Système endocrinien

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur transfère des lymphocytes T qui déclenchent un diabète auto-immun, avec injections répétées et jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, l'hyperglycémie entraînant soif, perte de poids et baisse d'activité avant l'euthanasie. Le projet vise de nouvelles immunothérapies ciblant les lymphocytes responsables de la destruction des cellules du pancréas. Le porteur affirme que la validation de ces stratégies passe forcément par des "organismes entiers", les composés étant d'abord testés in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par une perte totale ou quasi-totale de la capacité du pancréas à produire de l’insuline, hormone essentielle pour réguler le taux de glucose dans le sang. La perte de la fonction insulinique est due à la destruction des cellules béta du pancréas par son propre système immunitaire. Parmi l’ensemble des cellules immunitaires se sont les lymphocytes T qui sont majoritairement retrouvés au niveau des lésions pancréatiques et qui sont responsables de la destruction des cellules bêta. Les modèles murins ont permis de mettre en évidence que l’apparition de la maladie se fait en deux étapes consécutives dans des tissus anatomiquement distincts. Premièrement, les lymphocytes T sont activés dans les ganglions lymphatiques drainant le pancréas. Puis ils infiltrent le pancréas où ils vont pouvoir aller détruire spécifiquement les cellules bêta. L’Europe et l’Amérique du Nord ont les taux d’incidence les plus élevés, supérieurs à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en des injections régulières d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie ciblant les lymphocytes T impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Le diàbète de type 1 est une maladie auto-immune dont l’incidence en Europe et Amérique du Nord est supérieure à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en un apport quotidien d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Nous espérons que nos études contribueront à jeter les bases de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces sur le diabète de type I. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus pour ce projet devraient contribuer au développement de nouvelles stratégies immmunothérapeutiques pour d’autres pathologies auto-immunes.

Procédures

1. Injection dans la cavité abdominale : Pour reduire le nombre de cellules dans le sang, qui est nécessaire pour déclencher la maladie. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 2. Injection intra-veineuse : Pour injecter les lymphocytes tueurs autoréactifs. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 3. Injection intra-veineuse : 1 seule fois pour chaque animal. Pour injecter un traitement à base de cellules. L'injection prend moins de 10 secondes. 4. Injection dans la cavité abdominale : Pour injecter un traitement à base d'anticorps. 6 injections maximum par souris. L'injection prend moins de 10 secondes. 5. Prélèvements sanguins : Les souris seront suivies pour l’apparition du diabète en mesurant le taux de glucose dans le sang. Une goutte de sang obtenue par ponction dans la veine de la queue est suffisante pour relever une mesure. Un maximum de 10 prélèvements par souris. Cela prend moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris seront surveillées pour détecter l'apparition de la maladie en mesurant les niveaux de glucose dans le sang tous les 3 jours. Une goutte de sang sera prélevée dans la veine de la queue à cette fin. Les prélèvements répétés peuvent causer du stress aux animaux. Au cours de nos expériences, certaines souris vont développer un diabète auto-immun constaté par une hyperglycémie, ce qui marquera la fin de nos expériences. Cette condition peut entraîner une douleur légère ou modérée pendant les 1 ou 2 derniers jours de l'expérience avant l’euthanasie des animaux. L'hyperglycémie apparaît vers le 10ème jour après le transfert de cellules T. Après ce point, les souris commencent à uriner plus fréquemment. 3-4 jours après l'apparition de l'hyperglycémie, les souris présenteront des poils dressés, une perte de poids et une mobilité réduite. Les animaux seront euthanasiés après deux mesures consécutives supérieures à 300 mg/dL. Les injections provoquent une gêne de très courte durée chez les souris. Les cellules ou les anticorps injectées ne doivent avoir aucun effet indésirable notable sur les souris.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée à J11 pour prélèvement des organes. L’autre partie sera suivie notamment pour l’apparition du diabète. Les animaux seront euthanasiés au fur et à mesure de l’expérience quand ils présentent des signes de souffrance ou deux valeurs consécutives de glycémie supérieure à 300 mg/dL. Les expériences seront arrêtées au bout de 30 jours et toutes les souris encore en vie à ce moment là seront euthanasiées pour pélèvement d’organes.

Remplacement

Le diabète est une maladie auto-immune qui implique différents acteurs du sytème immunitaire ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, pancréas...). La validation de nouvelles stratégies d’immunothérapie implique donc forcément l’utilisation d’organismes entiers. Cependant, les composés nouvellement développés seront systématiquement testés et validés in vitro et seules les approches ayant données des résultats probants in vitro seront évaluées in vivo chez la souris.

