Système endocrinien

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime riche en graisse induisant l'obésité, isolées en cage individuelle pour la calorimétrie, puis testées pour la tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins avant la mise à mort. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans les troubles métaboliques liés à l'obésité, applications thérapeutiques annoncées au conditionnel. Le porteur affirme qu'il faut étudier ces mécanismes "dans un organisme vivant" et qu'"aucune méthode alternative" n'existe.

Objectifs

L’obésité́ et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Au cours des dernières décennies, de nombreuses études ont montré́ que les cellules immunitaires dans le tissu adipeux viscéral (TAV) des patients obèses sont responsables d’une inflammation chronique. Celle-ci serait largement impliquée dans le développement des désordres métaboliques et cardio-vasculaires compliquant l’obésité́. En particulier, la transformation de cellules immunitaire anti-inflammatoires, abondants dans la TAV maigre, en cellules immunitaires pro-inflammatoires dans le TAV obèse, conduirait à la production de médiateurs de l’inflammation et jouerait un rôle majeur dans cette inflammation chronique. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsable de cette inflammation sont encore méconnus. Les identifier permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les syndromes métaboliques et l’obésité́. Nous avons observé́ que la déficience en une enzyme impliqué dans la dégradation de l’ADN libéré́ par les cellules mortes rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité́. L’absence de cette enzyme augmente la capacité́ de l’ADN libéré́ par les cellules mortes, qui s’accumule au cours de l’obésité́, à activer les réponses inflammatoires causant le syndrome métabolique. Notre objectif est d’évaluer le métabolisme énergétique des souris déficientes en cette enzyme.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence comment la DNase1L3 contribue aux troubles métaboliques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité mais aussi aux troubles métaboliques induite par celle-ci.

Procédures

Déroulement de la procédure : • Acclimatation/habituation (semaine 1) • 1ère séance de calorimétrie (semaine 2-4) • 1ère analyse de la composition corporelle (semaine 4, l’analyse dure environ 3 min par souris) • Exposition au régime riche en graisse (semaine 4-14) • 2ème séance de calorimétrie (semaine 15-16) • 2ème analyse de la composition corporelle (semaine 15) • Test de tolérance au glucose (semaine 16) • Test de tolérance à l’insuline (semaine 17) Nous réaliserons un seul test de tolérance au glucose et un seul test de tolérance à l’insuline. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, nous réalisons des prélèvements sanguins au niveau de la queue des souris. Le volume de sang nécessaire est limité (inférieur à 1% du volume sanguin total). Un délai d’une semaine minimum est respecté entre chaque test.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal et réaliser les mesures de calorimetrie indirecte. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux nous réalisons une période d’habituation de 2 semaines des animaux aux expérimentateurs. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire (période d’induction de l’obésité), nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Les souris exposées au régime riche en graisse peuvent développer des dermatites, bien que cela soit très rares chez la souche de souris utilisée dans cette étude.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant aux désordres métaboliques, en particulier l’obésité. Dans ce contexte, de nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques (foie, muscles, tissu adipeux…). Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquements (21 animaux par groupe).

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 9 semaines. Ils seront manipulés pendant 2 semaines. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs. 2) L’évaluation de la prise alimentaire et des paramètres de calorimétrie indirecte nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte, âge qui correspond à un stade où les circuits neuronaux contrôlant la prise alimentaire sont matures.

80 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime pauvre en protéines qui restreint leur croissance, elles subissent une calorimétrie avec 72 heures d'isolement, un test de tolérance à l'insuline avec sept prélèvements sanguins à la queue, puis une laparotomie sous anesthésie pour prélèvement en veine porte avant la mise à mort. Le projet évalue les effets d'un probiotique dans un contexte de malnutrition, cibles thérapeutiques annoncées au conditionnel et à long terme. Le remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la réponse "intégrée" de l'organisme "nécessite une étude chez l'animal".

