Système endocrinien
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Activation de l’axe corticotrope par injection d’un agent inflammatoire dans le système nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un agent inflammatoire, puis des prélèvements sanguins et musculaires et une mesure des propriétés contractiles du muscle, dans un modèle de cachexie associée au cancer. Le porteur annonce peu d'effets attendus hormis une légère perte de poids musculaire, tout en classant l'ensemble en gravité sévère. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité de ce processus multi-tissus et que seul un modèle murin le permet.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. La cachexie associée au cancer s'accompagne d'une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien), d'une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez la souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope.
Procédures
Pour déterminer le temps de prélèvement tissulaire optimal et des concentrations d'IL1ß et d'activine A optimales, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, prélèvements sanguins, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 60 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central et 15 min pour les prélèvements tissulaires). Pour déterminer les effets de l'inflammation centrale sur la force musculaire et la réponse transcriptionnelle musculaire, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, mesure des propriétés contractiles du muscle tibialis antérieur, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 90 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central, 30 min pour la mesure des propriétés contractiles du muscles et 15 min pour les prélèvements tissulaires).
Impact sur les animaux
La gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Même si aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu avant la procédure d'injection de l'agent inflammatoire dans la région centrale d'intérêt, nous mettrons tout en place afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux. Pour cela, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à compter de la date de réception dans l'animalerie (12 semaines). La mesure de force et les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 après l'injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base d'un critère d'évaluation principal (concentration de corticostérone circulante). Cette stratégie statistique nous permet de déterminer au mieux le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de nos analyses. En fonction des plans expérimentaux, les effets biologiques seront déterminés par comparaison de 2 moyennes ou par comparaisons de plusieurs moyennes entre elles.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Toutefois et afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) dès leur réception à l'âge de 12 semaines. Les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Même si aucune complication particulière n'est attendue, l'agent inflammatoire pourra être à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (2 à 5%). Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 post-injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
La quasi-totalité des données dans le domaine de la cachexie associée au cancer a été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Les souris seront utilisés à l'âge de 15 semaines. Cela correspond à un stade de cachexie dans le modèle murin Apc. La mutation du gène Apc (adenomatous polyposis coli) provoque chez la souris une polypose rectocolique qui est associée à l'activation de l'axe corticotrope et au développement de la cachexie.
Rôle des endocannabinoïdes produits par le tissu adipeux viscéral et sous-cutané dans la physiopathologie de l’obésité et du diabète de type II (EndocaTA).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
625 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées en gravité légère. Soumises pendant seize semaines à un régime gras à base de lard, puis mises à jeun et tuées pour prélever leur tissu adipeux, elles peuvent selon le porteur prendre un poids les empêchant d'accéder à l'eau et à la nourriture et développer un état dépressif et anxieux, effets décrits malgré le classement en gravité légère. Le projet étudie le rôle des endocannabinoïdes du tissu gras dans l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur indique recourir à des explants de tissu adipeux in vitro et écarte la microdialyse qui "nécessiterait plus d'animaux".
Objectifs
L’obésité s’accompagne d’une hyperactivation du système endocannabinoïde dans plusieurs organes favorisant l’apparition de dérégulations métaboliques. L’utilisation d’un antagoniste, le Rimonabant, capable de bloquer les principaux récepteurs de ce système, (les récepteurs aux cannabinoïdes 1 ou CB1R) s’est avérée être une approche thérapeutique efficace pour l’Homme entre 2006 et 2008. Pourtant, le Rimonabant a été retiré du marché en 2008 à cause de ses effets secondaires neuropsychiatriques consécutifs à son action sur les CB1R localisés dans le cerveau. Par la suite, il a été démontré que l’amélioration des paramètres métaboliques induits par le Rimonabant était majoritairement due au blocage des CB1R périphériques conduisant à des effets bénéfiques sur plusieurs organes clés du métabolisme glucido-lipidique dont le foie, le muscle squelettique, le pancréas et le tissu adipeux. Aujourd’hui, le rôle des CB1R périphériques est clairement illustré par des études montrant que le blocage de ces récepteurs périphériques diminue le risque cardio-métabolique chez la souris obèse. Alors que la présence des CB1R dans les organes majeurs de l’homéostasie glucido-lipidique est bien démontrée, l’origine des ligands qui activent ces récepteurs, les endocannabinoïdes (ECs), est plus discutée. Les 2 principaux ECs, l’anandamide (AEA) et le 2-arachidonylglycérol (2-AG) sont généralement synthétisés localement « à la demande » et ont une action autocrine et une durée de vie très courte. Ils sont également retrouvés dans le plasma où leur concentration semble refléter leur production par les tissus périphériques et en particulier le tissu adipeux. En effet, les ECs circulants sont augmentés chez les obèses et particulièrement chez les individus présentant un excès de graisse viscérale. Ainsi, l’objectif du projet est de démontrer qu’au cours de l’obésité, des ECs sont produits en excès par les dépôts graisseux et exercent une action locale (autocrine / paracrine) sur les CB1R pouvant conduire à une altération du métabolisme des adipocytes et modifier leurs capacités de différenciation.
Bénéfices attendus
Les ECs régulent de nombreuses fonctions physiologiques dont certaines impliquées dans l’homéostasie énergétique. Ainsi, il est admis que le SEC stimule la prise alimentaire et favorise le stockage de l’énergie via l’action coordonnée des ECs sur les CB1R présents dans de nombreux organes. Ce projet devrait nous permettre d’obtenir des informations importantes concernant la nature des ECs produits (AEA ou 2-AG) par le tissu adipeux pathologique en comparaison avec le tissu adipeux sain et de préciser leur origine (tissu adipeux viscéral ou sous-cutané). De plus, nous devrions démontrer que l’inactivation des CB1R du tissu adipeux conduit à une diminution de la production des ECs limitant ainsi leurs actions autocrines et/ou paracrines néfastes pour l’organisme. Ces effets seront évalués en mesurant la production d’adipokines et de cytokines pouvant être impliquées dans l’installation du diabète de type II.
Procédures
Dans ce projet, les animaux sont tout d’abord soumis soit à un régime standard soit à un régime hyperlipidique (60% lipides à base de lard) pendant environ 16 semaines. Les animaux sont ensuite mis à jeun 12h avant d’être anesthésiées puis mises à mort en vue de prélèvements d’organes.
Impact sur les animaux
En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Le tissu adipeux périépididymal et inguinal sera prélevé en vue de la préparation d’explants en culture ou de cultures de cellules de la fraction stroma-vasculaire. Des échantillons de foie et de tissu adipeux seront également prélevés pour analyse ultérieure de certains paramètres caractérisant le métabolisme glucido-lipidique (dosages de lipides, mesures d’activités enzymatiques, dosages plasmatiques par kits colorimétriques...).
