Système endocrinien
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24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de stimulation hormonale et une échographie, avant d'être mises à mort pour prélever les cellules épithéliales de leur glande mammaire, dans un projet visant à modéliser in vitro la glande mammaire afin de produire des protéines thérapeutiques dans le lait de lapines transgéniques. Le porteur qualifie les nuisances de "minimes". Il affirme que la production de protéines recombinantes dans le lait de lapines est le "principe fondateur" de sa société et qu'elle n'est "pas remplaçable".
Objectifs
Notre société est intéressée par la production des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et a choisi de produire ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. La lapine a été séléctionné parce qu’elle synthétise des protéines en qualité (nécessaires pour soigner efficacement ces patients) et en quantité, que l’on ne peut obtenir par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures). Pour la création des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome des lapins par micro-injection dans des embryons de lapine avant de les transférer dans des receveuses. Comme la production de ces protéines dépend de la modification effectuée, nous devons utiliser plusieurs stratégies de modification génomique. Nous avons mis en place des cultures cellulaires commerciales afin de sélectionner les meilleures stratégies. Nous avons déterminé la présence et l’integrité de l’ARNm correspondant à la protéine recombinante cible pour chaque stratégie, mais nous ne pouvions pas estimer l’efficacité de production des ARNm ou de la protéine produite dans le lait. Ces critères sont impératifs afin de poursuivre des études precliniques.. Il n’existe pas de lignées de cellules de glande mammaire de lapines, commerciales ou non, avec lesquelles nous pourrions étudier les différentes stratégies pour la production des protéines d’intérêts. Nous souhaiterions mettre au point des systèmes cellulaires en deux dimensions (2D) pour quantifier les ARNm codant pour les protéines d’intérêts et dans un deuxième temps trois dimensions (3D, organoïde) afin d’analyser les protéines d’intérêts produites. La génération d’un tel système mammaire modélisant les processus de lactation peut être utile pour estimer la quantité de la protéine recombinante produite et sélectionner les meilleures protéines pouvant être produire dans le lait des lapines. Avec ce système, nous pensons pouvoir diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés pour la création des animaux transgéniques produisant des protéines recombinantes thérapeutiques. Pour réussir le plus rapidement possible la mise au point de ces systèmes, nous collaborons avec une équipe ayant de l’experience sur la glande mammaire et les cellules souches, nécessaires à la création des cultures cellulaires 3D.
Bénéfices attendus
Notre société s’est focalisée sur le traitement enzymatique substitutif pour soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales. Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques dont un médicament autorisé et nous voulons produire de nouvelles protéines thérapeutiques par l’intermédiaire de lapines trangéniques. La mise au point de systèmes cellulaires 2D/3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation va nous permettre de tester plusieurs constructions génétiques pour multiplier les chances de produire en grande quantité des protéines thérapeutiques. Nous pourrons ainsi commencer des études précliniques pour vérifier l’efficacité de ces protéines à soigner différentes maladies, tout en diminuant le nombre d'animaux dont nous aurions besoin pour produire ces médicaments. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’euthanasier 4 lapines pour récupérer des embryons au stade 1 cellule pour les microinjecter avec une construction génétique puis d’utiliser 4 lapines receveuses des embryons micro-injectés pour être capable d’avoir 1 animal transgénique mosaïque F0 et étudier l’expression de la protéine recombinante d’intérêt sur une géneration F1 et/ou F2. Nous estimons que nous pouvons diminuer au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés si nous pouvons tester nos constructions génétiques dans des organoïdes de la glande mammaire de lapines, car nous aurons besoin de juste 1 lapine gestante pour valider nos constructions génétiques.
Procédures
2 injections en intraveineuse d'une durée de 30 secondes environ : une pour la stimulation hormonale, l’autre pour l’euthanasie. 1 échographie de 5 à 10 minutes environ. Prélèvement de glande mammaire sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés subiront des nuisances minimes à savoir : - une injection intra-veineuse mais sur une veine précédemment anesthésiée localement, - une contention lors de l'échographie de conrôle de la gestation.
Devenir
Nous devons euthanasier les lapines pour pouvoir récupérer les cellules épithéliales de la glande mammaire.
Remplacement
La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines recombinantes complexes, de l’ordre de centaines de milligrammes à plusieurs grammes par litres de lait, dont la glycosylation et la gamma-carboxylation sont nécessaires pour soigner efficacement les patients et que l’on ne peut obtenir en qualité et en quantité par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures).
Réduction
Pour créer des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome de lapins en transférant une construction génétique nécessaire à la production de la protéine recombinante thérapeutique d’intérêt, par des cellules de la glande mammaire. Ce transfert génétique se fait par micro-injection de la construction génétique dans des embryons de lapine au stade une cellule, qui seront ensuite transférés chirurgicalement dans des femelles dites receveuses (transfert d’embryon). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons décidé de tester nos constructions génétiques dans des cultures cellulaires de glande mammaire avant de passer au modèle animal. Actuellement, nous utilisons des cultures de cellules non issues de la glande mammaire de lapines (il n’existe pas des cellules de glande mammaire de lapins, commerciales ou non) pour sélectionner les meilleures constructions génétiques. L’utilisation de ces cultures cellulaires nous a permis de faire un premier tri et de déterminer la présence et l’intégrité de la protéine recombinante, mais nous n’avons pas d’informations sur la quantité de protéine produite (du fait d’un site d’expression différent entre une cellule lambda et une cellule de glande mammaire). C’est pourquoi nous voudrions mettre au point des systèmes cellulaires 2D et 3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation. Quand ces systèmes seront mis au point, nous pensons diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux que nous utilisons, pour produire des protéines recombinantes thérapeutiques humaines.