Réduction

La réalisation des expériences in vivo est conditionnée par l’obtention au préalable de résultats probants in vitro. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui évite de réaliser un tri lors des naissances des souris. Pour les expériences d'apparition du diabète, 12 souris par groupe seront nécessaires pour avoir des résultats significatifs. D’après notre expérience avec ce modèle, pour des expériences de caractérisation des cellules T ex vivo, 9 souris par groupe devraient être suffisantes pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre d'animaux représente le minimum requis.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des portoirs ventilés dans un milieu enrichi. Nous nous basons sur une grille de score pour évaluer le comportement et l’état des animaux tous les 2 à 3 jours. Si nous constatons un problème (perte de poids excessive, poil hérissé…) les souris seront euthanasiées. L’apparition d’un diabète se traduit par le fait que les souris commencent à uriner plus fréquemment, une perte de poids et une baisse de l’activité. Afin d’améliorer la condition des souris, dès le début de l'hyperglycémie, une observation quotidienne des cages et du niveau des biberons sera effectuée. De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, elle sera directement deposée dans la cage.

Choix des espèces

Le projet proposé ici est basé sur nos résultats précédents obtenus en utilisant notre modèle de souris transgénique de diabète auto-immun. Outre les modèles de diabète auto-immun spontané, plusieurs modèles de maladie induite chez des souris transgéniques ont été générés, qui permettent de suivre facilement et rapidement le devenir des cellules T responsables de la destruction des cellules bêta du pancréas. Les animaux utilisés seront des animaux âgés de 8 à 16 semaines. A cet âge les souris ont un système immunitaire suffisamment développé pour les besoins du projet. Par ailleurs, ceci nous permettra d’être dans la continuité des précédents travaux menés par l’équipe.

375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées reçoivent un traitement déclenchant une inflammation du foie, avec des prises de sang obtenues par une entaille au scalpel de la veine de la queue étalées sur six heures, avant la mise à mort pour prélèvements. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans les maladies chroniques du foie. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont souvent associées à des problèmes de diabète, d'obésité. Ces complications hépatiques vont d’un foie gras jusqu'au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à divers signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Afin de répondre à notre problématique, nous utilisons des animaux qui n’expriment une molécule présente à la surface des cellules immunitaires et qui est connue pour contrôler les fonctions de ces cellules. Ces souris seront soumises à un traitement favorisant l’apparition d’une inflammation au niveau du foie mimant celle observée au cours des maladies chroniques chez l’homme. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact des cellules immunitaires dans ces maladies et pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, d’une part, d’apprécier la contribution exacte des cellules de l'immunité dans la mise en place de l’inflammation hépatique et d’autre part de définir le rôle de notre molécule d’intérêt dans ce contexte pathologique. Ainsi, notre étude permettra de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression d’une inflammation au niveau du foie qui est un évènement crucial dans le développement et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules immunitaires comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.

Procédures

Un prélèvement de sang de 200µl sera réalisé aux temps T0, 2H, 4H et 6h. Les souris seront placées brièvement (5minutes) sous une lampe chauffante afin de dilater la veine caudale. Une entaille à l'aide d'une lame de scalpel sera réalisée à T0 (1 à 2 secondes). Aux temps suivants (2H, 4H et 6h), un simple passage bref (moins de 30 secondes) sous la lampe chauffante suffira pour récupérer les 200µL de sang.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs : modification de l'état de la fourrure, prostration, difficulté de déplacement, respiratoire et d'ouverture des yeux, absence de réponse aux stimuli. Le protocole expérimental durera 6h maximum et de ce fait il n’est pas attendu de perte de poids. Les souris seront sous surveillance toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec un nombre minimum d’animaux. Cette approche est basée sur des groupes de 10 animaux avec la réalisation des tests statistiques suivants : ANOVA ou Student ou Mann-Whitney si la distribution des valeurs ne suit pas une distribution gaussienne. Nous utiliserons des souris mâles ou femelles permettant ainsi d’utiliser l’ensemble des animaux de notre élevage. Il est prévu 3 séries d’expériences mais si dès la deuxième série les résultats sont significativement significatifs, nous ne réaliserons pas la dernière série. Nous prévoyons d'utiliser 375 souris maximum sur une période de 5 ans. Les souris sous fond génétique C57BL/6 proviendront de notre élevage pour les deux procédures (souris invalidées pour notre molécule d'intérêt et souris contrôles issues de notre élevage). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). Nous utiliserons la technique de cytométrie spectrale dans notre étude qui présente l’avantage de nécessiter moins de cellules pour l’analyse et donc in fine moins d’animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les souris seront traitées au lipopolysaccharide (LPS) entre 6 et 10 semaines d’âge

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une obésité et un diabète leur sont induits par un régime gras et des injections de streptozotocine, avec tests de tolérance au glucose, prises de sang répétées et densitométrie, avant l'euthanasie pour prélever leurs os et d'autres organes. Le porteur indique que la streptozotocine peut provoquer douleur transitoire et hypoglycémie, et que l'excès de poids peut gêner la mobilité des souris obèses. Il affirme qu'un modèle cellulaire isolé ne peut rendre compte des interactions entre tissus recherchées ici.

