.

120 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection virale dans la veine de la queue, un gavage de glucose et des injections d'insuline et de tyloxapol, entrecoupés de nombreux prélèvements de sang, pour étudier le rôle d'un récepteur du foie dans les maladies liées au gras. Le porteur décrit des douleurs après les injections et les prélèvements, prises en charge par un analgésique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour mimer la complexité d'un organisme, et rappelle qu'aucun traitement efficace n'existe à ce jour.

Objectifs

Les pathologies métaboliques touchant le foie se développent de plus en plus dans les pays industrialisés et peuvent évoluer vers des formes plus graves de la maladie pouvant se révéler mortelles. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, mais certains acteurs du métabolisme du cholestérol peuvent constituer de nouvelles cibles d’intérêt. L’activité du récepteur P2Y13 est particulièrement étudiée par notre équipe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier son rôle, en procédant à son invalidation au niveau hépatique, chez des souris soumises à un régime riche en graisses. Nous y étudierons le développement de l'insulino-résistance, de la stéatose et de la fibrose hépatique afin d'évaluer l'implication de ce récepteur dans le développement ou la protection contre ces pathologies. Les résultats obtenus constitueront un appui de recherche fondamentale et pré-clinique permettant d’évaluer l’importance physiologique et physiopathologique du récepteur P2Y13 dans le développement des pathologies métaboliques touchant le foie. Ils définiront une potentielle cible thérapeutique pour la prévention ou le traitement de ces maladies, pour lesquelles, pour rappel, il n'existe pour l'heure pas de composés suffisamment efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier l'implication du récepteur P2Y13 au niveau hépâtique dans l'établissement de la steatose hépatique.

Procédures

La solution de particules adenovirales (AAV) sera injectée dans la veine caudale (1 injection par souris sur toute la durée de l’expérimentation). Au cours de l'expérimentation, chaque souris recevra un gavage oral de glucose accompagné de 2 prélèvements sanguin à la veine caudale (30 min avant et 15 min après l’administration du glucose), 1 injection intra-péritonéale d'insuline suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 30, 60, 90, et 120 min après l’injection d’insuline) et 1 injection de tyloxapol suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 1, 2 et 4h après l’injection de tyloxapol) Pour chaque animal, les interventions de gavage au glucose et d’injection intra-péritonéale d’insuline et de Tyloxapol seront espacées de 8 jours .

Impact sur les animaux

Douleurs post-injection et post-prélèvement sanguin : un analgésique (Carprofen 5mg/kg, dilué dans PBS stérile) sera administré par voie sous-cutanée à la fin de la manipulation et le lendemain.

Devenir

A l'issue de l'étude, les animaux seront euthanasiés et les tissus prélévés seront utilisé au maximum dans une démarche de recherche scientifique saine et préaleblement inteligement réfléchie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur P2Y13 dans le développement de la stéatose hépatique (NAFLD) et de la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Afin de mimer au mieux la complexité d’un organisme, aucun modèle actuel (études in vitro ou études informatiques) ne permet de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour ce genre d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour pouvoir réaliser des analyses statistique au terme de chaque procédures suivant les recommandation mathématiques de chaque situation (ANOVA ou Student t-test) Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons validé et adapté l’ensemble des analyses biologiques à de petites quantité de matériel (sang, tissus) et nous avons optimiser l’obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible, telle que la réalisation de procédures différentes à 8 jours d’intervalle. Les procédures se feront uniquement sur des souris mâles car l’étude de la contribution des œstrogènes n’est pas pertinente dans notre projet.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en œuvre pour respecter /optimiser le bien-être des animaux utilisés et la fiabilité́ des résultats qui seront obtenus. Ces solutions sont détaillées ci-dessous: Bien-être : -L'hébergement des animaux dans des locaux totalement adaptés (zootechnie de Rangueil) -Le respect de la période d'acclimatation de l'animal (4 jours) -Une surveillance quotidienne de l'animal par du personnel qualifié -Euthanasie de l'animal s’il est détecté́ comme étant en souffrance (prostration, perte de poids supérieure à 20%) -La présence d'un enrichissement (papier ou igloo) dans chaque cage -Plusieurs animaux par cage en conservant les groupes sociaux constitués au départ (4 au minimum à 6 au maximum) -Utilisation de l'anesthésie générale lors des procédures expérimentales qui le nécessite (Procédure n°1). Faire les injections et les prélèvement sanguins au niveau de la veine caudale par un expérimentateur formé à la manipulation et l'utilisation des animaux, et, ayant de l'expérience sur les méthodes. Utiliser un analgésique en péri- et post-injection (Carprofen). Surveillance des animaux par la responsable SBEA de la zootechnie afin d'optimiser les soins aux animaux après les procédures expérimentales Optimisation des expériences: -Notre recul sur la qualité́ des mesures enregistrées aux cours des procédures telles que les test de tolérance au glucose et a l’insuline (procédure n°3 et 4) ou la mesure de la sécrétion hépatique des VLDL (procédure 5). -La réduction du nombre d'animaux: optimiser l'obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible ; des aliquots dédiés de différents organes seront réalisés afin d'optimiser leur utilisation pour diverses analyses biologiques (western blot, séquençage, analyses biochimiques,...). -Optimisation de la qualité́ des données par la mise en place de conditions optimales pour leur obtention (pièce calme, réduction du nombre d'expérimentateur dans la pièce à 1 ou 2) et à l’utilisation de test statistiques appropriés (ANOVA ou Student t-test selon les recommandations mathématiques de chaque situation)

Choix des espèces

L'espèce souris est choisie pour ce projet car il générera des données qui compléteront des résultats déja obtenus sur ce modèle. D'une manière générale, nous disposons d’une grande expertise de l’utilisation de cet animal et des procédures nécessaires à la réalisation de nos travaux. Ce modèle permet en outre d’étudier l’implication de différentes voies de signalisation et la communication entre les différents tissus de l'organisme. De plus, les données scientifiques de référence sont très nombreuses permettant d’avoir un recul sur la qualité de nos résultats. Enfin, la souris est un animal qui possède un taux élevé de reproduction ce qui permet d’avoir à disponibilité un nombre suffisant d’animaux pour la réalisation de nos travaux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à des animaux matures, ne manifestant pas d'altérations du métabolisme énergétique ou d'atteintes hépatiques qui peuvent être observées chez des souris plus agées.