Remplacement
L’approche méthodologique in vitro utilisée dans ce projet est basée sur la mise en culture d’explants de tissu adipeux. Ce modèle a été retenu préférentiellement à des lignées comme les 3T3 par exemple car il respecte l’intégrité physiologique du tissu. En effet, le tissu adipeux est hétérogène et les différents types cellulaires le composant peuvent avoir un impact sur le métabolisme des adipocytes, ce qui est particulièrement vrai pour les macrophages. Ce modèle pourrait être remplacé par une méthode d’exploration in vivo utilisant un protocole de microdialyse du tissu adipeux. Toutefois cette technique nécessiterait plus d’animaux et serait plus traumatisante.
Réduction
Le modèle d’explants de tissu adipeux permet une réduction importante du nombre d’animaux par rapport à une exploration in vivo. En effet, cette méthode offre la possibilité de tester plusieurs traitements sur un même animal puisque le tissu est découpé en petits fragments et réparti dans des plaques multi-puits. De plus, dans ces conditions il est possible d’étudier le tissu adipeux viscéral et le sous-cutané sur la même souris.
Raffinement
Au laboratoire, plusieurs projets autour de la thématique de l’obésité utilisent des souris soumises aux mêmes conditions nutritionnelles. C’est pourquoi, aussi souvent que possible, les tissus destinés à la préparation d’explants ou de cultures de cellules de la fraction stroma-vasculaire seront prélevés sur des souris engagées dans d’autres protocoles. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). Tout au long du traitement nutritionnel, l’état général des animaux sera surveillé de façon régulière car bien que l’obésité ne soit pas un point limite, les pathologies qu’elle génère peuvent être une source de dérèglements internes. Le régime gras peut altérer le métabolisme et la santé mentale des animaux (état dépressif et anxiété). Un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Toutefois la durée du régime étant limitée à environ 16 semaines, la prise de poids ne devrait pas être associée à une mauvaise condition physique. Le régime hyperlipidique est administré sous forme de croquettes beaucoup moins dures que les croquettes d’entretien classiques ce qui peut favoriser la pousse des incisives jusqu’à la malocclusion dentaire liée à un manque d’usure des dents. Pour éviter l’apparition de cette pathologie des objets à ronger seront introduits dans la cage.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche pour tenter de comprendre les mécanismes à l’origine des dérégulations métaboliques liées à l’obésité et tester des stratégies thérapeutiques. En effet, le métabolisme glucido-lipidique de la souris est adapté à la mise en évidence de phénomènes physiologiques proches de ceux que l'on peut observer chez l'Homme au cours de l’obésité. La souris fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui permet de s’appuyer sur la littérature pour justifier certaines hypothèses au lieu de faire une expérience, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ceci est valable pour le système endocannabinoïde du tissu adipeux qui fait l’objet de nombreuses études. Dès le sevrage les animaux seront soumis au régime contrôle ou hyperlipidique pour une durée de 16 à 18 semaines. Cette mise sous régime pendant la phase de croissance active de l’animale permet d’augmenter la réponse au traitement et ainsi d’en limiter la durée.
Rôle des neurones aromatase et de leurs sous populations dans les comportements socio-sexuels chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 730 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent une chirurgie du cerveau pour rendre des neurones fluorescents, l'insertion d'une micro-caméra intracérébrale, des castrations ou ovariectomies, puis des tests d'agression territoriale, de comportement sexuel et maternel, avant mise à mort par surdose d'anesthésiques. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et un stress chez les animaux servant d'intrus lors des confrontations, qu'il décrit comme bref et sans effet à long terme. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne reproduit ces comportements et retient la souris pour la sensibilité de son système olfactif.
Objectifs
Le but de ce projet est de mieux comprendre comment certains neurones du cerveau régulent les comportements socio-sexuels (comportement sexuel, agression, comportements parentaux). Nous savons que les neurones qui fabriquent l’enzyme appelée « Aromatase » qui produit l’estradiol (hormone sexuelle) sont impliqués dans différents comportements socio-sexuels. La question est de savoir comment cet ensemble de neurones régule différents comportements. L’hypothèse est qu’il existe des sous populations de neurones exprimant l’Aromatase qui seraient différentes et respectivement impliquées dans des comportements distincts. Pour caractériser ces sous populations, nous allons rendre les neurones Aromatase fluorescents et les filmer, directement dans le cerveau, pendant des comportements socio-sexuels. Nous pourrons ainsi voir quand ces neurones s’activent et si ce sont les mêmes qui s’activent, ou pas, pendant des comportements différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra donc d’identifier des sous populations de neurones Aromatase importantes pour les comportements socio-sexuels. Nombre de pathologies humaines sont caractérisées par une altération des comportements sociaux et, bien que fondamentales, les données récoltées permettront de mieux comprendre les mécanismes les régulant afin de pouvoir développer de nouvelle stratégies de traitement.
Procédures
Les mâles étudiés reçoivent une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Ils sont ensuite hébergés individuellement (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). Après un minimum d’1h de repos pour l’animal, 3 comportements sont étudiés : l’agression territoriale (face à un intrus mâle, 5 min), le comportement envers un nouveau-né (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Les femelles étudiées doivent être ovariectomisées (30 min)et supplémentées en estradiol (pose d’un implant sous cutané = 2 min, pendant la même intervention). Afin qu’elles soient sexuellement matures, 3 sessions de comportement sexuel sont réalisées, avec 1 semaine d’intervalle entre chaque session. Pour développer leur comportement maternel, elles devront cohabiter avec des mères pendant 1 semaine. Elles reçoivent ensuite une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Elles sont ensuite hébergées en groupe (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). 1 injection de progestérone est réalisée afin d’induire la réceptivité sexuelle de la femelle. 4h plus tard, 2 comportements sont étudiés : le comportement maternel (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Certains (certaines) mâles (femelles) non étudiés mais nécessaires pour l’observation des comportements des mâles étudiés, sont castrés (ovariectomisées) (30 min). Les animaux sont ensuite hébergés en groupe jusqu’au jour où les comportements seront observés (agression territoriale uniquement = 5 min d’interaction par session). Les animaux sont réutilisés pour différentes sessions de comportement, ils ne sont donc pas euthanasiés à la fin des comportements.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des rapporteurs calciques peut induire une douleur post opératoire de palier 2 pendant 2-3 jours. Les castrations et ovariectomies peuvent induire une douleur de palier 1 pendant 2-3 jours post-opératoire. Pour toutes les chirurgies, une récupération totale est attendue après une semaine. Les paradigmes comportementaux d'agression induiront nécessairement un état de stress, temporaire, chez les individus agressés. Il s'agira cependant d'un stress non chronique et d'une durée limitée (10 min maximum d'exposition au stresseur par comportement), n'induisant pas d'effet à long terme. En tout la durée cumulée d'exposition au stresseur sera de 40 min (4 comportements de 10 min avec 1 jour d'interval entre chaque).