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de mettre en place un modèle animal atteint d’obésité et de diabète de type 2 (DT2), afin d’étudier in vivo les altérations de fragilité osseuse liées à l’obésité et au diabète. En France 56 % des hommes et 40 % des femmes souffrent de surpoids ou d'obésité, un problème de santé publique qui favorise l’apparition de diabète et d’hypertension artérielle, responsables de complications rénales et cardiovasculaires. Selon des études cliniques et fondamentales, l’obésité et sa complication en diabète (hyperglycémie), sont aussi associées à une fragilité exacerbée des os et un risque de fracture augmenté. Ces anomalies osseuses s’accompagnent d’une augmentation de graisses qui s’acumulent dans la moelle osseuse, ainsi que d’altérations inflammatoires dans la moelle osseuse et dans les tissus périphériques. Cela suggère des effets délétères de l’accumulation de graisses sur le renouvellement de l’os et sa résistance. Cependant, les mécanismes par lesquels l’obésité et le diabète amplifient l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse n’ont pas été identifiés. De plus, le rôle de ces graisses dans la fragilisation des os chez les individus obèses/diabétiques, reste à élucider. Le présent projet vise à évaluer chez la souris obèse diabétique : 1) l’accumulation et la distribution des graisses de la moelle osseuse, 2) l’impact de ces graisses sur la masse et la qualité du tissu osseux, 3) l’effet de l’obésité et du diabète sur la capacité de transformation des cellules stromales/précurseurs de la moelle osseuse en cellules graisseuses, et 4) à analyser la production de molécules immunoinflammatoires et leur rôle dans la formation de graisses et dans la fragilisation de l’os. Le modèle d’obésité induit chez les rongeurs à l’aide d’un régime alimentaire riche en graisses, est décrit comme un modèle de choix pour l’étude des conséquences de l’obésité sur la santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la relation physiopathologique entre les désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète, et les maladies de fragilité osseuse. Il vise à générer des données à fort potentiel translationnel pouvant conduire au développement d’outils novateurs pour la prédiction, la prévention et la prise en charge des pathologies osseuses chez l’Homme. A court terme, ce projet permettra de valider la mise en place d’un modèle animal d’obésité et de diabète, représentatif de la pathologie humaine. Les études proposées apporteront des informations précieuses quant aux conséquences de l’obésité et du diabète sur la fragilisation des os. Elles pourraient éclairer le rôle précis de l’élévation de la graisse médullaire et de ses facteurs sécrétés, dans l’apparition d’altérations de la structure et de la microarchitecture des os. Les analyses prévues portent sur différents sites osseux afin d’apprécier la sensibilité spécifique de chaque site aux effets de l’obésité et du diabète. Le suivi longitudinal non invasif par densitométrie in vivo, permettra de corréler l’apparition des atteintes de masse osseuse avec la sévérité de l’obésité et du diabète. Des molécules liées à l’immuno-inflammation seront également mesurées dans les tissus et dans le sang circulant prélevés sur les animaux. Les résultats attendus pourraient permettre l’identification de biomarqueurs circulants et/ou tissulaires pour une évaluation précose et prédictive des atteintes ostéomédullaires et osseuses dans le contexte de l’obésité et du diabète. Si les résultats s’avèrent concluants, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles études translationnelles et cliniques, pour évaluer l’intérêt de l’adiposité médullaire et de molécules immuno-inflammatoires séléctionnées dans des stratégies de prise en charge des pathologies de fragilité osseuse. De plus, compte tenu de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète et leurs conséquences multiples sur la santé humaine, la validation du modèle animal peut à terme, ouvrir la voie vers de nouvelles collaborations avec des partenaires qui s’intéressent à d’autres complications du diabète.

