Système endocrinien

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras pendant vingt-quatre semaines pour induire une obésité et une résistance à l'insuline, avec des injections répétées et des incisions de la queue pour prélever le sang, afin d'étudier le rôle de certains lipides dans la graisse brune. Le porteur relie ce travail au développement de thérapies nutritionnelles contre l'obésité humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"organisme entier" pour ces questions faisant intervenir plusieurs organes.

Objectifs

L’obésité (accumulation de masse grasse blanche appelée tissu adipeux blanc) est un problème de santé publique dû à un apport calorique trop important, à une sédentarité mais aussi à un déséquilibre dans les lipides ingérés, avec une consommation trop importante en lipides ω6 (huile de tournesol) par rapport aux lipides ω3 (huiles de poisson, colza). Selon les recommandations, un ratio adéquat de lipides ω6/ω3 inférieur à 5 devrait être trouvé dans l’alimentation or actuellement en France ce ratio dépasse 12 en moyenne. L’obésité induit une inflammation chronique responsable du développement de pathologies dites métaboliques comme le diabète de type 2. Une autre masse grasse existe en petite quantité chez l’homme, le tissu adipeux brun qui permet une dissipation de l’énergie ingérée sous forme de chaleur et limite ainsi l’accumulation de tissu adipeux blanc. Il a été montré que cette masse grasse brune est déficiente chez les personnes obèses. Enfin il a aussi été décrit que dans certaines conditions comme l’exposition au froid, du tissu adipeux brun pouvant apparaitre au sein de la masse grasse blanche et ce phénomène est appelé brunissement. À ce jour, il n'existe aucun traitement efficace de l'obésité et une perspective serait de développer des stratégies médicamenteuses ou nutritionnelles favorisant la formation du tissu adipeux brun ou favorisant le brunissement du tissu adipeux blanc. Nous avons montré en culture qu’un lipide dérivé des acides gras ω6 empêchait le brunissement des adipocytes blancs. Des études, montrent qu’une alimentation riche en lipides ω3 contrôle les niveaux de ce lipide et ont des effets bénéfiques sur la santé. Il est ainsi possible d’envisager que ces effets bénéfiques puissent passer par une réactivation de la masse grasse brune du fait d’une diminution de ce lipide. Nous envisageons donc de soumettre des souris à une alimentation grasse avec un fort ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines afin d’induire une obésité. Après 12 semaines, les animaux passeront à des régimes avec de faibles ou de forts ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines supplémentaires. Nous vérifierons si ce changement alimentaire améliore l’obésité des animaux et l’inflammation associée et si ces effets sont sous-tendus par une augmentation de la masse grasse brune ou du brunissement de la masse grasse blanche. En parallèle nous doserons dans le sang et les tissus la quantité du lipide dérivé des ω6.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que ce travail nous permette de comprendre l’impact des lipides ω6 et ω3 dans le développement de la graisse brune et du brunissement de la graisse blanche, ouvrant la voie au développement de thérapies nutritionnelles pour lutter contre le surpoids/obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux recevront différents régimes pendant 24 semaines. Ils seront placés dans une armoire thermostatée à 30°C pour leur confort thermique. Lors des tests métaboliques aux semaines 12, 22 et 23, les animaux recevront des injections intrapéritonéales et auront des prélèvements (sur animaux vigiles) d'une goutte de sang à la queue. Concrètement, suite à une injection (durée max 5 secondes) de glucose (S12 et S22) ou d'insuline (S23), une légère incision (durée 1 à 2 secondes, une incision unique pour tout le test) est réalisée à la queue et une goutte de sang (5µL, il faut environ 3 à 5 secondes pour que la goutte de sang se forme à la queue par massage de celle-ci) sera prélevée à 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes pour doser la glycémie. Au cours de la dernière semaine (S24), les souris recevront une injection intrapéritonéale quotidienne (durée d'une injection max 5 secondes; 7 injections au total) d’un activateur adrénergique ou d'une solution saline. 10 minutes après la première injection, une goutte de sang sera pélevée (incision 1 à 2 secondes ; formation de la goutte 3 à 5 secondes) à la queue pour un dosage du glycérol, représentatif de l’activité lipolytique des tissus adipeux. Au total un même animal pourra recevoir au maximum 10 injections sur une période de 24 semaines et 195 µL de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Dans le programme présenté les nuisances prédictibles pour l’animal sont liées 1) au régime riche en graisse qui induira l’obésité et l'insulinorésistance ; 2) aux douleurs provoquées par les injections intrapéritonéales qui sont nécessaires à différents stades de l’expérimentation pour réaliser les tests métaboliques et 3) aux prélèvements sanguins à la queue pendant ces mêmes tests métaboliques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Après 24 semaines de régime alimentaire, les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale), une analyse de la composition corporelle sera réalisée par tomographie (rayons X) et le sang sera prélevé. Les animaux seront ensuite mis à mort et le prélèvement d’un maximum de tissus/organes à la fin de la procédure sera réalisé. Les tissus seront pesés, une partie sera congelée pour les analyses ultérieures (ARN... ) et l’autre partie fixée pour des analyses histologiques. Notre programme vise à étudier l'impact de différents régimes alimentaires (ratio ω3/ω6), sur la fonction des tissus adipeux et sur le métabolisme insulino-glucidique qui implique de nombreux organes (tissus adipeux, foie, muscles, ...), ce qui nous contraint à mettre à mort les animaux afin d'accéder à ces organes.