Raffinement
Les lapins sont hébergés seuls dans leur cage, reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent permettant de maintenir un niveau d’interaction entre les individus. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Dans ce projet, il n’y a peu de gestes invasifs : deux intraveineuses mais après application de crème anesthésiante et l’échographie est un peu contraignante pour la lapine mais des mesures sont prises pour atténuer la contrainte : la tête de lapine est cachée par le bras d’une technicienne, ce qui peut la rassurer car le lapin apprécie de pouvoir se cacher, et elle reçoit des caresses de la part de la technicienne qui réalise l’échographie, pour l’apaiser. Certaines lapines se sont endormies dans cette position.
Choix des espèces
Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (30 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapins sont utilisés dès la la maturité sexuelle atteinte, à 4 mois et demi pour les femelles, 5 mois pour les mâles.
Effet d’un blocage pharmacologique des voies d’inflammation sur un modèle murin d’hyperstimulation ovarienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections hormonales de superovulation puis des cotraitements anti-inflammatoires, et subissent un prélèvement sanguin sous-mandibulaire terminal avant leur mise à mort, pour étudier l'étiologie du syndrome d'hyperstimulation ovarienne sur des souris invalidées pour les récepteurs LXR. Le porteur affirme anticiper l'"absence d'effets indésirables" liés au protocole, qu'il dit pratiquer en routine. Il indique avoir d'abord mené des tests in vitro sur cellules de granulosa, censés limiter le nombre d'individus utilisés in vivo.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris sauvages, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. En effet, le modèle invalidées pour les récepteurs LXRs a été identifié et publié comme un modèle de référence pour ce syndrome. Les études seront conduites sur des animaux de 7 mois environ puisque la mise en place du phénotype est associé à l'age des souris. Les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation. - Jour 1 : Injection IP de l'hormone 1 (PMSG, 7,5UI/souris) - Jour 3 : Injection IP de l'hormone 2 (hCG, 5UI/souris). Nous envisageons donc de réaliser des cotraitements avec des corticoïdes (methylprednisolone), avec des AINS (Ketophen) et enfin avec des inhibiteurs de l'inflammasome (MCC950). Les tissus prélevés seront prélevés à 2 temps spécifiques : 40 heures apres la première stimulation par la PMSG (lot H40) et en fin de protocole après l'ovulation (lot J4). Les échantillons tissulaires seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs d’acteurs de la stéroïdogenèse ovarienne et de l'inflammation. En parallèle des tests de fécondation in vitro (FIV) seront conduit pour déterminer la qualité des ovocytes produits et leurs capacités à reprendre la méiose après fécondation.
Bénéfices attendus
Nous avons précédemment montré le rôle qu'occupe les récepteurs LXR dans l'étiologie moléculaire de l'hyperstimulation ovarienne. Il est maintenant très clair que le phénotype est associé chez la souris à une réponse inflammatoire anormale et à la constitution d'un infiltrat de cellules immunitaires au nievau ovarien qui et totalement anormal et incontrolé. L'etude de l'effet de traitements anti-inflammatoires dans un contexte d'hyperstimulation pathologique de l'ovaire, nous permettra ainsi de connaître le potentiel thérapeutique d'un telle traitement dans le cadre de la clinique humaine.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement unique sous-mandibulaire sanguin de 150microlitres environ en point final juste avant leur mise à mort. Cette procédure aura lieu une fois avec une durée moyenne d'une minute.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, et notre groupe de recherche les utilisent en routine sur ces même modèles génétiques. Ainsi, nous pouvons aidsement anticiper l'absence d'effets indésirables liés au protocole présenté dans la demande. En parallèle, nous pouvons anticiper aue les traitements anti-inflammatoires vont diminués au moins partiellement les manifestations phénotypiques d'hyperstimulation, donc plutôt des effets bénéfiques. Néanmoins, une surveillance renforcée (2 fois par jourà) sera conduite sur les animaux en protocole.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement pour l'analyse des ovaires par des techniques d'histologie et d'immunodétection in situ.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules de granulosa en modulant le contexte inflammatoire. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 15 individus par lot.
Raffinement
Les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation occasionnelle de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 96 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin, les études antérieures n'ont pas montrées de manifestation délétère pour l'animal. En parallèle, un erichissement renforcé des cages d'hébergement sera conduit (cabane et/ou tube carton, pads cellulose pour formation de nids). Si des signes de souffrance ou de mal-être se manisfeste, l'application des points limites décrit dans la DAP seront mis en oeuvre.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Nous utiliserons des individus de 7 mois, ce stade de développemente est justifié par le lien qu’il existe entre la survenue d’OHSS chez la femme et la réponse inflammatoire que nous avons observé dans nos études précédentes dans lesquelles cette fenêtre temporelle présente une réponse significativement pathologique dans le modèle Lxr ab-/-.
Effets métaboliques d’une eau traitée par électrolyse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime gras et sucré, ils subissent des mises à jeun, des gavages de glucose avec prélèvements de sang répétés à la queue et des isolements de 24 heures pour l'analyse vidéo de leurs déplacements. Le projet, mené pour une entreprise, teste si une eau traitée par électrolyse limite le syndrome métabolique. Le porteur présente le rat comme un "donneur" d'organes et affirme qu'une étude in vitro n'aurait "pas d'intérêt" ici.