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux expérimentaux seront euthanasiés par overdose de Ketamine/médétomidine (300/3 mg/kg). Les animaux stimuli seront euthanasiés par automate à CO2, par le personnel animalier.
Remplacement
Aucune étude comportementale ne peut être réalisée par des approches in vitro ou de modélisation : ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et ou comportementales (olfaction et comportement) qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. De plus, l'activité neuronale est dépendante de l'interconnectivité de ces neurones, elle ne peut donc être réalisée que sur un animal entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observées dans la littérature, en tenant compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, l'efficacité des injections et de la mise en place des implants. La taille des échantillons a été obtenue à l'aide d'un test de puissance calculée grâce à un logiciel spécialisé (G* Power). Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous avons également fait le choix de réutiliser les mêmes animaux pour l'étude de plusieurs comportements.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec enrichissement (abri cartonné ainsi que matériel de nidification) avec accès à de la nourriture et boisson ad libitum. Des protocoles d’administration d’analgésiques sont prévus en cas de souffrance de l’animal. Une stratégie d'analgésie est mise en place pour la prise en charge de la douleur per et post-opératoire : un AINS permettant une couverture analgésique de 24h est administré avant l’opération et poursuivi pendant 2 à 3 jours post-opératoire. Une analgésie locale est effectuée au niveau du site d’incision, en plus de l'anesthésie/analgésie générale. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux sont maintenus sur un matelas chauffant et leur température est monitorée afin d'éviter une hypothermie. Un gel ophtalmique est appliqué pour protéger les yeux du desséchement. La fréquence respiratoire est également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal reçoit une dose d’antisédan et la procédure est intérrompue.
Choix des espèces
Nous étudions le rôle de populations neuronales dans les comportements socio-sexuels à médiation olfactive. La souris est une espèce sociale, présentant de façon innée, des comportements socio-sexuels bien décrits, majoritairement régulés par des signaux olfactifs. Les souris sont un modèle expérimental de référence en physiologie de l'olfaction de par l'extrême sensibilité de leur système olfactif. De plus, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelle (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou que peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux seront tous adultes (8 semaines) au début des expériences
Traduction régionalisée en réponse à la FSH, dans les tubes séminifères
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Rats : 24
96 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux reçoivent des injections d'hormone folliculo-stimulante ou d'un antagoniste, puis sont tués par saturation en CO2 pour le prélèvement des testicules, dans une recherche décrite comme "strictement scientifique" sur la régulation de la spermatogenèse. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier l'effet de cette hormone dans un "organisme entier" en préservant les relations entre cellules de Sertoli et cellules germinales. Les bénéfices avancés relèvent de la connaissance fondamentale du dialogue cellulaire dans le testicule.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d'identifier les ARN traduits en protéine, en réponse à l'hormone folliculo-stimulante (FSH), dans les cellules de Sertoli du testicule d’animal pré-pubère et adulte. Cette identification permettra de comprendre comment ces ARN traduits localement régulent les différentes étapes de la spermatogenèse, dans le contexte histologique et physiologique du testicule adulte entier. Ces travaux sont menés à des fins strictement scientifiques. En effet, le dialogue entre cellules de Sertoli et cellules germinales est très peu connu au niveau moléculaire, ainsi que sa régulation hormonale.
Bénéfices attendus
Chez les Mammifères, ces mécanismes n’ont été étudiés principalement lors du transport dendritique d’ARNm, au cours des processus développementaux. A l’évidence, il est d’un grand intérêt d’explorer ces mécanismes dans la cellule de Sertoli, rare exemple de cellule de l’organisme en contact étroit avec un lignage cellulaire complet, dont elle doit assurer toutes les étapes de maturation, grâce aux produits de sécrétion que cette cellule élabore localement, en grande partie sous le contrôle de la FSH.
Procédures
Injection en sous-cutanée ou en intra-péritonéal sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Administration sous-cutanée et intra-péritonéale d'hormone et d'antagoniste hormonal : nos conditions expérimentales laissent présager qu’il n’y aura pas d'effet indésirable sur le bien-être des animaux.
Devenir
Dans ce projet, il est nécessaire de prélever les testicules des animaux pour les étudier ex vivo, dans les différentes conditions expérimentales. C'est pourquoi les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort avant prélévement. Le mode opératoire est la saturation progressive de l’atmosphère en CO2, dans un appareil programmé dédié et certifié.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode in vitro qui permette d’appréhender l’effet de la FSH sécrétée au niveau de l’hypophyse dans toute la complexité de son tissu cible, au sein d’un organisme entier. En particulier, il n’est pas possible d’étudier l’effet de la FSH sur la traduction locale in vitro, tout en maintenant l’intégrité des relations entre cellules de Sertoli et cellules germinales, et en intégrant l’impact des autres facteurs extracellulaires qui modulent son activité.
Réduction
Notre étude cherchera à optimiser l’utilisation de chaque animal, afin d’en réduire le nombre total. En particulier, la symétrie des testicules sera mise à profit. Par exemple, dans le cas des expériences réalisées chez la souris, l’un des testicules sera prélevé pour l’analyse du traductome, tandis que le testicule contra-latéral sera prélevé pour l’ensemble des autres expériences de validation : un hémi-testicule sera congelé à des fins d’imagerie sur testicule entier, l’autre hémi-testicule servira aux extractions d’ARN et de protéines.