Remplacement

Ce programme vise à découvrir les liens qui existent entre composition alimentaire en lipides (ratio ω3/ω6), fonction des tissus adipeux blancs, bruns et brites et l’insulino-résistance ou le diabète de type 2. Ces processus pathologiques complexes touchent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et impliquent de nombreux organes dont le pancréas, le foie, les tissus adipeux et les muscles. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici. De plus ces expériences font suite à de nombreuses expériences menées in vitro sur des cellules en culture qui ont permis de cibler les hypothèses les plus pertinentes à poser in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre minimum d’animaux. Nous débuterons par des groupes de 8 souris mâles (72 souris au total) puis nous réitérerons l’expérience par des groupes de 8 souris femelles (72 souris au total) et 4 souris par cage. Le nombre total de souris (cf. ci-dessus) nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre de souris nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées en comparant les groupes deux par deux (régime alimentaire versus régime contrôle, ou encore régime alimentaire versus traitement mimant l’exposition au froid). Si aux termes de la première expérience avec les souris mâles nous n’avons aucun résultat concluant, nous ré-évaluerons l’intérêt de réaliser l’expérience avec les souris femelles.

Raffinement

Les souris utilisées sont des souris contrôles. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : maintien à la thermoneutralité donc à leur température de confort (30°C) ; enrichissement de l’environnement; surveillance régulière; suivi selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés (absence de toilettage, perte de poids) ; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous envisageons d'utiliser des souris C57Bl6J. Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus la souche C57Bl6J est connu pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 24 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 34 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes.

40 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime obésogène induisant une obésité, à des gavages de glucose, à des prélèvements sanguins répétés et à un isolement, pour étudier le rôle d'un récepteur lingual dans la préférence pour le gras. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la mise à disposition d'une nouvelle souche de souris. Le porteur indique avoir déjà testé les molécules sur des lignées cellulaires, sans effet toxique, avant de recourir aux souris.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récépteur aux acides gras, dont l'un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Le but de cette étude est de démontrer l’implication in vivo, du CD36 situé au niveau de la langue dans l’action de nos molécules « faux lipides ». Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute), une mesure en echoMRI toutes les deux semaines (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 minutes). A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort. Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les mesures de dépenses énergétiques nécessiteront également une individualisation pendant 5J dans les cages de mesures. Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent subir un stress, lors des prélèvements répétés ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix). Les animaux disposeront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage de vie afin de minimiser le stress induit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements d’organes.

