Système endocrinien

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

670 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles des deux premières procédures, âgées de 8 semaines ou de 12 mois, reçoivent un régime riche en graisses, des composés libérant du monoxyde de carbone par voie orale ou intrapéritonéale, et des prises de sang à la queue sans anesthésie. Les 220 autres, dont 110 souris diabétiques db/db, subissent sous anesthésie l'ablation d'un morceau de peau pour créer une plaie, et leurs organes sont prélevés 21 jours plus tard. Le porteur affirme que ce régime "n'implique pas de procédures invasives" et, avec l'une de ses molécules, ne provoque "aucun stress ni impact sur la santé des animaux", alors qu'il l'emploie pour rendre les souris obèses et qu'il qualifie lui-même leurs prises de sang d'"intervention invasive".

Objectifs

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.

Procédures

Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes. Pour cette intervention, 220 animaux seront utilisés (110 souris C57BL/6 + 110 souris C57BLKS/J db/db). Après 21 jours à compter de la création de la plaie, un prélèvement de sang sans anesthésie (20 μl) sera effectué avant le prélèvement des organs.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les 3 protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures 1 et 3 (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05 et si la différence entre les lots témoin et traité est inférieure ou égale à 2 avec une puissance de 0.9, comme déjà publiée, et ceci avec des effectifs de 10 animaux dans chaque groupe. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Dans la procédure 2, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi minimiser la douleur, la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons déjà montré que le régime alimentaire riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l'une de nos molécules ne provoquent aucun stress ni impact sur la santé des animaux. Par contre, si nous remarquons que pour une raison quelconque les animaux vont perdre plus de 15% de leur poids en 1 semaine nous procéderons à leur sacrifice. Concernant le protocol de plaie de la peau, les animaux subiront une euthanasie compassionnelle pour éviter la souffrance s'ils présentent une surinfection de la plaie ou un des signes suivants: prostration, dos voussé, pelage terne et hérissé, animal ne se nourrissant ou ne s’abreuvant plus, et ayant une perte de poids >15%.Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés en utilisant moins de doses pour chacun. Nous sommes assurés que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques (C57BLKSJ db/db) et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses et insulino-résistantes par un régime gras de huit semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, la moitié subissant en plus la pose chirurgicale d’un cathéter dans la veine jugulaire, pour comparer l’effet d’une huile interestérifiée de l’industrie agroalimentaire sur le métabolisme du glucose. Le porteur situe la retombée du côté d’une meilleure compréhension de cet additif alimentaire. Il indique explorer des approches in vitro de type organe sur puce, tout en jugeant le modèle animal encore nécessaire.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'effet d'un apport en graisse interestérifiée sur le métabolisme glucidique chez la souris. Les graisses interestérifiées. Les graisses interestérifiées sont issues de l'industrie agro-alimentaires et ont été développées par de nombreux fabricants d’aliments transformés pour trouver un substitut approprié lorsque des études scientifiques ont exposé les dangers inhérents aux acides gras trans pour la santé publique. Les industriels de l'agro-alimentaires devaient trouver une forme de graisse qui offrirait toujours la durée de conservation prolongée des huiles partiellement hydrogénées, mais qui ne contiendrait pas d’acides gras trans. Les graisses interestérifiées ont donc été développées. Il s'agit d'un produit entièrement hydrogéné avec bon nombre des mêmes caractéristiques que les graisses trans, mais chimiquement plus proche des graisses saturées. La graisse interestérifiée est produite par un processus appelé interestérification, qui réorganise la structure moléculaire des huiles végétales grasses. Des données chez l'animal et l'Homme montre cependant qu'un apport de graisse interestérifiée pourrait avoir un effet délétère sur l'homéostasie énergétique (prise de poids, intolérance au glucose voire insulino-résistance). Notre projet a pour but d'étudier l'effet des graisses interestérifiées sur l'homéostasie du glucose par rapport à un régime hyperlipidique n'en contenant pas chez des souris.

Bénéfices attendus

L'ensemble de cette étude permettra de mieux comprendre les effets d'une supplémentations en huile de palme interestérifié sur le métabolisme glucidique dans un modèle préclinique d'insulino-résistance.