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants soufrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un oedème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques cérébrales, la pose de pompes osmotiques, des régimes hyperlipidiques provoquant obésité et résistance à l'insuline, et des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Le projet vise à comprendre le rôle des céramides dans le diabète de type 2, retombées thérapeutiques renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "très difficile" de reproduire ces interactions entre organes in vitro et conclut que le modèle animal reste "nécessaire".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur le diabète, pathologie définie par une élévation anormale du taux de glucose dans le sang, et qui touche plus de 300 millions de personnes dans le monde. Le diabète de type 2 concerne plus de 90% des patients diabétiques et se caractérise par une résistance des tissus cibles à l'insuline, hormone clef dans la régulation de la glycémie, associée à un défaut de sécrétion de cette hormone par les cellules beta du pancréas. Il est maintenant bien établi qu'un régime riche en graisses peut induire la survenue d'un diabète de type 2, via un phénomène appelé la lipotoxicité. Ce dernier est défini par une accumulation délétère de lipides dans différents tissus. Parmi les différents lipides, les céramides apparaissent comme particulièrement délétères. Ainsi, il a été décrit qu'un excès de céramides perturbe la voie de signalisation insuline dans les tissus cibles de cette hormone. Les céramides peuvent également être à l'origine de l'inflammation des cellules B pancréatique, conduisant à une diminution de la sécrétion à l'insuline. Tous les mécanismes d'actions des céramides (qui diffère selon les types de tissus) ne sont cependant pas élucidés et davantage d'études doivent être menées afin d'évaluer la pertinence de l'inhibition de la synthèse des céramides comme cible thérapeutique dans le traitement du diabète. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre, par des études in vivo, le rôle du métabolisme des céramides sur l'homéostasie glucidique et l'inflammation dans différents tissus cibles de l'insuline (foie et cerveau) ou dans les cellules beta chez la souris. Dans ce projet, nous allons particulièrement cibler la sérine palmitoyltransférase 2 (SPT2), une sous-unité de la SPT, enzyme clef de la voie de synthèse des céramides.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication du métabolisme des céramides dans l'homéostasie glucidique, dans différents types cellulaires. Ces études permettront également d'élucider les mécanismes d'actions des céramides dans production hépatique de glucose, l'insulino-résistance ou dans la sécrétion de l'insuline. Ce projet vise aussi à comprendre l'implication des céramides dans l'inflammation et la mort des cellules beta. Enfin, une approche utilisant un inhibiteur d'une enzyme qui produit des céramides, la sphingomyélinase neutre 2, nous aidera à investiguer les mécanismes de régulation de la synthèse des céramides dans les cellules du foie. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement du diabète de type 2, à plus long terme.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : 312 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre : 72 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre + pose d'une canule et pompe Alzet pour perfusion icv de résistine : 96 souris. Détail par procédures : -Proc 1 : injection intrapéritonéale quotidienne pendant 15j puis réalisation de trois tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique. Ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après soit une administration orale de glucose, soit une injection intrapéritonéale de pyruvate ou de glycérol, ces différents tests seront réalisés avec au minimum deux jours d'intervalles. - Procédure 2 : régime hyperlipidique puis tests de mesure de l'homéostasie glucidique espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles, identiques à ceux de la procédure 1. - procédure 3 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation de tests espacés de 2 jours avec prélèvements sur animaux vigiles (idem procédure 1). - procédure 4 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation d'enregistrements nerveux sur animal anesthésié. - ¨Procédure 5 : injections stéréotaxiques, régime hyperlipidiques puis réalisation de tests espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles (idem Procédure 1).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des régimes provoquant l'obésité et/ou des désordres métaboliques de type réistance à l'insuline. Le protocole sera arrêté si les animaux présentent différents signes de souffrance (infections suite aux chirurgies,œdème, absence de mobilité dans la cage, poils ébouriffés, mauvaise prise alimentaire, perte de poids). Ces paramètres seront évalués par le chercheur chaque jour dans la semaine suivant la mise sous régime, injections, tests métaboliques ou chirurgies.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type organ on chips qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier un gène cible particulièrement intéressant (SPT2). L'inhibition de son expression dans différents tissus a déjà montré des résultats très prometteurs. Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. De plus, la souris est un modèle de choix pour les études génétiques car de nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de deux mois. Dans le cadre de l'utilisation du régime cétogène, une partie des souris seront mises sous régime cétogène dès le sevrage pour qu'elles n'aient pas accès à une alimentation riche en glucide.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées, elles reçoivent un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition, un probiotique ou un placebo dans la joue, subissent une calorimétrie avec isolement de 72 heures et un test de tolérance à l'insuline avec prélèvements au bout de la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le projet évalue l'effet d'un probiotique sur les troubles métaboliques de la malnutrition infantile, cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que la réponse intégrée de l'organisme à l'alimentation impose l'étude chez l'animal.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique. De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et une partie d'entre elles reçoit un gavage chaque jour pendant un mois, précédé pour certaines de trois semaines de nourriture au tamoxifène et de cinq jours d'injections dans l'abdomen. Les glucocorticoïdes administrés, dexaméthasone pendant trois jours ou prednisone pendant un mois, doivent provoquer une fonte musculaire qui peut atteindre 20 % du poids du muscle, pour étudier le rôle de deux co-régulateurs du récepteur de ces hormones, supprimés dans le muscle d'une partie des souris. Le gavage peut provoquer des fausses routes, les injections des infections, et le porteur écrit : "Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques." Un test d'agrippement clôt les traitements, et l'espoir de réduire les effets indésirables des corticoïdes chez les patients reste au conditionnel, cette modulation "ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques" selon lui.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés dans le muscle squelettique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités au Tamoxifène par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en tripicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. Le gavage peut conduire à des fausses routes. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