Objectifs
La prévalence de l'obésité ne cesse de croître. D'ici 2030, on prévoit que 40% de la population mondiale sera en surpoids et 20% sera obèse. L'obésité est un facteur de risque important pour de nombreuses maladies non transmissibles, notamment : les troubles métaboliques (par exemple, le diabète et la résistance à l'insuline), les maladies pulmonaires (syndrome d'hypoventilation lié à l'obésité, apnée du sommeil), les maladies cardiovasculaires, les maladies digestives (stéatose hépatique non alcoolique) et les cancers. De nombreux mécanismes expliquent ces complications, mais l'inflammation associée à l'obésité figure parmi les principaux. En effet, l'obésité se caractérise par un dysfonctionnement immunitaire, une altération de la perméabilité intestinale (qui favorise la translocation bactérienne et l'inflammation systémique). Cette inflammation de bas grade va avoir un impact sur le métabolisme, notamment en favorisant le développement d'une résistance à l'insuline et le développement d'un syndrome métabolique (première étape vers le diabète de type 2). Ainsi, toute stratégie permettant de limiter l'inflammation de bas grade au cours du syndrome métabolique permettra de limiter ses conséquences délétères. Parmi ces stratégies, l'apport d'une eau de boisson traitée pour éliminer tout matériel organique pourrait contribuer à diminuer l'inflammation de bas grade. Nous proposons d'évaluer le potentiel d'une telle eau traitée par un procédé innovant dans un modèle de syndrome métabolique et d'obésité chez le rongeur. Le 1er critère sera de déterminer la capacité de cette eau à limiter et/ou à prévenir le syndrome métabolique évaluée par une meilleure tolérance au glucose déterminée par un test de charge orale en glucose. Afin de contrôler l'impactéventuel d'une modification de lactivité locomotrice, celle-ci sera déterminée à l'aide d'un système de video-tracking.
Bénéfices attendus
Selon l'entreprise sollicitant cette prestation, cette eau traitée pourrait permettre de limiter l'inflammation de bas grade associée au syndrome métabolique permettant ainsi de limiter ses conséquences délétères.
Procédures
Certains animaux seront soumis à un régime riche en graisses et en sucres. Ils recevront également soit l'eau du réseau de ville qui répond aux critères très stricts dictés par le Ministère de la Santé et le Conseil supérieur du secteur d’Hygiène Publique soit cette même eau traitée par électrolyse, durant 8 à 16 semaines, selon les groupes concernés. Tous les animaux seront soumis à 3 tests de tolérance au glucose en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement. Les animaux seront mis à jeun à 16 heures, la veille de chaque test. De l’eau sera laissée à leur disposition. Le matin du test, vers 8 heures, les animaux seront pesés puis laissés au calme pendant 30 minutes. Le test débutera par une prise de sang à la queue sur animal vigile. Une goutte de sang suffit pour le dosage de la glycémie en direct grâce à un glucomètre (T0). Le test se poursuit par l'administration d'une dose de glucose en fonction du poids de chaque animal par gavage oral (niveau de douleur 0). Une goutte de sang est ensuite prélevée 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 90 et 120 min après l'administration de la dose de glucose pour le dosage de la glycémie. Après le test, le site de prélèvement est désinfecté à la Chlorhexidine. L'activité locomotrice spontanée des animaux sera déterminée à partir de l'enregistrement de leur déplacement pendant 24h à l'aide d'un système de video-tracking en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement). Pendant cette mesure, les animaux seront placés en cage individuelle, de modèle identique à celui utilisé pour le reste de l'hébergement. Pendant le durée de l'étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine nécessitant brièvement une préhension et une lègère contention réalisée par du personnel habitué à effectuer ces gestes.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu d’effets indésirables de cette eau traitée. Le régime gras et sucré utilisé sur les animaux favorisera la prise de masse grasse et le développement d'un syndrome métabolique. Ceux recevant l'eau traitée devraient montrer des symptomes moindres que ceux recevant de l'eau classique. Il est attendu des nuisances légères liées à : - l'isolement en cages individuelles pendant 24, prévu pour l'analyse de l'activité locomotrice spontanée par videotracking - la mise à jeune à 3 reprises pendant la durée du projet, préalable aux tests de tolérance au glucose - le prélèvement de sang selon les détails indiqués dans la procédure 1.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1. Le sang et divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal une fois mort, pour être conservés en vue d'analyses futures.
Remplacement
Ce projet étudie les conséquences d'un modèle d'induction de syndrome métabolique sur les différents organes ou systèmes physiologiques. Le recours à l’utilisation de modèles alternatifs comme des cellules en culture ne permet pas d'étudier les relations inter-organes ni d'avoir une approche fonctionnelle des organes. Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur ce modèle d'induction du syndrome métabolique sur cette espèce. Le rat est utilisé comme "source" de tissus d'intérêt en vue de constituer une tissuthèque permettant des analyses ultérieures. Il n’est pas possible d’évaluer un effet in vitro, car une eau ultra pure sera fortement hypo-osmotique et entrainera une mort cellulaire immédiate. Si elle est diluée dans un mélange complexe, elle n’a plus d’intérêt.