Raffinement
- Raffinement : Les animaux pré-pubères sont élevés avec leur fratrie et leur mère, afin de maximiser leur bien-être. Les animaux seront observés tous les jours. Ils seront euthanasiés en cas d’atteinte d’un des points limites
Choix des espèces
Modèle souris : les souris transgéniques sont le seul modèle de mammifère permettant de suivre les processus de traduction in vivo, car le système riboTag n’existe que dans cette espèce. De plus, le modèle de souris AMH-Cre que nous avons créé il y a 20 ans a été utilisé par la communauté scientifique internationale à de multiples reprises pour conduire l’expression Sertoli-spécifique de la recombinase (160 citations de Lécureuil et al., 2002, Genesis, 33, 114). Modèle rat : l’organisation et la physiologie testiculaire sont très bien décrite dans cette espèce. Dans ce modèle, nous avons déjà acquis de nombreux résultats sur le contrôle de la traduction par la FSH, incluant des données de polysome profiling à partir de cellules de Sertoli de rats cultivées in vitro. Il est donc important d’évaluer la validité des conclusions que nous tirons de ces premiers résultats chez la même espèce. Les animaux seront étudiés à 18 et 19 jours post-partum qui est l’âge à partir duquel se met en place la barrière hémato-testiculaire, ce qui marque le début de la puberté. Ce stade permet d’étudier la traduction locale en relation avec la fonction de niche des cellules de Sertoli, c’est-à-dire le maintien et le renouvellement des cellules-souches germinales, les spermatogonies. C’est aussi à ce stade que nous avons obtenu nos premiers résultats de RNAseq après polysome profiling à partir de cellules de Sertoli cultivées in vitro, en absence de spermatogonies. Nous souhaitons donc refaire ces expériences au même stade, mais dans un contexte beaucoup plus physiologique. Nous utiliserons aussi des animaux adultes afin d’évaluer la traduction locale des ARNm en fonction du stade de spermatogenèse, qui n’est visible que chez l’adulte.
Etude de l’impact du diabète induit sur la fonction auditive chez la souris C57Bl/6JRj
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).
Bénéfices attendus
Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.
Procédures
- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).
Impact sur les animaux
Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).
Devenir
A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).
Remplacement
Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.
Raffinement
Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.
Choix des espèces
La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.
Etude de l’effet coupe-faim d’une molécule synthétisée à partir d’un extrait de Cleistocalyx operculatus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
54 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage une molécule dérivée d'une plante, sont maintenues en cage individuelle pour mesurer leur prise alimentaire, puis mises à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur afin d'examiner les réseaux nerveux de l'appétit. Le porteur reconnaît que le gavage entraîne un inconfort et que l'isolement est imposé pour la mesure. Il présente cette molécule comme un futur coupe-faim et complément alimentaire contre l'obésité, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la prise alimentaire.
Objectifs
L’obésité, qui se définie par un excès de poids en raison d'une augmentation excessif de la masse adipeuse, est connue pour augmenter la prévalence des maladies cardiovasculaires, du diabète de type 2 et de certains types de cancer. L’obésité est reconnue comme une maladie par l’organisation mondiale de la santé depuis 1997. A l’échelle mondiale, on estime à plus de 600 millions le nombre de personnes obèses et à 2,8 millions le nombre de personnes décédant chaque année de surpoids ou d’obésité. Ces chiffres ne font qu’augmenter depuis des décennies, que ce soit dans les pays développés ou dans les pays émergeants. Souvent associé à l’obésité, le diabète de type 2 ou diabète sucré est l'une des maladies dont la croissance est la plus rapide au monde. Cette pathologie métabolique se caractérise par une hyperglycémie résultant d'une anomalie de la sécrétion d'insuline, d'une résistance à l'insuline ou des deux à la fois. Depuis l'Antiquité, diverses plantes ont été utilisées à des fins médicinales dans le monde entier. Cleistocalyx operculatus est une plante largement répandue dans l’Asie du sud dont l’extrait est couramment utilisé en médecine traditionnelle. Il a été récemment montré que l’extrait de Cleistocalyx operculatus exerçait une activité anti-hyperglycémique. La 2 ', 4'-dihydroxy-6'-méthoxy-3',5'-diméthylchalcone (DMC), un composé majeur de cet extrait de plante, exerce des effets anti-tumoraux, antioxydants et anti-inflammatoires. Récemment, il a été montré que le DMC empêche le développement excessif du tissu adipeux et limite les effets toxiques de l’hyperglycémie. Synthétisé à partir de la molécule DMC naturelle, une molécule X résistante à la dégradation par le foie et donc susceptible d’avoir des effets plus marqués. Dans une première étude, nous avons déjà montré l’effet coupe faim de la molécule X (65 mg/kg de poids corporel) chez des animaux obèses. Dans ce contexte, le présent projet vise à poursuivre le travail en cours i/en étudiant l’action coupe-faim d’une molécule X d’origine végétale chez la souris obèse (ob/ob) et chez la souris non obèse (C57Bl/6), ii/ en déterminant si la molécule induit des nausées et iii/ en identifiant les réseaux neuronaux activés suite à l’administration de cette molécule. Ce travail s’inscrit dans un contexte général d’études précliniques de compléments alimentaires ciblant le traitement des troubles de la balance pondérale (diabète, obésité).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer les effets de la molécule X sur le comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront de préciser la nature des réseaux neuronaux activés par cette molécule et ainsi déterminer si elle est capable d’affecter la prise alimentaire en agissant sur l’hypothalamus et le tronc cérébral, principales structures nerveuses impliquées dans la régulation de l’appétit. La mise en évidence d’un effet anorexigène « coupe faim » de la molécule X en ferait un bon candidat comme complément alimentaire pour le traitement des troubles de la balance pondérale.
Procédures
Les animaux recevront la molécule X ou son véhicule par gavage. Le gavage est réalisé à l’aide d’une canule d’intubation de taille adaptée, délicatement introduite dans l’œsophage jusqu’à l’estomac. L'administration par gavage étant donné le volume administré ici durera une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
Le gavage entraine un inconfort chez l’animal. L'isolement des souris pendant les périodes néccésitant une mesure individuelle de la prise alimentaire est indispensable.
Devenir
Les analyses histologiques post-mortem permettront de vérifier l'histologie des tissus prélevés afin d'écarter un effet potentiellement indésirable de la molécule. Une partie de tissus prélevés constituront un banque de tissu pour de future exploration histologique et immunohistochimique.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact de la consommation de la molécule X sur l’homéostasie énergétique et la prise alimentaire.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 54 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Pour la procédure 1. Pour minimiser, le nombre d’animaux, chaque animal recevra le véhicule puis les différentes doses de la molécule X, avec une période de 72h entre chaque administration. Pour la procédure 2 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici. Pour la procédure 3 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici Pour l’effectif par lot dans les procédures 1 et 2, le nombre minimum de souris nécessaires pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives dans l’évaluation de la prise alimentaire entre les lots a été établi à 6 animaux par lot compte-tenu de la variabilité des mesures. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux par lot est de 6 et a été déterminé à partir de nos résultats obtenus au cours d’études précédentes. Ce nombre tient compte des variabilités que nous avons pu observer dans l’expression de la protéine c-Fos d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La mise à mort par perfusion intracardiaque de PFA sera réalisée sous analgésie pré-opératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la contention et au gavage. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la prise alimentaire due à la manipulation des animaux et à la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour une analyse fine de la prise alimentaire de chaque souris. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque, d’une part, c’est le modèle le plus documenté dans la littérature scientifique, et d’autre part notre projet implique l’utilisation de souris génétiquement obèses permettant d’étudier l'impact de la molécule X sur la prise alimentaire. Des souris adultes de 8 semaines entreront dans chacune des procédures. Ainsi, les souris seront accueillies en hébergement à 7 semaines. Les expérimentations devront être terminées à la fin de la 15ème semaine car le profil hyperglycémique des souris obèses ob/ob tend à diminuer au-delà de cet âge.
