Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Prévention et inversion de l’hépatite ischémique par intervention pharmacologique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux heures induisant une ischémie-reperfusion du foie, puis plusieurs injections, pour tester une molécule contre les lésions hépatiques après chirurgie ou transplantation. Le porteur qualifie de modérées les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire et affirme que l'animal vit normalement. Il conclut qu'il est impossible de reproduire in vitro la complexité de l'ischémie-reperfusion hépatique.
Objectifs
L’hépatite ischémique est une lésion du foie induite par un apport insuffisant de sang ou d’oxygène, induisant la mort des cellules hépatiques. Il a été démontré que la neutralisation d’une protéine libérée par les cellules et les organes et qui est impliquée dans un réflexe primitif de la faim induisait l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter l’hépatite ischémique chez des modèles murins appropriés.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l'ischémie-reperfusion hépatique, qui survient après une chirurgie ou une transplantation du foie et qui influence considérablement le pronostic de la fonction hépatique.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique (durée environ 2h/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Les animaux recevront 2, 4, 6 ou 8 injections sous-cutanées (animal vigile). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, les animaux recevront 2, 4, ou 5 injections (animaux vigiles). La durée des injections sous-cutanées et intra-péritonéales est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire seront modérées car les procédures n’excéderont pas 72h. L’animal vit normalement (ses mouvements et sa respiration ne sont pas impactées). Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées (animal vigile) ne provoquent pas de symptômes majeurs autre que la douleur de piqure de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l'ischémie-reperfusion hépatique vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Etude du rôle des vésicules extracellulaires dans les complications cardiovasculaires associées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit un régime gras pendant seize semaines pour induire obésité et diabète, avec échographies, seize mesures de pression artérielle, prélèvements sanguins et douze injections de vésicules, avant que toutes soient tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que le régime provoque prise de poids, diabète de type 2 et mobilité réduite chez 240 souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun moyen ne peut remplacer une étude portant sur l'organisme entier.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un travail expérimental plus global ayant débuté́ en 2008 par l’étude du rôle des vésicules libérées par les cellules dans le développement du syndrome métabolique. Même si les résultats acquis montrent un rôle prépondérant des vésicules dans cette pathologie, les mécanismes par lesquels ces vésicules peuvent favoriser la formation de la plaque d’athérome et le développement de complications cardiovasculaires lors de l’obésité ne sont pas complétement connus. Cette expérimentation animale sur le modèle de souris knock-out pour plusieurs protéines jouant un rôle dans l’inflammation et le diabète nous permettra de valider les effets délétères des vésicules et d’obtenir des données en vue d’utiliser les vésicules comme des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que d’être proposées comme nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Démontrer l'implication des vésicules extracellulaires portant des protéines jouant un rôle dans le processus inflammatoire et dans le développement de la plaque d'athérome liée à l'obésité et au diabète. En plus, ces protéines transportées par les vésicules extracellulaires se sont avérés être des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques possibles pour le traitement
Procédures
Cinq interventions : - Régime riche en graisse : 16 semaines - Echographie : 3 mesures (début de protocole, mi-parcours, fin de protocole) - Mesure pression artérielle : 16 mesures, 1 fois par semaine pendant 16 semaines - Prélèvement de sang sur animaux vigiles : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime - Injection de vésicules : 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 4 semaines du protocole)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2 ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de sang à la base de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 240 souris sur 480, qui seront nourris avec le régime riche en graisse durant 16 semaines. L’effet 4 concernera l’ensemble des souris.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.
Remplacement
Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et que seule l’expérimentation animale permet un suivi complet de la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, des mâles et des femelles seront utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon complémentaire et hebdomadaire en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses). Comme le régime riche en graisse peut induire un diabète de type 2, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de détecter toutes pathologies liées au diabète. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores et la définition de points limites de Morton et Griffiths. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. En effet, les animaux sont issus d’un élevage, et il peut avoir un seul mâle par portée, rendant impossible de mettre des mâles de différentes portées ensemble afin d’éviter des conflits entre eux qui peuvent s’accompagner de blessures. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes en cartons pour se cacher et faire des nids. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. L'absence de ces protéines protège contre la réponse inflammatoire et le diabète, donc les phénotypes ne sont pas dommageables. L'absence d'une troisème protéine induit une prédisposition au développement de la plaque d’athérome, le modèle est le plus utilisé pour étudier l’athérosclérose. Les souris db/db présentent une mutation spontanée du récepteur à la leptine (modèle utiliser pour étudier le diabète et l'obésité). Avec un régime de 16 semaines la plaque est dans son état précoce.
Choix des espèces
Ce projet vise à analyser l'implication des protéines inflmmatoires dans le processus de développement de l'athérosclérose liée à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement l’implication des vésicules extracellulaires portant ces protéines dans le processus inflammatoire qui précède le développement de la plaque d'athérome. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.
Exsanguination par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
104 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur décrit un prélèvement de 150 microlitres de sang à la queue sous anesthésie, sur des souris porteuses du génotype Apc qu'il qualifie de dommageable, avec une surmortalité et une demi-vie de 23 semaines, suivies jusqu'à 15 semaines pour étudier la fonte musculaire liée au cancer. Il indique que la mise à mort passe par une exsanguination lors d'une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde, aucun animal n'étant maintenu en vie. Sur le remplacement, il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité multi-tissulaire du phénomène et que seul un modèle murin le permet.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez la souris Apc, un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en evidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoides dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez les souris Apc.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associe au cancer.