Réduction
Nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques avec une puissance suffisante. Le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base d’études publiées, qui utilisent le même modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres. Les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles.
Raffinement
Ce protocole ne fait appel qu’à des procédures expérimentales légères ou sans réveil (après anesthésie gazeuse à isoflurane puis exsanguination) et à des prélèvements de tissus sur animal mort ne pouvant donc pas entraîner de douleur ou une douleur ou une contrainte légère et très brève (manipulation/contention). Outre la surveillance réglementaire quotidienne, nous suivrons très précisément l’état général des animaux, leur poids ainsi que leur prise alimentaire à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole. S’il s’avérait que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (15% au cours d'une semaine), soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision sera prise par un des responsables du projet.
Choix des espèces
Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur le modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres sur cette espèce. Pour ces études, le rat est utilisé comme « donneur » d’organes. C'est également une des espèces la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous n’utilisons que des rats males car il est difficile de maitriser le cycle menstruel chez la rate et celui-ci modifie le métabolisme en particulier le métabolisme du glucose qui nous intéresse particulièrement. De plus, nous utiliserons une souche connue dans la littérature pour être plus sensible à l’installation d’un syndrome métabolique sous régime gras et sucré que d’autres souches.
Développement et validation par des composés modèles d’une procédure expérimentale pour évaluer des effets de perturbateurs endocriniens suspectés sur le système thyroïdien et l’immunité de la truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 400 un niveau léger. Dès la fécondation et pendant six mois, elles sont exposées à deux perturbateurs de la thyroïde, puis infectées par un virus, l'infection pouvant provoquer une exophtalmie, une perte d'équilibre et la mort. Le projet vise à valider un protocole d'évaluation des perturbateurs endocriniens sur la thyroïde et l'immunité du poisson. Le porteur affirme que les tests in vitro ou sur embryons ne peuvent se substituer à l'étude sur un organisme complet.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer et valider un protocole d’évaluation des effets potentiels de différentes substances perturbatrices endocriniennes chez un poisson d’eau douce modèle, la truite arc en ciel (TAC), en utilisant 2 composés modèles, le propylthiouracile (PTU) et la triiodothyronine (T3) dont les effets perturbateurs ont été décrits. Ce protocole sera mis en œuvre sur les premiers stades de développement de la TAC, en ciblant de manière originale et novatrice les effets sur le Système Hormonal Thyroïdien (SHT) et le Système Immunitaire (SI) ainsi que les interactions entre ces deux systèmes. Les essais intègreront un suivi de différents paramètres (morbidité/mortalité, suivi des modifications morphologiques, modification du comportement, taux d’hormones thyroïdiennes, réponse immunitaire, histopathologie) et de la résistance à une épreuve infectieuse au virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (vNHI) après une exposition chronique aux composés modèles de plusieurs mois.
Bénéfices attendus
Afin d’évaluer le danger de composés suspectés d’avoir des effets perturbateurs endocriniens, il est nécessaire de disposer d’un système expérimental in vivo validé avec des composés modèles connus pour leurs effets positifs ou négatifs sur le système thyroïdien (hyper- et hypo-thyroïdie). En plus d’apporter des informations sur le lien entre le système immunitaire et le système thyroïdien, ce projet apportera des données de toxicité du PTU qui permettront d’approfondir l’évaluation de sa dangerosité comme perturbateurs endocriniens (PE).
Procédures
Pour chacune des deux procédures, les poissons seront exposés partir de la fécondation et pendant les 6 premiers mois de vie à différentes concentrations de deux substances perturbatrices du système thyroïdien : le PTU (procédure 1) et T3 (Procédure 2). A la fin de cette exposition chimique les poissons seront soumit à une épreuve infectieuse via une infection au vNHI (viruse de la Nécrose Hématopoïétique Infectieuse) par balnéation puis observé pendant 6 a 8 semaines. Au cours de ces expositions et infections 5 prélèvements (P) seront faits post-mortem aprés 1 mois (P0), 3 mois (P1), 6 mois (P2) d’expositions chimique, 96h post infection (P3) et au termes de l'expérimentation (P4) afin d’obtenir des données de morphométrie, d’histologie, de dosage d’hormones thyroïdiennes, d'immunologie et de comportement.
Impact sur les animaux
- Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales. - Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés à de faibles concentrations de contaminants (doses dites sublétales). - Comportements et symptômes caractéristiques de l’infection virale (exophtalmie importante, perte d’équilibre, …), avec une mortalité débutant en moyenne à 5-7 jours post-infection.
Devenir
Les animaux restants seront mis à mort, pesés et conservés à -80°C pour analyse.
Remplacement
L’étude des perturbations endocriniennes nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Elle ne peut pas être substituée, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Ces procédures expérimentales seront menées en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique. Le nombre maximum de poissons a été estimé à 3600, répartit comme suit : - 1800 pour la procédure 1 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de PTU) ; - 1800 pour la procédure 2 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de T3). Le nombre d’individus a été déterminé statistiquement.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - à réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement de nage anormal et/ou des signes de cannibalisme (œil en moins, nageoires abîmées, blessures sur le dos, ...) et/ou de détresse respiratoire.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) les caractéristiques spécifiques de cette espèce, notamment la présence de follicules thyroïdiens dans les tissus rénaux, un organe hématopoïétique-lymphoïde important chez les poissons téléostéens, en font un organisme très intéressant pour les études fonctionnelles, (3) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permettra par la suite des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles, et (4) son génome, entièrement séquencé, est disponible, facilitant ainsi les analyses génétiques. Les animaux seront utilisés du stade « embryon » au stade « alevin/juvénile » (de 0 à 8 mois post-éclosion), stades qui sont connus pour leur grande sensibilité aux contaminants chimiques.