Procédures

La procédure proposée dans le présent projet implique plusieurs gestes expérimentaux appliqués aux groupes d’animaux utilisés. Dans un premier temps, les souris seront mises sous régime alimentaire contrôle (LFD) ou riche en graisses (HFD) pour induire une obésité. Après 4 semaines de régime alimentaire contrôle ou gras, les souris maintenues vigiles recevront 3 injections intrapéritonéales de solution de streptozotocine (STZ) (groupes HFD/STZ) ou de tampon (groupes HFD et contrôle LFD) ; une injection par jour pendant 3 jours consécutifs. Pour vérifier la mise en place de la pathologie du diabète (hyperglycémie) dans les groupes HFD/STZ, des mesures de glycémie à jeun et des tests de tolérance au glucose (IPGTT) et à l’insuline (IPITT) seront réalisés sur tous les groupes d’animaux maintenus vigiles. La glycémie sera mesurée sur une goutte de sang prélevée dans la veine de la queue après ponction à l’aide d’une aiguille. Elle sera mesurée au début du protocole puis toutes les 4 semaines. Les tests IPGTT et IPITT sont prévus à deux temps, aux semaines 7 et 15 du protocole. Après une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose (pour IPGTT) ou d’insuline (pour IPITT), une série de 5 mesures de glycémie seront réalisées à des intervalles de 15-30 minutes. Un temps de récupération de 3-4 jours est prévu entre le test IPGTT et le test IPITT. Les animaux de la cohorte 3 (60 souris) recevront aussi 3 injections intrapéritonéales de marqueurs fluorescents dont la sécurité est validée. Les 3 injections sont prévues sur les animaux maintenus vigiles aux semaines 12, 14 et 16 (la veille de la mise à mort). Enfin, tous les groupes d’animaux du projet (180 souris/3 cohortes) subiront des mesures par densitométrie (scanner) pour évaluer la composition corporelle en fonction du régime appliqué. Trois mesures de densitométrie (semaines : 0, 8 et 16) seront réalisées sur les souris sous anésthésie générale au gaz d’isoflurane ; chaque mesure dure 4-6 minutes d’acquisition. Deux prises de sang sont également prévues (aux semaines 8 et 16) sur tous les animaux. La première sur les souris vigiles, est prévue par ponction de la veine latérale de la queue et à l’aide d’un capillaire après application locale d’un gel anesthésique. Le second prélèvement est prévu par ponction cardiaque sur les souris sous anesthésie générale terminale à l’isoflurane, juste avant mise à mort (semaine 16) pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés comme modèle pathologique d’obésité et de diabète, induit par un régime alimentaire gras avec ou sans injections de streptozotocine (STZ). Le modèle est largement décrit dans la littérature, les principales nuisances / effets indésirables inhérents aux procédures expérimentales prévues sont les suivants : - Pendant les injections IP de solution de STZ ciblant les cellules du pancréas, comme déjà obsevé dans un protocole du laboratoire (n°2021060316221938), les animaux peuvent manifester un stress limité dans le temps voire une douleur transitoire (12-24 heures) dus au pH acide de la solution de STZ. Un risque de prostration de l’animal peut être aussi observé pendant 30 à 60 minutes post-injection en raison d’un risque d’hypoglycémie consécutive à l’injection de STZ. Une surveillance renforcée sera mise en place jusqu’à rétablissement complet de l’animal puis 2 surveillances par jour au minimum. - Lors des injections IP de solutions de marqueurs fluorescents, ou de solution de glucose/insuline pour les tests de tolérance au glucose/insuline, les animaux pourraient subir un stress limité dans le temps. Lors des prises de sang pour les mesures de glycémie, la ponction de la veine caudale pour le prélèvement sanguin peut induire une douleur localisée et ponsctuelle. Pour la prise de sang prévue à la 8ème semaine du protocole, un gel de pramocaïne 1% (anesthésique local) sera appliqué préalablement à la ponction. - Une prise de poids qui pourrait provoquer une gêne limitée à la mobilité des animaux obèses (HFD) à partir de la semaine 12 du protocole. Après installation d’une hyperglycémie diabétique chez les animaux traités avec la STZ (groupes HFD/STZ), la prise de poids peut s’inverser par comparaison aux animaux des groupes HFD. Le poids des animaux sera donc contrôlé de manière hebdomadaire et son impact sur le bien-être des animaux sera pris en compte dans la surveillance des points limites.

Devenir

Le présent projet vise à étudier l’impact de l’obésité et du diabète de type 2 (DT2) sur l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse, et les conséquences de ces graisses sur le tissu osseux qui augmenteraient la fragilisation des os et le risque de fracture. Ainsi, à la fin de la procédure expérimentale proposée, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse.