Évaluer le rôle des Nucléosides Diphosphates Kinases Nme1 et Nme2 dans la réponse à un stress oxydatif adipeux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Quarante souris génétiquement modifiées et vingt souris témoins sont soumises pendant six semaines à un régime dont 60 % de l'énergie vient du beurre, pesées deux fois par semaine puis mises à mort pour prélever leurs organes, afin d'étudier deux protéines du métabolisme hépatique et leur rôle dans les cellules germinales mâles. Le porteur indique une prise de poids attendue n'excédant pas 25 % sans gêne apparente. Il affirme que ces cellules germinales ne se cultivent pas, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à des souris transgéniques, et rattache le projet à la procréation médicalement assistée et à la cancérologie.
Objectifs
La réorganisation de la structure de l'ADN des spermatozoïdes implique le remplacement de presque la totalité des protéines qui le lient par d'autres protéines rendant cet ADN plus compacte dans les spermatozoïdes. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle de culture de cellules germinales afin d'étudier l'organisation de cet ADN. Il est donc très difficile d’étudier cette drnière chez la souris en l’absence du modèle murin. Nos études biochimiques ont révélé une possible régulation de la structure de l'ADN des spermatozïdes par des protéines impliquées dans le métabolisme hépatique. L'objectif de ce projet est d'appréhender les mécanismes par lesquels les protéines métaboliques d'intérrêt régulent le métabolisme des lipides à la fois dans les cellules germinales mâles et dans les hépatocytes de souris, plus particulièrement quand ces dernières seront soumises à un régime alimentaire riche en gras. En effet, des souris sauvages et des souris dont des gènes impliqués dans le métabolisme hépatique ont été inactivés seront soumises à un régime riche en gras dont 60% de l'énergie est apportée par du beurre anhydre pendant 6 semaines. Les souris seront pesées deux fois par semaine et sacrifiées à la fin de la période du régime.
Bénéfices attendus
Nos recherches auront des applications non seulement dans le domaine de la procréation médicale assistée (PMA), mais aussi, en cancérologie et en physiologie. Il a été démontré qu'un régime alimentaire sain impacte positivement les résultats de procération assisstée. Un apport en acides gras tels que les oméga 3 améliore la qualité des ovules. Inversement, il a été rapporté dans la littérature une incidence plus élevée de l'obésité en cas d'infertilité masculine et une baisse des taux de naissances chez des personnes avec un indice de masse corporel (IMC) élevé. De plus, notre protéine d'intéret est un suppresseur de tumeurs impliqué notamment dans les métastases hépatiques. Elle constitue par conséquent une cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, elle joue un rôle important dans l'homéostasie hépatique et pourrait être impliquée dans l'obésité et le diabète.
Procédures
Durant toute la durée du régime riche en gras Beurre Anhydre les animaux ne seront soumis à aucune intervention chirurgicale. Ils seront pesés 2 fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le régime riche en lipides ne devrait pas causer d'effets indésirables majeurs hormis un gain de poids. Dans une étude précédente du laboratoire réalisée sur un autre gène, et utilisant la même procédure expérimentale que celle qui fait l'objet de cette DAP, nous avons constaté que la prise de poids des souris soumises pendant six semaines à un régime riche en gras n'excédait pas 25 % et que les souris se déplacaient normalement dans les cages sans la moindre gêne.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
La spermatogenèse est un processus de différentiation très spécialisé. Bien que les propriétés fonctionnelles des nouveaux facteurs sur lesquels nous travaillons puissent être initialement abordées par des modèles de cultures cellulaires, il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions dans ces modèles. En effet, les cellules germinales mâles ne se cultivent pas (ou très peu) d'ou la nécessité d'inactiver les gènes d'intérrêt chez la souris et donc l’utilisation de souris transgéniques. Le même raisonnement s'applique aux cellules hépatiques malgré la présence de lignée du cancer de fois.
Réduction
Dans ce projet nous utiliserons 40 souris modifiées génétiquement pour deux protéines du métabolisme hépatique ainsi que 20 souris contrôles. Ce nombre est indispensable pour permettre de conclure sur l'impact du régime riche en gras sur le métabolisme hépatique et l'homéostasie des cellules germinales des souris déplétées de nos protéines d'intérêt.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 5 dans des cages à 22°C avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans toutes les cages. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Une période de 4 à 5 jours d’acclimatation sera observée avant le début des expérimentations. Les souris seront observées quotidiennement.
Choix des espèces
La souris est un modèle très pertinent pour l'étude de la spermatogenèse et de l'homéostasie métabolique hépatique chez l'animal. En effet, l'avantage d'utiliser les souris est la possibilité d'inactiver génétiquement un facteur d'intérêt. Les hypothèses que nous développons au laboratoire nécessitent l'utilisation du modèle murin pour ses raisons. Le régime riche en gras sera appliqué à des souris sauvages et des souris mutées. Dans la perspective d’induire un stress oxydatif adipeux par l’alimentation, un régime riche en gras sera appliqué à des souris adultes âgées de 2 à 3 mois pendant 6 semaines en comparaison à des souris contrôles du même âge nourries avec un régime standard. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine durant toute la durée de l'étude pour suivre l’évolution de leurs poids. Il est à noter que chez la souris la spermatogenèse est achevée 35 jours après la naissance.
Protéines bactériennes mimétiques de l’ocytocine – rôle dans la régulation du comportement social
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales et un gavage gastrique quotidien de bactéries pendant vingt-huit jours, puis passent une batterie de tests comportementaux, test des trois chambres, open field et labyrinthe en O, avant d'être tuées et disséquées. Le porteur étudie des protéines bactériennes imitant l'ocytocine et affirme que l'étude pourrait déboucher sur une stratégie contre les troubles du spectre autistique, dont il rappelle qu'aucun traitement spécifique n'existe. Il indique que seul un modèle mammifère entier permet de comprendre le rôle de ces protéines sur le comportement social.