Procédures

Quarante souris du lot 1 et quarante souris du lot 2 animaux seront soumises à un régime hyperlipidique pendant 8 semaines qui entraînera une prise de poids et la mise en place d'une insulino-résistance. De plus les animaux subiront des prélèvements sanguins une fois par semaine (10 microlitres) et 30 microlitres la semaine 7 pour le lot 1 un pendant le test de tolérance au glucose (qui dure 120 min, 3 prélévements de 10 microlitres aux temps 0, 15 et 120 min ). Pour le lot 2, un cathéter sera implanté dans la veine jugulaire à la semaine 7 (pour les 80 souris de ce lot 2) et 30 microlitres de sang seront également prélevés à la semaine 8 pendant le clamp hyperinsulinémique euglycémique (la durée du clamp est de 120 min, et les prélèvement s ont lieu aux temps 90, 100 et 120).

Impact sur les animaux

L'étude étant limitée à 8 semaines, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables. Hormis l'apparition d'une prise de poids et d'une insulino-résistance qui sont les effets attendus du régime hyperlipidique. Siur la base de notre expérience de trente ans d'utilisation des régimes obésogènes, il faut noter que la prise de poids attendue n'induit pas une obésité massive (environ 5 grammes pour une souris de 30 g). Il n'y aura pas donc d'effets délétères majeurs. En ce qui concerne la chirurgie, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques. Le point limite est une perte de poids supérieure à 15% en suivi post-chirurgie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interestérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nos collègues brésiliens ont commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Ils ont aussi réalisé une étude in vivo pour trouver la bonne dose d'HPI à utiliser pendant les 8 semaines de l'expérience. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux donnees de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons sur des modèles de souris obèses depuis une 20aine d'années) nous avons estimé la taille des echantillons ( n=10 par groupe) permettant une analyse statistique efficace (test non paramétrique Mann-Whitney U). En effet les groupes de souris sont généralement très homogènes en terme de tolérance au glucose, des données physiologiques et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénèes dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % l'animal sera euthanasié. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5µl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés d'une semaine. Pour la série desitnée à la réalisation des clamps euglyémqiues-hyperinsuliénmiques, l'implantation du cathèter sera réalisée dans des conditions strictes d'asseptie par du personnel hautement qualifié ayant l'habitude de ce type de chirurgie. Les animaux sont anesthésiés par inhalation à l’ISOFLURANE® en 2 temps : la phase d’endormissement pendant laquelle est délivré 3,5% d’ISOFLURANE® dans l’air à un débit de 2L/min puis la phase d’entretien de l’anesthésie avec de l’ISOFLURANE® à 1,5% d’air à un débit de 0,4L/min. L’ISOFLURANE® n’ayant pas de propriétés analgésiques, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. Le cathéter est passé sous la peau et est externalisée au niveau interscapulaire. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques et le point limite est une perte de poids de 15%.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes, partagent avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d’informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (30 jours) et seront nourris aux différents régimes pendant 8 semaines. La mise sous régime à un âge précoce permet d'avoir des résultats plus marquant qu'une mise sous régime qui se produirait à un âge plus avancé et mime l'apport excessif de calories pendant l'adolescence dans l'espèce humaine.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.

990 souris vont être utilisées pour tester des candidats médicaments contre le syndrome métabolique, et une partie d'entre elles n'entre dans le projet qu'à seize semaines, après au moins douze semaines d'humanisation de leur système immunitaire ou de leur foie. Un régime riche en graisse et en sucre doit leur faire développer obésité, diabète et stéatose hépatique, et elles subissent des prises de sang ainsi que des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec mise à jeun et injection intrapéritonéale, qui durent jusqu'à 13 h 30. Le porteur classe ces procédures à un niveau de souffrance modéré et cite pourtant, parmi les effets possibles, des accidents vasculaires cérébraux, une encéphalopathie hépatique, une ascite et des vomissements de sang. Une souris qui atteint un score clinique de 7 ou perd plus de 25 % de son poids maximal est mise à mort, et toutes les autres le sont en fin d'étude, le porteur écrivant que le protocole induit des "modifications délétères pour la santé de la souris".

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.

Bénéfices attendus

En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun suivie de prise de sang pour analyse de la glycémie et injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. Durée totale du test entre 5h30 et 13h30.

Impact sur les animaux

Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie, polyurie – polydipsie, troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Le modèle induisant des modifications délétères pour la santé de la souris, les souris seront mises à mort en fin d'étude.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.

Réduction

Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur les effets attendus de la série, ainsi que des tests statistiques paramétriques et non paramétriques. Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 1 à 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 25%, calculée à partir du poids mesuré le plus élevé, sera considérée comme une raison de mise à mort. Une augmentation importante du poids et une obésité entraînant une invalidité sera aussi considérée comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire ainsi que l'humanisation du foie chez les souris. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre avec cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humanisation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.