Remplacement

Le projet proposé vise à étudier in vivo les mécanismes physiopathologiques qui expliqueraient les relations observées entre accumulation d’adiposité médullaire (graisse de la moelle osseuse) et développement de fragilités osseuses dans le contexte d’obésité et de diabète. Ce contexte de pathologies métaboliques, complexes et multifactorielles, et ses conséquences systémiques nécessitent une approche d’étude intégrée, qui tient compte des interactions multiples entre tissus et entre tissus et facteurs moléculaires circulants. Ainsi, le modèle de souris obèse/diabétique constitue un modèle de choix et bien établi pour mimer la pathologie humaine. De plus, ce projet s'intéresse à l’implication de facteurs métaboliques et des molécules immuno-inflammatoires circulantes dans le sang, dont l’étude requiert un modèle d'étude chez l’animal vivant. L’utilisation d’alternatives basées sur des modèles cellulaires isolés in vitro ne pourra répondre à ces objectifs. Les hypothèses et les objectifs de ce projet s’appuient sur des études complémentaires déjà réalisées in vitro sur des modèles de cellules souches de la moelle osseuse, exposées à des stimulations métaboliques et immuno-inflammatoires. Ces études in vitro ont permis d’identifier des molécules qui pourraient impacter le tissu osseux et dont l’évaluation nécessite un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité à un maximum de 20 par groupe pour assurer des résultats statistiquement comparables. Ce nombre tient compte des données de la littérature, et des analyses prévues devant faire l’objet de tests statistiques. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans le présent projet, plusieurs analyses sur plusieurs sites osseux seront regroupées dans la même étude et sur les mêmes groupes d’animaux. Les mêmes prélèvements osseux (e.g. le même tibia) serviront à la fois pour des analyses par histologie et par immunohistochimie. Le deuxième tibia de chaque animal servira pour des analyses par microtomographie (microCT). Ce même tibia (comme tous les autres prélèvements osseux) sera scanné par microCT, une première fois pour analyser la microarchitecture osseuse, et une seconde fois pour évaluer la graisse de la moelle osseuse après un traitement spécifique de l’échantillon. Pour réaliser un suivi de l’apparition des atteintes osseuses et de la composition corporelle au cours du temps, et en conformité avec le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures (scans) à l’aide d’un densitomètre sont prévues sur les mêmes souris in vivo. Outre la réduction du nombre de groupes d’animaux utilisés à différents temps de suivi, cette approche permettra aussi de réduire les biais expérimentaux liés à la variabilité interindividus des mesures réalisées. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les projets du laboratoire, d’autres organes seront récupérés et utilisés dans un autre projet collaboratif qui s’intéresse à l’étude des dysfonctions vasculaires et rénales liées au diabète.

Raffinement

Les animaux, hébergés par groupes de ~4-6 souris/cage, seront inclus dans le protocole après 1-2 semaines d’acclimatation dans l’établissement d’expérimentation. Avant injection intra-péritonéale de la solution de streptozotocine (STZ), les souris seront prélablement habituées à des injections de sérum physiologique afin de prévenir/réduire le risque de stress. Après injection de la STZ, une surveillance renforcée sera mise en place pendant au moins une heure puis au minimum 2 fois par jour. La surveillance portera sur des signes relatifs au bien-être et l’état général de l’animal, son comportement et son alimentation. En cas de mal-être persistant, une eau de boisson à 10% de sucrose sera fournie à l'animal pendant 24 heures, et des aliments hydratés seront déposés au fond de la cage. Le poids corporel sera également mesuré une fois par semaine. Une perte de poids excessive (>15% du poids initial avant injection STZ) et persistente pendant 3 jours consécutifs, entraine une sortie du protocole et la mise à mort de l’animal. Pour préserver la qualité de l’alimentation, les aliments sont entièrement remplacés 2 fois par semaine. Lors de la ponction de la veine caudale pour prélèvement sanguin, un gel anesthésique sera préalablement appliqué localement. Les mesures in vivo de la composition corporelle à l’aide d’un scanner (densitomètre ou microCT) seront réalisées sur les animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui garantit une sédation rapide et un réveil rapide des animaux. Enfin, après développement d’une hyperglycémie, la litière sera changée plus fréquement (~2 fois/semaine) en raison d’un risque d’augmentation de la fréquence/volume d’urines.

Choix des espèces

La souris et particulièrement la souche C57BL6J est largement reconnue pour sa sensibilité à la prise de poids sous régime gras, et à l’action de la streptozotocine-STZ ciblant les cellules du pancréas pour induire une défcience de sécrétion d’insuline à l’origine d’hyperglycémie. La souris C57BL6J présente aussi un fond génétique largement exploité en recherche sur des modèles génétiquement modifiés des pathologies d’intérêt (maladies osseuses et métaboliques). Ainsi, l’utilisation de cette souche de souris présente un intérêt pour permettre des analyses comparatives et complémentaires des données expérimentales obtenues sur des modèles pathologiques induits par des méthodes différentes sur la même souche Des souris jeunes adultes (âgées de 6 à 7 semaines) pour pouvoir les suivre durant un protocole expérimental relativement long (16 semaines après inclusion). Le protocole s’appuie également sur des données de la littérature issues de protocoles ayant validé des modèles similaires (obèses et/ou diabétiques) avec des souris C57BL6J dont l’âge d’inclusion varie de 6 à 12 semaines.