Facteurs génétiques de régulation de la fonction surrénalienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur réduisant un gène des glandes surrénales, un prélèvement de sang, puis passent deux tests comportementaux, l'exploration d'un nouvel environnement et un test d'enfouissement. Le projet étudie le rôle génétique de la réponse au stress, en vue de cibles thérapeutiques renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que ces boucles de régulation entre cerveau et surrénales se modélisent difficilement en culture.
Objectifs
Une situation physique comme émotionnel perçue comme dangereuse, provoque une réaction de stress de l’organisme pour y faire face. Cela se traduit physiologiquement, notamment, par la synthèse d’hormones par les glandes surrénales. Cette réaction est fondamentale et permet de mobiliser l’organisme pour répondre au danger par des réactions physiologiques et comportementales. La régulation de la synthèse des hormones surrénaliennes est complexe et dépend en partie de la génétique propre à chacun, ce qui peut expliquer en partie pourquoi la réponse au stress peut être différentes d’une personne à l’autre. Le but de ce projet est de mieux comprendre cet aspect génétique, en étudiant les conséquences de la variation d’un gène régulateur de la synthèse hormonale dans les surrénales sur le stress et la réponse au stress. Ce projet sera mené chez la souris adulte, par l’étude d’une lignée de souris transgénique permettant la réduction de l’expression de ce gène dans les surrénales. Ces conséquences seront mesurées sur la synthèse hormonale, le comportement anxieux et l’anatomie surrénalienne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du fonctionnement surrénalien, incluant ses dysfonctionnements. En effet, si le stress est un mécanisme de défense indispensable du corps, ses conséquences peuvent être néfastes à long terme. Les connaissances nouvelles que devraient permettre ce projet, en plus des avancées dans la compréhension du fonctionnement des surrénales, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour réguler la réponse au stress. Les résultats obtenus sont mis à la disposition de tous via leur publication dans la presse spécialisée.
Procédures
Ce projet comporte deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère, qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt sélectivement dans les surrénales par l’administration d'un vecteur par injection intraveineuse, rapide et peu invasive. Nous en étudierons l’impact sur la production d’hormones et le comportement de réponse à un stress léger. Ainsi, 2 semaines après l’injection, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. 3 semaines après injection, les souris injectées seront incluses dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels et comparées avec un groupe témoin : exploration d’un nouvel environnement et interaction avec des objets inconnus. A l’issue de ces expériences, les souris seront euthanasiées et les surrénales prélevées post-mortem pour corréler les résultats hormonaux et comportementaux avec des analyses histologiques des surrénales.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur l'injection intraveineuse d'un vecteur réalisée sous contention. Cette opération est simple, rapide et peu invasive car le volume injecté est très petit (0,1 ml). Le vecteur injecté induira une réduction de la synthèse d’hormones surrénaliennes qui sera quantifiée sur un prélèvement unique d’un petit volume de sang. Les mêmes animaux effectueront également un test d’exploration et un test d’enfouissement, pour évaluer leur stress. Il s’agit de tests rapides reposant sur des comportements naturels de l’animal et ne nécessitant pas d’apprentissage. Ils sont donc peu stressants. L’ensemble de ces nuisances sont réparties en deux procédures, l’une de classe modérée et l’autre de classe légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs surrénales prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.
Remplacement
L’étude de la réponse au stress par les surrénales implique d’étudier un organe au sein duquel dialoguent différents types cellulaires, qui sont eux-mêmes régulés par des interactions à longue distance avec le cerveau. Ces boucles de régulation physiologiques peuvent difficilement être modélisées, ou reproduites en culture ce qui justifie de réaliser des expériences chez l’animal.
Réduction
Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure permet à la fois l’étude de l’effet de l’expression génique sur les surrénales et la recherche de la dose efficace de vecteur à administrer. Cela permettra à la seconde procédure une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure en réduisant le risque d’avoir à la répéter. Enfin chaque prélèvement réalisé sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure. Cette évaluation individualisée contiendra deux paliers : le premier déclenchant une surveillance renforcée deux fois par jour et le second déclenchant l’arrêt de l’expérience s’il est atteint. Les conditions expérimentales seront optimisées pour causer une douleur minimale et un stress réduit : injection intraveineuse optimisée, prélèvement sanguin de petit volume effectués à une veine superficielle, examen fonctionnel non-invasif analysés sur vidéos, par l’observation de la réalisation de tâches naturelles de la souris (exploration, enfouissement).
Choix des espèces
Ce projet propose d'étudier le rôle de l’expression génique dans les fonctions endocrines des surrénales. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. Notre équipe travaille de longue date sur cette approche. Nous avons développé des outils génétiques et des approches histologiques efficaces. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale, ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons d’utiliser sont validés par de nombreuses publications.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèle pharmacologique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.
Impact sur les animaux
Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.