Objectifs
L'ocytocine (OT) est une hormone peptidique produite dans le cerveau et sécrétée dans le sang. L'OT joue un rôle majeur dans la régulation du comportement motivationel, y compris la stimulation des interactions sociales, la réduction du stress et de l'agressivité, l'amélioration de l'humeur et des émotions et la réduction de l'apport alimentaire. Ainsi, l'activation de la signalisation OT est connue comme une cible pharmacologique valable pour le traitement des troubles neuropsychiatriques tels que l'autisme, la dépression, etc. Des immunoglobulines (Ig) réactives à l'ocytocine ont été détectées chez l'homme et les rongeurs, mais leur origine reste inconnue. Auparavant, nous avons découvert que les IgG réactives aux neuropeptides peuvent être stimulées par des protéines mimétiques bactériennes et que ces protéines peuvent avoir un effet direct sur la signalisation neuroendocrinienne. Dans le présent projet, nous identifierons à l'aide de la protéomique et validerons fonctionnellement à l'aide d'approches in vitro et in vivo des protéines mimétiques bactériennes de l'OT dans les micro-organismes commensaux qui peuvent être présentes dans le microbiote intestinal et peuvent être utilisées comme probiotiques potentiels pour le traitement des troubles de spectre autistique (TSA). Pour les expériences in vivo, nous utiliserons 500 souris qui recevront des protéines mimétiques bactériennes de l'OT et leur comportement locomoteur, social et anxieux sera étudié à l'aide d'une batterie de tests comportementaux classiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre des avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnel biomédicale : 1. L'étude déterminera si les protéines bactériennes et les peptides dérivés de bactéries intestinales commensales pourraient avoir des effets physiologiques sur le comportement social et l'anxiété de l'hôte. 2. L'étude contribuera à développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement des TSA chez l'homme. En effet, la prévalence des cas de TSA, présente actuellement chez 1 sujet sur 50, est en constante augmentation et, malheureusement, aucun traitement spécifique n'est disponible.
Procédures
Pas de prélèvement ni d’opérations sont prévus sur animaux vigiles. Seuls interventions seront des injections intraperitineal dans le cadre de l'immunisation ou administration en aigu de proteines et des peptides ou le gavage gastrique avec des bacteries probiotiques. - Le nombre et durée d'interventions sont les suivantes: - Immunisation par injection (IP) : instantanément, ~ 2 sec, 2 injections espacés de 2 semaines; - Injection IP : instantanément, ~ 2 sec, une seule fois avant chaque test du comportement, 3 injections totale ; - Gavage gastrique : ~ 5 sec, une fois par jour pendant 28 jours - Test du comportement social « 3 chambres », 20 min - Test du comportement anxieux « Open field » 20 min - Test du comportement anxieux « O-maze » 5 min
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas de manifestations indésirables chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. Les procédures expérimentales sont classées légères. Les traitements ne doivent pas enduire ni douleur ni inflammation ni changement du comportement qui pourrait nuire à bien-être des animaux.
Devenir
Suite aux traitements par les protéines mimétiques de l'OT et l'analyse du comportement social et anxieux des souris seront tuées et leurs tissues seront prélevés pour une analyse biochimique.
Remplacement
Au cours de ce projet, les effets fonctionnels des protéines et peptides mimétiques de l’OT seront tout d'abord évalués in vitro sur une lignée de cellules exprimant le récepteur de l’OT. Cette approche nous permettra de sélectionner les peptides ayant une activité OT-like avant l'étude in vivo. Ceci nous permettra de réduire significativement le nombre d'animaux pour la validation d’activité de protéines mimétiques d’OT.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 10 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement comparables. De plus, les procédures de tests du comportement social et anxieux, n’impliquant pas d’effet néfaste à long-terme, vont être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance. Avant le début de l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant une semaine. Afin de réduire le stress des animaux, nous allons respecter une pause de 2 jours entre les tests comportementaux. Dans notre étude, nous avons aussi choisi à utiliser les souris BTBR comme un modèle génétique de l’insuffisance du comportement sociale. Bien que la mise au point de ce modèle soit plus chère, ça permet d’éviter la souffrance des animaux dans le cas d’utilisation des modèles du déficit social induit par l’administration des toxines.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle des protéines mimétiques bactériennes de l’OT dans la régulation du comportement social et anxieux. La souris adulte represente une espece de choix pour la recherche des mecanismes moleculaires impliqués dans la régulation du comportement social et anxieux.
CREATION DE MODELES PATHOLOGIQUES CHEZ LE RONGEUR EN VUE DE MIMER DES AFFECTONS CLINIQUES.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Rats : 4000
2500 souris et 4000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, mis à mort ou cédés à des équipes scientifiques. Ils subissent une chirurgie unique pour créer des modèles de diabète, d'insuffisance hépatique, d'arthrose, d'infarctus du myocarde ou de vagotomie, avec des prélèvements sanguins et une récupération post-opératoire de 48 à 72 heures. Le porteur revendique la production et la mise à disposition de ces modèles pathologiques pour la recherche, en assumant le recours à des animaux "surnuméraires". Il affirme qu'il est "impossible de modéliser une maladie dans sa globalité" par des outils informatiques ou cellulaires.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles pathologiques sur les espèces rat et souris dans le but d’étudier les pathologies associées. Les différents modèles pathologiques sont la création par des procédures de chirurgie de modèle de diabète, d’insuffisance hépatique, d’arthrose, d’infarctus du myocarde et de vagotomie.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles pathologiques permet l’amélioration des connaissances et de la compréhension de la physiopathologie des affections cliniques associées pour la médecine humaine comme vétérinaire dans différents domaines : facteurs de risques, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention …
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique de quelques minutes à une heure sous anesthésie générale ou injection unique d’un produit sur animal vigile. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et lors de la période de récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Mise à mort ou envoi chez les scientifiques pour tous les animaux.
Remplacement
L’apparition et l’évolution d’une maladie est un phénomène complexe, faisant intervenir beaucoup de types de cellules et d’organes au sein d’un même corps. De plus, le nombre de ces types de cellules et d’organes ainsi que leur façon de communiquer entre eux ou de réagir ne sont pas semblables selon le stade de la maladie. Cette complexité et le côté dynamique d’une maladie fait qu’il est impossible de modéliser une maladie dans sa globalité par des outils informatiques ou cellulaires par exemple et demande de faire appel à des modèles pathologiques sur des espèces animales telles que le rat et la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé avant la chirurgie et lors du post-opératoire ou en cas de besoin par une administration d’analgésique. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectué dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non pouvant être disposés directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Le choix de l’âge ou du poids des animaux est défini par les scientifiques en fonction de leurs études et des poids et/ou âges minimum pour lesquels les modèles pathologiques peuvent être développés soit : Dès la naissance pour les rats concernant le modèle diabétique. A partir de 25g pour les souris et 125g chez le rat pour le modèle infarctus du myocarde et ligature du canal cholédoque. Dès 125g pour le modèle d’arthrose chez le rat. Dès 175g pour le modèle de vagotomie chez le rat.