Des souris mâles reçoivent trois injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour inactiver les cellules de leurs îlots pancréatiques qui ne produisent pas l'insuline, puis passent deux tests de tolérance au glucose de deux à six heures, avec incision de la queue, injection de glucose, sept à dix prises de sang pour la glycémie et quatre autres pour les hormones. 240 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur pancréas. Certaines sont aussi gavées d'une solution lipidique ou nourries d'un régime gras, que le porteur dit "classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes", afin d'étudier le rôle de ces cellules dans la régulation de la glycémie. Le résumé ne nomme pas le produit injecté pour supprimer les cellules et ne donne pas la durée du régime gras.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur l’homéostasie nutritionnelle à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules. Les principales cellules des îlots sécrétant l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir inactiver les cellules ne produisant pas l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types de cellules. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour induire le phénotype recherché, les animaux recevrons 3 injections intrapéritonéales (10 secondes par injection) espacées de 48h. Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 2 semaines d’écart (durée du test de 2 à 6h) : une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie, s’en suivra une injection intrapéritonéale (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 7 à 10 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 4 prélèvements (30 à 60 secondes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 30min à 1h). Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après l’injection intrapéritonéale de glucose).

Impact sur les animaux

Des souris de ce type sont actuellement en élevage dans un autre laboratoire. En dehors d’une diminution de poids légère et transitoire (1-2 semaines maximum) après la suppression des cellules des îlots qui ne sécrètent pas l’insuline, aucun effet délétère n’a été recensé chez ces animaux. Dans de très rares cas, il peut arriver, malgré les soins post-expérimentaux que la queue cicatrise mal après les prélèvements de sang. Il peut aussi arriver extrêmement rarement, lors de l’injection intrapéritonéale de toucher un organe entrainant la mort de l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non-β des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Une pré-étude a été réalisée antérieurement dans un autre laboratoire sur ces animaux montrant sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courant largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, le choix des animaux contrôles (témoins) produits permettra de diviser par 2 le nombre total d’animaux à produire. Nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore de 90 notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs îlots pancréatiques pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 240 animaux maximum (au lieu de 900 si les mesures précédentes n’étaient pas appliquées) seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisé assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 2-3 fois par semaine et tous les jours durant la semaine suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Les manipulateurs seront à jour de leurs formations continues, notamment en ce qui concerne le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non sécrétrices d’insuline dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte mâle, de 12 à 22 semaines. Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes de micro-organes in-vitro sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’équilibre nutritionnel des mammifères impliquant de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, reins…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère vivant. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective de certaines cellules des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet.

2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour reproduire des syndromes de surcroissance comme le syndrome de Protée reçoivent un gavage quotidien pendant deux mois, du tamoxifène puis des inhibiteurs, ainsi qu'une injection sous la peau, pour étudier ces maladies sans traitement connu. Le porteur décrit le gavage comme non traumatisant et surveille surtout le risque de fausse route, et prévoit d'arrêter le traitement quand une malformation atteint un demi-centimètre cube chez un animal témoin. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des cultures cellulaires ou des méthodes in silico.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance en mosaïques sont causés par des mutations génétiques causant une croissance anormale des organes et/ou tissus. Nous nous intéressons ici au syndrome de Protée caractérisé par une hypercroissance asymétrique des tissus avec des anomalies vasculaires et lymphatiques mais aussi aux anomalies d’hypercroissance associées à des hypoglycémies. Pour ces 2 types de pathologies il n’existe aucun traitement. Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs de ces mutations dans différents tissus de manière spécifique afin de comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et endocrinologiques de ces pathologies. Nous explorerons également l’effet de différentes molécules permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume des malformations. Le volume administré sera de 100ul. Celui-ci sera effectué par un technicien expérimenté. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Le gavage dure environ 15 secondes par animal. Les souris seront gavées pendant 2 mois. Un groupe de souris recevra une injection unique sous cutanée de 100ul. Cette injection sera effectuée par un technicien expérimenté

Impact sur les animaux

Gavage au tamoxifene pendant 5 jours pour induction de la Cre recombinase. Le tamoxifene à cette dose là ne donne pas de toxicité particulière. Gavage avec les inhibiteurs pharmacologique ou véhicule pour réduire le volume des hypertrophies. Le gavage n’entraine aucune nuisance particulière sauf une fausse route qui sera particulièrement surveillée. Les inhibiteurs pharmacologiques ne donnent pas de toxicité particulière aux doses utilisées. Le traitement sera interrompu lorsqu'une malformation chez une souris du groupe contrôle aura atteint le volume de 0.5cm3.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes de surcroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant environ 90 jours, elles reçoivent des antibiotiques puis l'application quotidienne d'une bactérie sur la langue, avec des tests de préférence alimentaire et un prélèvement de sang intracardiaque terminal. L'objectif est d'étudier le rôle du microbiote buccal sur le goût du gras et l'obésité, en vue d'applications en alimentation vétérinaire et humaine. Le porteur affirme que les relations entre organes nécessitent l'utilisation d'animaux, malgré des tests in vitro déjà menés sur des cellules gustatives.