40 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réutilisées d'un précédent projet, elles sont mises à jeun quelques heures puis placées de façon répétée en cage individuelle, pour les habituer à consommer des matrices alimentaires devant recevoir un actif régulant la glycémie. Le porteur indique que le jeûne et l'isolement répété peuvent générer un stress, et que ces souris sont mises à mort faute d'autre projet prévu. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer le choix et l'intégration de la nourriture par un être vivant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’habituer des souris diabétiques à la consommation de différentes matrices alimentaires dans lesquelles il est envisagé d’incorporer un actif breveté et commercialisé, un dérivé de lait, permettant de réguler la glycémie en réduisant de manière significative la glycémie postprandiale (après un repas) pour les personnes en pré-diabète. Il faut cependant s’assurer au préalable que les souris consomment ces matrices alimentaires sans présence de l’actif, le plus rapidement possible, nécessitant une habituation à cette consommation d’un aliment différent de leur régime habituel pour lever la réticence et/ou le rejet à manger un aliment nouveau (néophobie alimentaire). Cette habituation sera effectuée en 2 phases successives : au cours de la 1ère phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées directement dans la cage des souris pendant plusieurs jours, en leur laissant accès à leur régime habituel et sans mise à jeun préalable, puis au cours de la 2ème phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées dans une cage d’isolement dans laquelle les souris seront mises individuellement après une période de mise à jeun préalable pour qu’elles s’habituent à consommer les matrices alimentaires qui leur seront proposées, le plus rapidement possible, pendant également plusieurs jours. Pour réaliser ce projet, nous réutiliserons des souris diabétiques issues d’un autre projet autorisé (validité toujours en cours) au cours duquel les souris auront été soumises à une procédure expérimentale de classe modérée, et après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 projets.

Bénéfices attendus

Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose dans le sang (hyperglycémie). Dans le cas du diabète de type 2 (90% des cas de diabète), ce phénomène provoqué par une perturbation du métabolisme glucidique apparaît progressivement et insidieusement. En France, en 2019, près de 4 millions de personnes étaient identifiées diabétiques par l'assurance maladie et prenaient un traitement médicamenteux pour leur diabète (soit 5,3% de la population). A cela, s’ajoutent les personnes diabétiques qui s’ignorent. Cette prévalence ne cesse d’augmenter en France, particulièrement chez les hommes, les jeunes (80 ans). Les personnes diabétiques doivent s’astreindre à un régime spécial, avec notamment un contrôle voire la limitation très stricte de la prise d’aliments sucrés, ce qui peut impacter leur moral. Elles vivent parfois des problèmes de santé mentale comme la dépression, l’anxiété et les troubles de l’alimentation, voire ce qui est maintenant appelé l’épuisement diabétique qui est une des complications psychologiques les plus graves de la maladie. Les personnes qui en sont atteintes ressentent une profonde impuissance et un désespoir intense. Les industriels des secteurs pharmaceutiques et agroalimentaires cherchent donc des molécules et ingrédients pouvant agir sur la limitation du passage dans le sang des sucres ingérés lors des repas. Cette étude préliminaire est donc la base d’un projet consistant à développer des aliments fonctionnels pouvant être consommés par toutes les personnes y compris et surtout les personnes diabétiques. Permettre en effet aux personnes diabétiques de consommer à nouveau yaourts, céréales, chocolat ou barres nutritionnelles lors d’activités physiques leur redonnerait un confort de vie plus important et limiterait la survenue de pathologies associées telles que celles décrites précédemment.