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux pour cette étude. De plus, nous avons déjà étudié les mécanismes sur des lignées cellulaires in vitro, et ces tests n’ont montré aucun effet toxique, tératogénique ni mutagénique jusqu’à la concentration de 100µM.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. Lors de prélèvements, comme la glycémie ou le prélèvement de sang, les souris seront sous anesthésie locale à la lidocaïne afin de minimiser la douleur. Enfin, les animaux étant observés quotidiennement, si un signe clinique fait apparaître un mal-être ou une douleur, ils seront euthanasiés par asphyxie au CO2.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

Pour tester cinq variantes d'un composé censé faire régénérer les cellules bêta du pancréas, qui produisent l'insuline, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner leurs organes. Chaque souris reçoit des injections de protéines, quotidiennes ou hebdomadaires, subit une prise de sang par semaine, puis, en fin d'expérience, un jeûne de cinq heures suivi d'une injection qui élève sa glycémie et de six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Une partie d'entre elles développe un diabète que le porteur dit "modéré", n'entraînant pas de "souffrance particulière", et le résumé ne nomme ni la lignée ni la façon dont ce diabète apparaît. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude du diabète "sur l'animal intact est essentielle et ne peut être remplacée", et revendique une "application stricte de la règle des 3R".

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l'age, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations dans les niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules beta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 600 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques.

Procédures

Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines. Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).

Tuées à l'issue de chaque procédure pour récupérer leurs organes, 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont nourries 16 semaines d'un régime riche en graisses pour les faire grossir, soumises 16 semaines à un exercice d'endurance sur tapis de course, et subissent des prises de sang éveillées, jusqu'à sept en deux heures lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Les effets néfastes se limitent, selon le porteur, à un risque d'irritation et d'infection aux points d'injection. Pour justifier le choix de la souris, le porteur cite sa "natalité importante", son "faible coût d'élevage" et la possibilité d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée."

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 16 semaines. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dix-sept semaines avec un régime obésogène, elles reçoivent un gavage quotidien pendant cinq semaines, des prélèvements de sang et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer des métabolites du lycopène de la tomate contre l'obésité. Le porteur mentionne un stress lié à l'isolement pendant les tests et une douleur possible aux incisions de la queue et au perçage des oreilles. Il renvoie les retombées à un programme plus large visant "in fine" à améliorer les désordres métaboliques, et retient la souris comme modèle "reconnu" du métabolisme.

Objectifs

La consommation de lycopène, un caorténoïde de couleur rouge et présent en grande quantité dans la tomate, est classiquement associée à des effets bénéfiques sur la santé cardiométabolique. Cependant, les métabolites actifs du lycopène étaient inconnus jusqu’alors. Nous avons pour la première fois identifié plusieurs métabolites du lycopène qui montrent des effets positifs in vitro. Notre objectif est maintenant de montrer que les effets de ces dérivés du lycopène permettent de limiter le développement de la masse grasse et de l’insulino-résistance dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre l'impact métabolique du lycopène en identifiant ses métabolites actifs. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les désordres métaboliques associés à l'obésité par le biais d'approches nutritionnelles utilisant des métabolites actifs de molécules naturelles.

Procédures

Les animaux seront nourris durant 17 semaines avec une régime obésogène. De la 12ème à la 17ème semaine, un gavage sera réalisé quotidiennement, afin de controler parfaitement la dose de molécules administrée. Un prélèvement de sang sera réalisé en semaine 12, une mesure de prise alimentaire sera réalisée en semaine 12 et 16. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en semaine 15 et 16.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de l'ITT, de l'OGTT (durée estimée à 3 heures au maximum pour chaque procédure). Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des métabolites du lycopène ou des doses de glucose (OGTT) et d'insuline (ITT).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques des métabolites du lycopène.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en métabolites du lycopène sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un diabète de type 2, puis à des injections intrapéritonéales répétées de glucose et d'insuline et à des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit une douleur légère possible liée au modèle et annonce une mise à mort finale pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour démontrer in vivo l'implication d'une protéine avant d'en faire une cible thérapeutique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique que consiste à un excès de masse grasse et à une modification du tissu adipeux. Elle est due à différents facteurs, tel que l’alimentation, la prédisposition génétique et aussi à facteurs environnementaux. Une des consequences métaboliques majeures de l’obesité est le développement du diabète de type 2. Afin de pouvoir traiter le diabète, une meilleure compréhension du dialogue entre les cellules est nécessaire. L’implication du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète de type 2 n’est pas connue, ainsi, nous souhaitons ici comprendre l’interaction du système immunitaire avec le pancréas dans l’installation et le maintien de la pathologie. Nous avons mis en évidence la présence de la cytokine IL34 chez l’homme et la souris au niveau des îlots pancréatiques. Son expression se trouve augmentée dans des pancréas issus de patients atteints de diabète de type 2. Suite à ces observations, nous avons créé une lignée de souris déficientes en IL34 au niveau du pancréas. Le modèle a été mis en place par croisement entre une lignée IL34LoxP et PdxCre. Ainsi, nous cherchons à comprendre l’impact de l’inhibition de la cytokine au niveau du pancréas dans des conditions physiologiques et pathologiques de diabète de type 2 en comparant les souris IL34 KO avec les souris IL34 contrôles issues du croisement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier la cytokine d’intérêt comme un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète de type 2. Il aiderait également à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans la pathologie au niveau du pancréas et plus particulièrement des îlots de Langerhans.