Objectifs

Contrairement aux nombreuses études concernant le microbiote intestinal, très peu d'études ont exploré le microbiote oral et sa relation avec la prise de poids. Les seules études disponibles démontrent chez l’homme comme chez la souris que les bactéries du microbiote buccal peuvent induire l’obésité. Nous avons observé, par Séquençage métagénomique du gène codant pour l’ARN 16S bactérien qu’il existe une dysbiose (augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes) ainsi qu’une diminution de la diversité du microbiome oral chez les souris rendues obèses avec un régime hypercalorique contenant 32% huile de palme) en comparaison aux souris sous régime standard. L’analyse du phylum et du genre a démontré qu’une espèce bactérienne (bactérie A) appartenant au genre Streptococcus est plus abondante dans le microbiome oral des souris obèses. Cette bactérie (commensale) abondamment présente dans la flore intestinale murine est non pathogène de classe 1 et ne présente aucun risque pour l’homme. Pour des raisons de confidentialité on ne divulguera pas son nom et on l’appellera bactérie A. L'obésité résulte d’une surconsommation d’aliments caloriques due à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon du goût est constitué par un amas de cellules gustatives. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Les récepteurs CD36 et GPR120 (et aussi GPR40) sont impliqués dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en évidence le rôle de la bactérie A au niveau oral sur le comportement alimentaire, la perception gustative lipidique et l’induction de l’obésité. Le but de cette étude est de : 1- Evaluer l’effet de l’application orale de la bactérie A sur le comportement alimentaire en évaluant la préférence lipidique par test double choix et test de licking chez des souris obèses et contrôles non obèses 2- Évaluer l’effet de l’application orale da la bactérie A sur l’évolution du poids corporel et la glycémie chez des souris obèses et contrôles non obèses

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle du microbiote oral, et particulièrement la bactérie A, sur le comportement alimentaire et l’induction de l’obésité. Si cette étude fonctionne, elle serait intéressante, à terme, dans un contexte d’alimentation vétérinaire mais aussi dans un contexte d’alimentation humaine.

Procédures

L’ensemble des souris subira : - Mise sous régime (obésogène ou standard) toute la durée de l’étude (environ 90 jours) - Pesée tous les 3 ou 4 jours, toute la durée de l’étude - 10 jours de traitements antibiotiques dans l’eau de boisson - Application orale de la bactérie A chez les souris vigiles. Application quotidienne sur la langue, pendant 3 semaines ; technique de non invasive chaque application dure moins de 30 secondes - Mesure de glycémie (3 mesures) au début de l’expérience (temps 0), puis avant le traitement aux antibiotiques et au point final avant la mise à mort lors du test de tolérance orale du glucose (OGTT). Prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Quatre Tests de double choix et quatre tests de licking pour chaque souris. Ces tests nécessitent une individualisation cinq jours avant le début des tests ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test. La durée est de 12 h pour le test de double choix et 5 minutes pour le test de licking. - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT)nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un prélèvement sanguin : À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin de 0,5 ml en intra-cardiaque sera réalisé sur souris anesthésié avec l’isoflurane (3 %) - Prélèvement d’organes : Les organes seront prélevés, après mise à mort

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. Aussi, on supprime le microbiote endogène de la souris par traitement antibiotique. Le traitement aux antibiotiques peut également induire des troubles digestifs et par conséquent impacter la prise alimentaire et induire des diarrhées. De même, les animaux peuvent subir un stress, dû aux manipulations répétées pour appliquer sur la langue la bactérie A, ou suite aux prélèvements sanguins (lors de mesure de la glycémie pendant l’expérimentation et lors du test d’OGTT) ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix et licking).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes..

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux. De plus, nous avons déjà étudié, in vitro, sur une lignée de cellules gustatives murines les mécanismes moléculaires d’action de la Bactérie A immortalisée ainsi que de la paroi de la bactérie A. Les tests effectués in vitro n’ont montré aucun effet toxique.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires, in vitro, nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation la taille des groupes minimale est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose et sizzle pad). Si les animaux observés quotidiennement et si un signe clinique fait apparaitre un mal-être ou une douleur chez les animaux, ils seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane (3%).