Rôle de la chimiokine CCL5 dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique chez la souris: implications physiopathologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 opérées puis tuées sans réveil. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras de trois mois, elles reçoivent une canule implantée dans le cerveau et une mini-pompe sous-cutanée pendant trois mois, puis subissent 96 prélèvements de sang chacune au fil de tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate. Le porteur étudie le rôle d'une molécule pro-inflammatoire, la CCL5, dans la dérégulation de la glycémie par l'hypothalamus, en vue de cibles médicamenteuses renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que seul un modèle in vivo chez "l'animal entier" permet de comprendre ce phénomène et conclut à l'utilisation de la souris.
Objectifs
L’obésité associé au diabète de type 2 (DT2) représente un problème majeur de santé publique dans la mesure où 11% de la population mondiale est obèse et 300 millions de personnes sont affectés par un DT2 selon l’« International Diabetes Federation ». 80% des personnes développant un DT2 sont obèses soulignant ainsi un lien étroit entre les 2 pathologies et, de fait, l’insulino-résistance est une caractéristique commune de l’obésité et du DT2. Ce lien étroit entre l’obésité et le DT2 nous incite à identifier les mécanismes fondamentaux couplant le contrôle de la balance énergétique et la régulation de la glycémie. De récentes études scientifiques suggèrent que l'inflammation favorise le développement de l'obésité et de l'hyperglycémie chronique caractérisant le diabète de type 2. Notre projet a pour objectif d'étudier les effets d'une substance pro-inflammatoire (CCL5) sur le développement de l'obésité et du DT2 au niveau d'une région bien précise du cerveau, l'hypothalamus qui contrôle le métabolisme énergétique et glucidique.
Bénéfices attendus
Si le contrôle de la glycémie par le cerveau reste un domaine de recherche encore peu exploré et mal compris, il ouvre de larges perspectives thérapeutiques. En effet, le système gluco-régulateur de l’hypothalamus pourrait intervenir à hauteur de 50% dans le maintien de l’homéostasie glucidique. Il semble donc probable que des dysfonctionnements de la régulation centrale de la glycémie participent au développement du diabète. L'identification de nouvelles molécules pouvant induire un dysfonctionnement du contrôle de la glycémie par le cerveau devrait permettre d’ouvrir de nouvelles voies pour le développement de médicaments anti-diabétiques et d’améliorer le traitement de cette pathologie.
Procédures
Cette étude sera réalisée sur des souris soumises à un régime standard et à un régime riche en lipide de 3 mois qui les rend obèses et diabétiques. Une puce électronique de traçabilité sera injectée dans l’espace sous-cutané interscapulaire après anesthésie. Les animaux seront hébergés à température (22°C) et humidité constantes et exposés à un cycle de 12h-12h lumière/obscurité. Les souris auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Dans le cas de la procédure 2, les animaux subiront la pause d'une canule en intracérébroventriculaire ainsi que d'une mini-pompe osmotique en sous-cutané (cette opération prend environ 30 mins) qui seront implantés pour une durée de 3 mois. Les souris seront ensuite laissées au repos pendant 2 semaines avant qu'elles soient soumises à la batterie de tests physiologiques. Chaque souris de chaque lot sera soumise successivement à l'ensemble des tests physiologiques afin de réduire le nombre d’animaux impliqués dans le projet. Au cours de chaque test, des prélévements da sang seront effectués à partir de la queue des animaux. Pour l'ensemble des tests (glycémie de base, test de tolérance au glucose, test de tolérance à l'insuline, test de tolérance au pyruvate et test de sécrétion d'insulie), chaque souris subira 96 prélèvements de sang. Chaque test comprendra 22 prélèvements (sauf pour le test de sécrétion d'insuline qui ne comprendra que 6 prélèvements) et la souris aura une période de récupération d'une semaine entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par la chimiokine CCL5 ou par l'antagoniste du récepteur CCR5 n'entraine que très peu d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures menées par d'autres équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. De même, les injections ip de glucose, insuline, pyruvate sont utiliées en routine par de nombreuses équipes de recherche et par nous-même, et aucun effet indésirable n'est constaté pour ces substances aux doses administrées. Enfin, les actes chirurgicaux décrits dans cette DAP sont eux aussi réalisés en routine au sein de notre équipe et aucun effet indésirable sur le comportement et la santé de l'animal n'a été constaté sur la longueur du protocole expérimental.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront euthanasiées à l'issue du protocole expérimental. De même, les animaux prévus pour des prélévements d'organes seront euthanasiées.
Remplacement
Au cours de ce projet, les effets de la molécule pro-inflammatoire CCL5 seront tout d'abord évalués in vitro sur une lignée de cellules neuronales hypothalamiques, la lignée mHypoA-59, ce qui nous permettra d'excure certaines hypothèses de travail et ainsi réduire sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés pour les tests physiologiques qui ne peuventêtre réalisés que chez l'animal entier.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, l'ensemble des 5 tests physiologique prévus pour évaluer l'homéostasie glucidique sera réalisé successivement sur une même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d'une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précedent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur (pose des puces de traçabilité, incision, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront en pré-opératoire et à 6-8 h puis 12-16 h post-opératoire un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Pour ce projet, des souris mâles âgées de 10 semaines en début d'expérimentation seront utilisées car c'est la physiologie adulte qui sera étudiée. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de la chimiokine CCL5 dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec les données obtenues chez l’homme. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes.