Procédures

Le test de tolerance au glucose et à l'insuline (GTT et ITT) nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris, 1ip de glucose et 1ip d’insuline 1 fois par mois, durée environ 3 seconds). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Pour chaque prélèvement, les animaux sont anesthésiés localement au niveau de la queue (lidocaïne, sous forme de pommade). Ces tests seront effectués au début du protocole, après 1, 2, 3 et 4 mois de regime.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une régime alimentaire riche en graisse et sucre afin d’induire le diabète de type 2 lié à l’obésité. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La réaction attendue dans le modèle de diabète peut être de douleur légère. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux seront aussi nécessaires. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Le prélèvement sanguin à niveau de la veine caudale, sous anesthésie locale, permet de récupérer des quantités minimes de sang pour l’évaluation répétée des paramètres circulants, sans traumatisme et sans douleur. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer cette protéine comme cible thérapeutique, nous devons démontrer son implication in vivo. En effet, seule la suppression de celle-ci dans un modèle in vivo nous assure de son implication dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (120 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience (mise à mort de l’animal). Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques seront donnés. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de diabete de type 2 chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J et les souris KO pour IL34 au niveau du pancréas sont de fond génétique C57BL/6J. Des souris de 4 semaines environ seront utilisées. A cet âge les animaux peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

Des souris reçoivent un ADN censé faire produire en continu par leurs cellules musculaires la kisspeptine, un peptide qui stimule les hormones de la reproduction, afin de mettre au point un "outil permettant de maitriser la reproduction". 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent trois poses chirurgicales de mini-pompes à 28 jours d'intervalle ou une injection hydrodynamique dans la veine saphène, des prises de sang répétées, des frottis vaginaux, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, un open field, une chambre claire-obscure et un test de reconnaissance d'objet. Certaines subissent seize prises de sang en moins de onze heures après une injection de GnRH, et la mise à mort se fait sous anesthésie, par décapitation ou par perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur. Le porteur présente ces études comme un "chainon essentiel" avant des expérimentations sur des "espèces de rente telles que les ovins".

Objectifs

La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.

Procédures

Procédure n°1 : 1) Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. Au final, ce sera donc 3 pose de mini pompes à ,28 jours d'intervalle sur 630 animaux. 2) Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang d'environ 1ul, réalisés 10 et 20 minutes avant une injection de glucose ou d'insuline et 15, 30, 60, 120 minutes après. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. 3) Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. 4) Tests de comportements sur 80 animaux : open field, chambre claire obscure, test de reconnaissance d'objet, réalisés sur une période de 5 jours tout les 28 jours. 5) Prises de 10ul de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. 6) Injection de GnRH et prélèvements de 4ul de sang de facçon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. Seiez prélèvements seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection de GnRH puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements de 4ul de sang. 7) Sacrifice après anesthésie, par décpaitation ou perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. Procédure n°2 et 3 : 1) Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). 2) Prises de 4 ul de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. 3) Mise à mort après anesthésie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes (procédure 1) ou l'injection hydrodynamique (procédure 2) : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem.

Remplacement

Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (posture voutée, démarche anormale) et l'apparence (pelage négligé, réduction du toilettage, grattage excessif, eczéma) des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques (kétamine, xylazine) et analgésiques (atipamézole, meloxicam) seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)