Effet d’un inhibiteur de l’autophagie dans la prévention et traitement de la toxicité hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
**Importance du foie et du tissu adipeux dans le contrôle du métabolisme énergétique : contribution de cibles moléculaires et de signalisation dans le maintien de l’homéostasie hépatique**
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adénovirus sous anesthésie, subissent des changements de régime et des jeûnes répétés dont un jeûne intermittent de deux semaines, des injections d'insuline et une incision de la queue pour prélèvements sanguins. Cette recherche fondamentale sur le métabolisme du glucose, le diabète et la stéatose hépatique mobilise un effectif de plus de deux mille cinq cents animaux. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée.
Objectifs
Des perturbations du métabolisme du glucose pourraient jouer un rôle important dans des pathologies humaines comme le diabète de type 2. Ce projet nous conduit à nous focaliser sur deux cibles moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer les contributions de ces deux cibles moléculaires et des protéines produites dépendantes de ces cibles et pouvant signalées dans d’autres tissus, au maintien des fonctions hépatiques et de l’homéostasie glycémique et lipidique.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de l'insulinorésistance et de la stéatose hépatique. Très peu de molécules pharmacologiques sont développés pour réverser la stéatose hépatique. Nos recherches en modulant les acteurs moleculaires clefs de la voie d'utilisation du glucose
Procédures
Une partie des animaux subira une injection veineuse d'adenovirus sous anesthésie, cette injection durera par voie veineuse sera de 30 secondes maximum. Des changements de régime alimentaire seront réalisés avec des durées de 4 à 20 semaines en fonction des régimes. Nous réaliserons des tests physiologiques sur une durée de 2 heures. Pour cela après injection d'insuline ou gavage de glucose, des prélèvements de sang sur les animaux vigiles au niveau codal. Ces prélèvements se feront par une incision légère de la queue qui sera réalisée une seule fois et des prélèvements seront réalisés 7 fois pendant les 2 heures suivant cette incision. Nous réaliserons une injection d’insuline par voie intra-péritonéale. Les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures puis seront injectées d’insuline, injection qui durera 30 secondes maximum. Nous ferons une manipulation nutritionnelle sur nos souris. Pour cela, les souris seront soit mises à jeun 24h soit mises à jeun puis renourries pendant 18h ou on ajoutera à l’alimentation des souris de l’eau glucosée pendant 24h. pour les manipulations nutritionnelles, les souris subiront un jeûne intermittent pendant 2 semaines, ainsi il y aura un cycle de jeûne et d’alimentation toutes les 24h Les souris seront anesthésiées par une injection par voie intrapéritonéale en fin d’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
Pour les procédures impliquant des injections des adénovirus, l’injection par voie veineuse d’adénovirus sous anesthésie ne cause pas de douleur. Pour les procédures impliquant un changement de régime, parmi les effets indésirables, il peut y avoir une perte de poids. Pour les procédures impliquant des injections d’insuline, il peut y avoir des risques d’hypoglycémie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et le sang pour des analyses biochimiques et moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies tels que la NAFLD. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.
Réduction
Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. **Pour ce projet, nous utiliserons 2530 souris réparties sur 9 procédures. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe, La taille des effectifs ayant été établie grâce à un calcul de puissance pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.
Raffinement
** Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Pour respecter le principe des 3R, les mêmes souris seront soumises à différents tests physiologiques et métaboliques permettant de limiter le nombre de groupes expérimentaux. Pour la procédure impliquant des injections en intraveineuse, l’injection se faisant sur animal anesthésié à l’isoflurane (1-2% isoflurane dans 100% O2), cette procédure n’engendre pas de de douleur. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Pour les procédures impliquant un changement de statut de régime alimentaire, Le changement de régime pouvant induire une variation de poids, nous suivons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. Toutefois, les souris seront observées par les expérimentateurs pendant toute la durée du protocole puis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Enfin, nous surveillerons l’apparition des signes systémiques de souffrance suivant: 1) Apparence physique :0 : Normal 1 : Poils légèrement ébouriffés 2 : Poils ébouriffés, dos « vouté », yeux plissés 2) Apathie 0 : activité normale 1 : activité réduite 3 : activité nulle, apathie 3)Perte de poids 0 : Normale 1 :Perte de poids> 10% 2 :Perte de poids > 10% et 20% Pour une valeur totale égale à : 2 : l’animal sera suivi 2 fois par semaine et nous tenterons une réhydratation par injection de serum physiologique. Si le score maximal de 3 de l'un des critères est atteint ou si le score global atteint 6 l'animal sera mis à mort sur décision du porteur du projet**
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet de mieux comprendre le rôle de différents gènes dans le développement de s maladies que nous étudions et que ce sont le diabète et la stéatose hépatique. A terme cela permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes à partir de 8 semaines chez lesquelles la régulation de l'homéostasie glucidique est fonctionnelle.
COGALIM: Effet d’une modification du régime alimentaire sur le microbiote intestinal et les capacités cognitives chez un primate omnivore
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
126 microcèbes, primates, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 42 d'entre eux tués sous anesthésie pour prélever leur cerveau et 84 gardés vivants puis remis dans la population captive. Pendant cinq mois, leur régime alimentaire est modifié et ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des mesures métaboliques et des tests cognitifs. Le projet teste une hypothèse évolutive reliant alimentation, microbiote intestinal et taille du cerveau humain. Le porteur affirme que le microbiote est "difficilement reproductible in vitro" et justifie le recours à un primate omnivore.
Objectifs
Le projet COGALIM vise à valider l'hypothèse selon laquelle un changement dans la composition du régime alimentaire modifie le budget énergétique d'un primate omnivore, notamment par le biais de modifications du microbiote intestinal, et que cela pourrait entrainer un compromis énergétique affectant les fonctions cérébrales et les capacités cognitives. En effet, les primates omnivores sont contraints d’adapter leur régime alimentaire en fonction des ressources saisonnières disponibles et de leurs besoins intrinsèques. Ceci peut impacter le budget énergétique, notamment en modifiant le coût de la digestion. Cette dernière fonction est d’ailleurs au cœur d’une théorie évolutive expliquant l’augmentation de la taille du cerveau chez l’Homme, notamment par l'adaptation à un régime omnivore avec des aliments denses en énergie, peu fibreux et cuits. Des premiers travaux chez un primate omnivore ont montré que ni la taille du repas, ni sa composition n’avaient d’influence significative à très court-terme (3 jours) sur le coût de la digestion. Néanmoins, si des mesures sont toujours en cours, des analyses complémentaires sont nécessaires pour évaluer l'impact physiologique de modifications du régime alimentaire (Objectif 1) ainsi que pour évaluer la digestibilité apparente des différents régimes testés (Objectif 2) et leur impact sur la flore microbienne (Objectif 3). En plus de suivre le degré d'adaptabilité du microbiote intestinal, nous chercherons à évaluer l’impact d’une modification importante du régime alimentaire sur les processus centraux de la régulation du métabolisme et des capacités cognitives (Objectif 4).