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

Isolés seize semaines sous des jours courts comme en hiver, parce qu'ils deviennent alors agressifs, des hamsters syriens mâles subissent une opération de moins d'une heure pour l'implantation d'un capteur de température, puis, deux semaines plus tard, une seconde pouvant durer deux heures trente pour la pose d'une mini-pompe qui leur infuse des hormones thyroïdiennes. Ils sont ensuite placés au froid, à 8 °C, pour entrer en hibernation. Avec la pompe rechargeable, des injections à travers la peau vident et remplissent le réservoir pendant une torpeur ou sous anesthésie légère, injections qui selon le porteur "peuvent induire une douleur aigüe légère pendant que l'animal dort". 151 hamsters dorés sont utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour une recherche fondamentale sur l'hibernation, et tous sont mis à mort en fin d'expérience pour des prélèvements.

Objectifs

L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.

Procédures

Les hamsters syriens seront isolés 16 semaines car ils deviennent agressifs quand ils sont hébergés dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur de température corporelle. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Il serait exposé au froid (8°C) pour entrer en hiberation. Avenant: Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur ou suite à une anesthésie légère (rapide, 5-10 minutes), des injections transcutanées sont réalisées pour faire la vidange et le remplissage du réservoir et changer de solution à infuser.

Impact sur les animaux

Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Avenant: Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur ou suite à une anesthésie légère (rapide, 5-10 minutes), des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère pendant que l'animal dort.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.

Remplacement

L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.

Raffinement

Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec un régime gras à l'huile de palme, elles subissent des prélèvements sanguins répétés, des gavages et des périodes de jeûne, pour étudier le rôle d'une protéine intestinale dans l'obésité. Le porteur indique que le régime vise à induire l'obésité et que l'isolement, le gavage et les injections peuvent provoquer stress et gêne. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un excès d’apport énergétique et une élévation de l’endotoxémie. Le récepteur membrannaire CD36 (cluster of differentiation) semble impliqué dans le transport de ces toxines du microbiote intestinal. Dans un précédent projet, nous avons étudié l’impact d’un régime riche en acides gras insaturés. L’objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité induite par un régime riche en acides gras saturés. En effet le CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies associés à un excès de lipides. Pour ce faire nous utiliserons des souris n’ayant plus de CD36 dans l’intestin, comparées à des souris contrôles. 96 souris contrôles et 96 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime classique soit avec un régime hyperlipidique enrichi en huile de palme durant 12 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Afin d’étudier les variations liées au sexe l’intégralité de ce projet sera réalisée avec des animaux mâles et des animaux femelles. 192 animaux au total seront donc utilisés.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle la dépense énergétique en régime normo- et hyper-lipidique riche en acides gras saturés ? 2. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et l’adaptation intestinale à un régime hyperlipidique riche en acides gras saturés ? 3. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’endotoxémie et l’écologie du microbiote intestinal en régimes normo- et hyperlipidique riche en acides gras saturés? 4. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’effet obésogène de l’exces de lipides alimentaires saturés ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaire.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire, ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 à 3 minutes) en semaine 0, 2, 4 et 12. La procédure 1 est appliquée à la moitié de l’effectif pour laquelle des mesures de prise alimentaire et de récolte des feces dans la cage seront réalisées, en semaine 0 et 11. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine -2, -1, 6, 7 et 9. La procédure 2 est appliquée à l’autre moitié de l’effectif où une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 7. Cette mesure est indolore et non invasive et s’effectue dans des cages spécifiques de mesure. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine 0 et 5. A l’issue du régime en semaine 12, l’ensemble de l’effectif subira un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie générale, puis sera euthanasié pour réaliser des prélèvements d’organes.

Impact sur les animaux

Le régime hyperlipidique est utilisé pour induire l'obésité chez les animaux. Des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids pourraient être attendues. Toutefois, elles ne sont jamais observées après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris sur de courtes durées, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Un enrichissement supplémentaire sera proposé dans leurs cages d'hébergement afin de compenser cet effet indésirable. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gène de courte durée. L'echoMRI est une technique non invasive, qui recquiert une contention courte inférieure à 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique est indolore et non invasive. Cependant, elle nécessite une individualisation en cage spécifique, qui peut induire un stress sur 5 jours. Le sprelèvements sanguins à la queue des souris nécessite une contention légère et ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement sanguin en intracardiaque final est réalisé sous anésthésie, et ne dure pas plus de 30 secondes. Les souris subiront une mise à jeun de 12 heures. Pour les injections en IP (intrapéritonéale, au niveau de la cavité abdominale) et en IV (intraveineuse), il peut y avoir une douleur au point d'injection. Les produits injectés sont indolores (insuline) et à de faibles volumes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques (ANOVA), sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.