Etude de la fonction de Kat2b et autres mécanismes moléculaires dans le développement de la Fibrose Hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Cinq jours en cage métabolique, des tests métaboliques de quatre heures toutes les deux semaines, des injections d'insuline et de pyruvate dans l'abdomen et une prise de sang derrière l'œil sous anesthésie en fin de protocole : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie. Les régimes et traitements imposés altèrent le fonctionnement du foie, avec un risque de fibrose et de troubles digestifs, afin d'évaluer le rôle du gène KAT2B dans l'identité des cellules hépatiques. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer ce gène dans le foie. Le porteur affirme qu'il est "impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro", et annonce adosser au projet le développement d'organoïdes de foie humain censés fournir "un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle".
Objectifs
Notre projet vise à définir le gène de la lysine acetyl transferase 2B (KAT2B) comme un gardien de l'identité des hépatocytes et une cible pharmacologique pour contrecarrer la perte d'identité et de fonction hépatocytaire caractérisant les foies gravement lésés.
Bénéfices attendus
Le contrôle et le rétablissement de l’identité hépatocytaire émergent comme des voies thérapeutiques potentielles dans les formes graves d’atteinte à la fonction du foie. En identifiant un acteur pouvant être ciblé pharmacologiquement dans ce but, notre projet fera passer un cap permettant d’envisager plus sérieusement cette approche thérapeutique. D’autre part, en y adossant le développement d’organoïdes de foie humain, ce projet contribuera à fournir un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle.
Procédures
La totalité des souris sera soumise à différentes régimes ou traitements (6 protocoles de traitements ou régime) associés à des tests métaboliques et cages métaboliques (5 jours) afin de mesurer l'éfficacité des traitements provoquant la dysfonction hépatique et le rôle de nos gènes d'inéterets ou molécules pharmacologiques dans la physiopathologie hépatique. Ces tests métaboliques seront réalisés tous les 2 semaines sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pendant une durée de 4 heures. La totalité des souris sera soumise à un prélèvement sanguin à la veine caudale lors des tests de tolérance au glucose afin de determiner l'insulinémie et la glycémie. La totalité des souris sera soumise à une injection intra péritonéale d'insuline et de pyruvate. Un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire d'une durée de 3 minutes sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane à l'issu des protocoles expérimentaux. Nous utiliserons 60 souris de chaque génotype (wt/ko) pour les 5 procédures, traitées ou non avec l'activateur pharmacologique.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable qui pourrait être attendu sur les animaux est l'apparition d'un stress en lien avec la manipulation des animaux. Le développement d'une fibrose du foie pourra également générer des effets indésirables, notamment des troubles digestifs.
Devenir
A l'issu des protocoles, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie générale de l'animal. Des dissections des échantillons biologiques seront réalisées pour mener les études histologiques, moléculaires et épigénétiques.
Remplacement
Nos objectifs sont de mieux comprendre la physiopathologie de stéatose hépatique. Pour cela, la validation chez l'animal est une obligation pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et physiopathologiques à l'origine de CETTE maladie. Nous devons donc utiliser des souris génétiquement modifiées pour identifier certains gènes intervenant dans le dévelopement de cette maladie. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier vivant pour reproduire la physiopathologie complexe de la stéatose hépatique, car cette maladie fait intervenir plusieurs types cellulaires dans le foie mais également d'autres organes comme l'intestin. Il est donc impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux, une étude statiistique (utilisation du logiciel gpower pour definir le nombre d'animaux necessaires) est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de générer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés (glycémie, poids, ...).
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée reste le meilleur modèle pour étudier l'effet d'un gène sur le développement d'une maladie. Nous utiliserons donc des souris invalidées pour notre gène d’intéret spécifiquement au niveau hépatique. Ces souris seront soumises à différents traitements régimes afin de mimer le développement d’une maladie du foie. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines (pesant entre 20 et 30g) possédant un système digestif et immunologique mature, permettant l'étude d'un système physiologique digestif optimal.
Mise en place du test de charge calcique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de vitamine D pendant trois jours puis une charge calcique, subissent un jeûne pouvant atteindre 18 heures et un isolement en cage métabolique, avant une prise de sang terminale. Le porteur reconnaît que les gavages peuvent irriter l'œsophage et que le jeûne et l'isolement sont sources de stress. L'objectif est de "mettre en place" un test de charge calcique chez la souris, les animaux étant ensuite tués pour analyser les tissus.
Objectifs
L'homéostasie calcique est un réseau finement régulé impliquant de nombreux organes (i.e. glandes parathyroides, intestin, rein, os). Dans de nombreuses pathologies, dont beaucoup sont encore idiopathiques, les patients pédiatriques ou adultes présentent des hypercalcémies et des hypercalciuries. Ces patients partagent un tableau clinique similaire : des niveaux circulants de vitamine D élevés et ceux d'hormone parathyroidienne effondré. L'ensemble de ces résultats indiquent que bien que la cause ne soit pas toujours connue, les symptômes sont liés à une augmentation des niveaux de vitamine D. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole de charge calcique chez la souris sauvage pour déterminer les niveaux de calcium urinaire, et de déterminer les effets de bolus de vitamine D sur ce paramètre.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se basent sur la mise au point d'un paramètre clinique pertinent pour déterminer les effets de mutations chez la souris et également l'effet de nouvelles options thérapeutiques. Les résultats obtenus permettront d'améliorer l'évaluation clinique des hyperabsorptions calciques et des hypercalciuries et d'ameliorer le diagnostique et la prise en charge clinique des patients.