Procédures

Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sera réalisé sur les 40 souris diabétiques nécessaires à la réalisation de ce projet. Elles seront mises à jeun pendant quelques heures puis placées en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, ce qui pourra engendrer un stress. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des souris pendant quelques heures ainsi que le placement en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, pourra engendrer un stress pour les souris. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 souris diabétiques db/db nécessaires à la réalisation de ce projet, réutilisées d’un autre projet autorisé, seront mises à mort à l’issue des expérimentations, aucun autre projet n’étant envisagé sur ce lot de souris.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo mimant l’alimentation, c’est à dire le choix et l’intégration de la nourriture par un être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre de souris diabétiques minimum nécessaire et suffisant issues d’une expérimentation précédente, après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 études, afin d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base d’études précédentes réalisées chez le rat suivant le même protocole expérimental d’habituation qui sera suivi.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 2 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications du comportement des animaux sont observées (cachexie, vocalises, convulsions…), celles-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des feuilles de papier absorbant seront placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris diabétique est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser cette étude dans le cadre d’un projet visant à développer des aliments fonctionnels pour les personnes diabétiques. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur cette pathologie Les animaux seront des souris diabétiques âgées de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur le diabète

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en graisses et en sucres, elles subissent sept prélèvements sanguins à la queue, un test de tolérance à l'insuline et des mesures répétées en tube de contention, pour évaluer l'effet de lipides bioactifs sur l'obésité. Le porteur indique que les tests peuvent stresser les animaux et qu'un isolement de quarante-huit heures est imposé pour l'analyse du métabolisme. Il justifie l'usage de la souris par le fait que ces lipides sont destinés à l'alimentation humaine et qu'il est donc "judicieux" de les tester dans l'alimentation d'un modèle animal.

Objectifs

Les lipides bioactifs sont présents en faible quantité dans les plantes, chez certains microorganismes et chez les animaux, en particulier le poisson. Les trois effets biologiques majeurs des lipides bioactifs sont : antioxydant, antimicrobien et anti-inflammatoire. Des études plus spécifiques sur les effets santé ont été menées ces dernières années et montrent qu'ils pourraient aussi impacter le métabolisme des lipides, l’insulinorésistance et le diabète, les maladies cardiovasculaires, voire certaines maladies neurodégénératives. Ces composés bioactifs de notre alimentation pourraient donc avoir des effets bénéfiques potentiels contre les problèmes métaboliques associés à une alimentation de type occidental. Ce projet concerne l'étude des effets curatifs d'une forme particulière de lipides bioactifs sur des souris obèses et fait suite à notre projet précédent qui a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques lors d'un traitement préventif.

Bénéfices attendus

Les travaux de la littérature suggèrent que les lipides bioactifs possèdent un fort potentiel pour la santé dans le domaine de l’obésité et des désordres métaboliques associés. La forme que nous allons utiliser n'a pas encore été testée en dehors de notre laboratoire. Nous avons déjà pu mettre en évidence des effets bénéfiques dans le cadre d'un traitement préventif de l'obésité et nous souhaitons vérifier ces effets dans le cadre d'un traitement curatif. Notre hypothèse est que ces lipides bioactifs peuvent réduire l’obésité des souris sous régime enrichie en gras et en sucres et peuvent réduire la résistance à l’insuline et améliorer les troubles métaboliques associés. Ils pourraient être utilisés en alimentation humaine.

Procédures

Nous pratiquerons au total 7 prélèvements sanguins sur animaux vigiles par ponction à la queue (30 secondes par prélèvement). Nous respecterons les recommandations en terme de volumes et de temps de récupération car nous prélèverons moins de 7.5% du volume sanguin total en une semaine. Les animaux recevront deux injections intrapéritonéales (5 secondes par injection), une de solution d’insuline pour le test de tolérance à l’insuline, l’autre d’anesthésique au moment de l’euthanasie. Pour la mesure de composition corporelle hebdomadaire par IRM, l’animal sera mis en tube de contention 2 min, en tout 5 fois. Pour la mesure de motricité, l’animal sera déposé sur un cylindre en rotation 3 fois 5 minutes avec 20 minutes de repos entre chaque séance.

Impact sur les animaux

Les souris obèses recevront un régime riche en graisse et en sucre (type fast-food). Cet état est comparable aux personnes souffrant d'obésité. Les animaux pourront être stressés pendant les différents test non invasifs. Ils seront isolés pendant 48 heures pour l'analyse du métabolisme respiratoire.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de sang et de tissus qui nous permettront de caractériser les effets métabolique et musculaire de notre lipide bioactif.