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’évaluer la flexibilité énergétique d’un primate omnivore face aux variations de son régime alimentaire et de mieux formaliser les relations entre alimentation, métabolisme et fonction cérébrale. Les résultats de ce projet permettront également d'étayer les hypothèses sur l'origine de l'évolution de la taille du cerveau chez les homininés, et éventuellement de confirmer ou non un rôle d'une modification du mode d'alimentatation.
Procédures
Une partie des animaux (N=6) sera soumise à une modification du régime alimentaire pour 3 jours seulement; l'autre partie (N=120) sera exposée à ces différents régimes pour 5 mois et sera exposée à des prélèvements sanguins réguliers (toutes les 2 semaines), des mesures de leur taux métaboliques, de leur composition corporelle et de leurs capacités cognitives.
Impact sur les animaux
Les possibles effets indésirables attendus résident surtout dans la durée d'exposition aux différents régimes alimentaires testés, et potentiellement sur la répétition des prélèvements sanguins. Néanmoins, nous avons basé nos compositions de régimes alimentaires sur des études déjà réalisées sur le long-terme (5-6 mois), et chez des modèles primates. Le suivi des paramètres sanguins (glycémie et acides gras circulants) ainsi que des indices comportementaux au quotidien (signes de prostration, absence d’alimentation, symptômes apparents de gêne ou de douleur, agressivité, sur-léchage, etc) permettront de s'assurer du maintien du bien-être des animaux. A cet égard, le microcèbe se caractérise par une très grande flexibilité métabolique; nous faisons l'hypothèse que les changements de régime alimentaire ne devraient pas affecter sur le long-terme l'état de santé des animaux. Par ailleurs, dans le cas où la fréquence des prélèvements sanguins serait trop importante et entrainerait des troubles comportementaux, nous pourrons la diminuer à une fois par mois; néanmoins, nous précisons que les volumes et fréquences prévues sont très en deça des recommandations.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée sur une durée de 5 mois, 84 animaux seront maintenus en vie et retourneront dans la population captive et pourront éventuellement être réutilisés pour d'autres projets en fonction de la compatibilité des procédures. Les 42 autres animaux seront seront euthanasiés dans le but de réaliser des prélèvements de tissus fixés, en particulier pour évaluer par marquage immunohistochimique les effets des régimes alimentaires sur certains processus cérébraux (formation de nouvelles cellules nerveuses par exemple).
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. En effet, l'adaptation du mircobiote à un changement de régime alimentaire est un processus difficilement reproductible in vitro. Par ailleurs, l'étude de l'impact d'éventuels changements du microbiote intestinal sur les fonctions cérébrales et les capacités cognitives ne peut malheureusement pas être réalisée à l'aide de méthodes alternatives. Enfin, le recours à une espèce primate omnivore se justifie par l'objectif de tester l'hypothèse de l'effet d'une modification du régime alimentaire sur la fonction cognitive, et éventuellement de son rôle dans l'évolution de la taillle du cerveau humain.
Réduction
Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux mais assurer tout de même un pouvoir statistique suffisant pour les effets attendus (notamment compte-tenu de la variabilité interindividuelle des capacités cognitives), la majorité des mesures sera réalisée sur 10 animaux adultes par sexe et par groupe expérimental, sauf pour les groupes CTL et régimes gras (3 mâles de plus dans chaque groupe). Néanmoins, le nombre d'animaux sacrifiés en fin de projet (afin de réaliser des analyses immunohistochimiques du cerveau) a été réduit à 3 par condition expérimentale (N=42 au total), ce qui permettra tout de même de déceler des effets entre les groupes expérimentaux, notamment pour les processus comme la neurogenèse.
Raffinement
Le but de cette étude étant de caractériser l'impact du régime alimentaire sur la fonction de digestion et les capacités cognitives, une grande attention sera portée au maintien des conditions optimales pour le bien-être des animaux en essayant d’être le moins intrusif possible et donc d'oberver les animaux dans les conditons les plus physiologiquers possibles. Dans cette optique, les animaux seront maintenus en groupe (et non isolés comme il est souvent le cas dans les protocoles de suivi du régime alimentaire) et dans leurs pièces d'animalerie respectives pour réduire le stress. Les animaux bénéficieront donc d'un environnement familier et enrichi selon les pratiques habituelles de l'animalerie. L'ensemble des gestes appliqués dans le cadre de ce projet a été raffiné au cours des dernières années afin de limiter le stress et le mal-être des animaux, en étant notamment pratiquées par des opérateurs expérimentés. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bien-être des animaux utilisés. Pour cela, des indicateurs comme le poids de l’animal, la prostration, l’absence d’alimentation, des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, etc) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, etc) sont particulièrement suivis. En particulier, chez cette espèce saisonnière, les variations de poids peuvent aller jusqu’à 10% en une semaine. Une perte de poids sera considérée comme pathologique à partir du moment où ce seuil sera dépassé. Dans ce cas, en accord avec la SBEA, l'animal est retiré de l'expérience et on s'assure qu'il récupère correctement (reprise de poids); si tel n'est pas le cas, on procède à l'euthanasie après concertation avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Outre sa proximité phylogénétique avec l’Homme, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans la gestion énergétique et les capacités cognitives. En effet, cette espèce est capable d'ajuster son métabolisme en fonction de la disponibilité alimentaire, comme c'est le cas dans son milieu naturel (variation en qualité et quantiité du régime alimentaire au cours de l'année). Par ailleurs, de nombreux dispositifs expérimentaux (comparables à ceux utilisés chez les rongeurs) ont été adaptés à cette espèce afin d'en évaluer les capacités cognitifives. Cette espèce étant un primate omnivore, les résultats de ce projet pourraient donc permettre d'améliorer notre compréhension des processus qui pourraient expliquer le rôle de la digestion dans l'expansion de la taille du cerveau au cours de l'évolution humaine.