Procédures
1 administration par jour de vitamine D par gavage (15 sec par administration) pendant 3 jours, puis une administration unique par gavage de solution calcique, et une prise de sang terminale (30 sec). Une mise à jeun de 18H maximum et une mise en cage métabolique pendant 4H.
Impact sur les animaux
D'après nos travaux précédents, le régime de vitamine D administré n'induit pas de nuisances ni de souffrance aux animaux. L'expérience de charge calcique est classiquement réalisée chez les jeunes enfants chez l'humain, et aucun effet indésirable n'a été rapporté. Les gavages réalisés peuvent induire une irritation de l'oesophage et l'isolement dans les cages métaboliques ainsi que le jeun peuvent entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour étudier les effets sur les tissus.
Remplacement
L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. Aucune méthode alternative n'est disponible en raison de la compléxicité de ce réseau qui ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.
Réduction
L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux est le nombre d'animaux optimal afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales, dans des cages agrémentées avec un nid. Si une souris présente des difficultés pour se nourrir suite à une irritation de l'oesophage induite par les gavages, de la nourriture en gelée sera placée dans le fond de la cage. Les autres points limites sont un pelage terne ou hérissé, un ecoulement lacrymal, l'immobilité, ou une baisse de la température corporelle. Dans ce cas, des mesures appropriées seront prises en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes fins régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leurs similitudes avec ceux chez l'Homme. Le diagnostique de ce type de pathologie peut se faire soit chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Ainsi la moitié des animaux sera utilisé à l'age de 5-6 semaines, l'équivalent du jeune enfant, et entre 12-15 semaines l'équivalent du jeune adulte.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèles génétiquement modifiés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.
Moduler l’expression des gènes dans le tissu adipeux des souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.
Procédures
La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.
Remplacement
Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.
Etude de la signalisation insulinique cérébrale dans un modèle animal diabétique : le rat Goto Kakizaki
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Diabétiques de la lignée Goto-Kakizaki ou témoins Wistar, ils subissent une chirurgie stéréotaxique unique pour injecter de l'insuline ou son véhicule dans un ventricule cérébral, restent quinze minutes sous isoflurane puis sont mis à mort aussitôt. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie locale et analgésie, et affirme n'attendre "pas" de souffrance liée à la procédure. Il présente le rat GK comme un modèle de diabète de type 2 "impossible" à remplacer par des systèmes in vitro ou in silico pour étudier la réponse à l'insuline.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une pathologie due à l'altération du métabolisme glucidique et dont la prévalence mondiale augmente de façon alarmante. Il est caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion d'insuline par les cellule beta du pancréas et à une résistance à l'action de cette hormone au niveau de ses tissus cibles périphériques : le muscle, le foie et le tissu adipeux. L'objectif de notre projet est d'élucider, dans un modèle animal de diabète de type 2 le rat GK , si la résistance à l’insuline est aussi présente dans le cerveau. Pour cela nous allons étudier dans cet organe les mécanismes moléculaires de la signalisation de l'insuline suite à une administration d'insuline ou de sérum physiologique ( véhicule) par injection stéreotaxique dans le ventricule latéral du cerveau. Pour cette étude, qui portera sur les animaux des deux sexes, 40 rats diabétiques GK et 40 rats Wistar sains seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Le diabète est associé à de nombreuses comorbidités, dont des troubles neurocognitifs tels que la maladie d’Alzheimer. Dans la littérature, une altération de la signalisation insulinique dans le cerveau est proposée comme un mécanisme participant au développement des maladies neurodégénératives. Ainsi, en recherchant dans ce projet si le rat diabétique GK possède une insulinorésistance en central comme en périphérie, il serait intéressant d’agir sur ce mécanisme en thérapeutique d’autant plus qu’il n’existe toujours pas de traitement curatif pour le diabète et les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux vont subir une chirurgie unique par stéréotaxie afin d' injecter dans le ventricule latéral une solution d'insuline ou de son véhicule . Cette opération dure 20 minutes. A la fin de l'injection, une petite goutte de sang de 10 microL, obtenue à l'extrémité de la queue en piquant avec une petite aiguille 26G, est prélevée pour contrôler la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane, la tête est fixée sur un cadre stéréotaxique, le crâne est desinfecté et rasé , une incision longitudinale de la peau du crâne est effectuée à l’aide d’un ciseau fin. L’os du crâne est perforé à l’aide d’une fraise. Le volume injecté grâce à une seringue hamilton munie d'une aiguille 26G est de 5 μL à un débit de 1 μL/minute pendant 5 minutes. Il n'est pas attendu de souffrance dans le cadre de la procédure chirurgicale, nous procédons à une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Nous surveillons les paramètres vitaux, la respiration, le pouls et la température corporelle.
Devenir
Il n'y a qu'une seule procédure dans ce projet. Après l'injection stéréotaxique dans le cerveau, les 80 rats restent sous anesthésie à l'isoflurane pendant les 15 minutes nécessaires à l'action de l'insuline puis sont immédiatement mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse à l’administration de l'insuline ne peut être réalisée que sur animaux vivants et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes .En fonction de la procédure expérimentale, des variables étudiées et du nombre d’effectifs, nous utiliserons principalement des tests paramétriques, et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Pendant la procédure la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Afin de raffiner la procédure et réduire au mieux l’apparition éventuelle de douleur, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (Une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Le choix du protocole expérimental impliquant les 8 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes mâles et femelles de 4 mois, ce qui nous garantit aussi une stabilisation du diabète chez les GK.