Remplacement

Les lipides bioactifs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir, ralentir ou soigner le développement de l'obésité et des dommages associés chez l'Homme. Il est donc judicieux de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal.

Réduction

Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats obtenus par notre laboratoire et d’analyses statistiques pour définir le nombre minimal nécessaire. L'objectif étant d'utiliser ces lipides bio-actifs en alimentation humaine, nous les allons tester chez des mâles et des femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 2 pour mieux contrôler tout comportement d’agressivité et de bagarres chez les mâles. La nourriture sera changée tous les 2 à 3 jours afin d'éviter une perte d'appétence (rance). Les animaux seront manipulés avec un tunnel afin d'éviter la préhension par la queue et pour les habituer au test de composition corporelle qui est aussi réalisé dans un tunnel de contention. Pour les différents tests les animaux seront habitués au prélable au nouvel environnement et nous aplliquerons des points limites préalablement définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère pertinent pour les études du métabolisme. Nous pouvons obtenir des animaux mimant le syndrome métabolique humain. Les animaux seront âgés de 21 semaines à réception et de 6 mois pour l'euthanasie. D'après les données de notre fournisseur, ces adultes seront "obèses". Nous pourrons ainsi vérifier un effet curatif de nos traitements.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras, à des mises à jeun de vingt-quatre heures avec suivi de la température rectale, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et à des échographies sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs tissus, pour étudier le rôle de la protéine PTPIP51 dans l'adipocyte au cours de l'obésité. Le porteur indique que le régime gras entraîne une prise de poids et une insulinorésistance, l'effet de la délétion du gène restant inconnu. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" après des tests menés sur lignées cellulaires.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Des travaux récents de notre équipe ont démontré que les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries sont des éléments importants de la bonne santé de l'adipocyte. Ces points de contacts sont appelés les MAM. Dans le foie, il a été montré que ces MAM contrôlaient la santé métabolique. Dans le tissu adipeux, le rôle physiologique de ces MAM n’a pas été exploré. Les MAM correspondent à des rapprochements des membranes de du RE et de celles des mitochondries. Ces rapprochements sont notamment permis par la présence de protéines de rapprochement comme la protéine tyrosine phosphatase-interacting protein 51 (PTPIP51). Le but du présent projet est de supprimer la présence de cette protéine (PTPIP51) de rapprochement dans l'adipocyte, chez la souris, pour tester l'effet que celà aura sur la santé du tissu adipeux et sur la santé métabolique globale de l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de démontrer le rôle des MAMs dans le développement des complications métaboliques associées à l’obésité. Si ce travail s’avère concluant, les MAMs du tissu adipeux pourraient être considérées comme une cible thérapeutique contre les complications cardiométaboliques du surpoids.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les souris sont mises sous régime gras. La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. La mise à jeun se traduit par une privation de nourriture pendant 24 heures et un suivi de la température (sonde rectale + vaseline), de la glycémie (5 prélèvements de 3 microlitres) et des corps cétoniques (5 prélèvements de 3 microlitres) Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les procédures expérimentales, les nuisances principales sont liées aux injections, aux gavages et aux prélèvements à la queue. La mise sous régimes gras entrainnera une prise de poids et le développement d'une insulinorésistance. L'effet de la délétion de PTPIP51 est inconnue. Nous émettons l'hypothèse qu'elle accélrera le développement d'une insulinorésistance.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les tissus d'intéret sont prélevés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance des MAMs dans l’homéostasie du tissu adipeux. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement testée dans des lignées cellulaires et nous avons démontré que la déficience en PTPIP51 réduisait drastiquement les MAMS. Dans la continuité, une validation in vivo est indispensable pour étudier les conséquences de l’altération des MAMs du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et/ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 720 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Le modèle adipoPTPIP51 est spécifique de l’adipocyte et nous avons déjà la démonstration que la déficience en PTPIP51 altère les MAMs. La mise sous régime gras permet de reproduire les conditions de surnutrition relative à l’étude du surpoids et de l’obésité. Ce modèle permettra d’étudier si la dérégulation des MAMs entraîne une dysfonction adipocytaire et si la dysfonction adipocytaire altère d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Nous utiliserons des souris de 8 semaines au moment de la mise sous régime gras et donc du démarrage de l’expérience.