Procédures
Un prélèvement sanguin (150 µl) au niveau de l'extrémité de la queue sera réalisé sous anesthésie (kétamine 100 mg/kg + xylazine 10 mg/kg).
Impact sur les animaux
Il s'agit d'une étude non interventionnelle de suivi du développement naturel des animaux jusqu'à l'âge de 15 semaines. Toutefois, la gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Concernant les souris contrôles, aucune nuisance ou effet indésirable n'est donc attendu à l'exception du prélèvement rétro-orbital sous anesthésie gazeuse la veille de l’expérimentation. Concernant les souris Apc, il s'agit d'un génotype dommageable qui entraine une surmortalité des animaux avec une demi-vie de 23 semaines (le suivi et l'entretien de la lignée Apc est décrit dans la Procédure 1). D'une façon générale et afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons également particulièrement vigilants à tout signe évocateur de souffrance animale (se reporter à 4.2 pour une description des critères d'évaluation de souffrance animale et d'atteinte des points limites). Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Devenir
S'agissant d'une procédure classe sans réveil, aucun animal ne sera maintenu en vie au terme de la procédure.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, surface de section transversale ds fibres musculaires, à l'aide de l'outil https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority. Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour les souris Apc, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe pour les souris Apc. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives par l’utilisation de tests ANOVA 2 facteurs (time x genotype) pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Le déconditionnement musculaire associé au cancer met en jeu un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu. Des analyses immunohistologiques seront réalisées et ne peuvent donc être menés à bien qu’en ayant recours à l’expérimentation in vivo chez la souris. Par ailleurs, la littérature, ainsi que notre expertise dans ce domaine scientifique et technique, nous permettront de réaliser chez la souris ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope chez des souris mâles et femelles lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l'age de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris Apc seront utilisées comme animaux contrôles. Un dimorphisme sexuel pouvant être à l'origine d'une meilleure résistance à la cachexie des souris femelles, des souris mâles et femelles seront utilisées.
Identification de la fonction de la protéine SELENON dans la régulation glycémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 192 opérées du pancréas sous anesthésie et tuées avant tout réveil et 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement invalidées pour le gène SELENON, une partie reçoit une alimentation enrichie pendant six semaines pour induire un syndrome métabolique, avec mesures répétées de la glycémie et prises de sang, pour étudier le rôle de cette protéine dans la régulation du sucre. Le porteur indique que les souris peuvent développer un diabète avec perte de poids supérieure à 20 %, polyurie et hypo ou hyperglycémies, une insulinothérapie devant limiter ces atteintes. Il affirme qu'aucun autre modèle n'existe et qu'il est "impératif" d'étudier la protéine dans un organisme complet où tous les acteurs de la glycémie sont présents.
Objectifs
Le projet de recherche porte sur l’identification de la fonction de la protéine à sélénium SELENON, dans les mécanismes de la régulation glycémique en conditions physiologique et physiopathologique. La mutation de SELENON est responsable de dystrophies musculaires chez l’homme. Néanmoins, la fonction de SELENON et les mécanismes impliqués dans ces dystrophies musculaires restent inconnus et aucun traitement n’est actuellement proposé. Curieusement, l'expression de SELENON n'est pas limitée au tissu musculaire. En effet, plusieurs données de la littérature décrivent la présence du gène SELENON dans le pancréas. Le pancréas est un acteur central de la régulation de la glycémie. Par ailleurs, il a été démontré l’importance du dialogue muscle-pancréas dans le contrôle de ce système de régulation de la glycémie. De plus, dans certaines études réalisées sur une cohorte de patients atteints de myopathie liée à SELENON, il a été démontré que des index de masse corporel faibles sont associés à des niveaux d'insuline à jeun et post-prandial élevés, suggérant un risque élevé de résistance à l'insuline. L'objectif du projet est d'étudier le rôle de SELENON dans le pancréas dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, sa fonction dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie.
Bénéfices attendus
Les différentes analyses qui seront réalisée lors des études in vitro et in vivo de ce projet, nous permettront d’identifier les facteurs contrôlant l'expression de SELENON et fourniront des informations précieuses sur le contexte de son activité. Elles nous aideront également à évaluer la contribution d’un dysfonctionnement pancréatique au développement de la maladie musculaire. Enfin, les découvertes qui seront obtenus lors de ce projet nous permettrons d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du diabète mais également des maladies musculaires.
Procédures
Procédure1 : Pour le prélèvement du pancréas, une incision de l’abdomen et la mise en place d’un tube très fin en plastique dans le pancréas seront réalisés sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). Procédure2 : Les souris seront soumises soit à de l’alimentation standard appelée normal diet soit à une alimentation enrichie, appelé High Fat Diet pendant 6 semaine afin d’induire un syndrôme métabolique (durée classiquement décrite dans la littérature). Quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosages. Une fois par mois la fonction réelle du pancréas sera évaluée. Le test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie (0,6 µL de sang par mesure) toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL (incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose et 200 µL en postprandial. L’injection de glucose est réalisée sur animal vigile soumis à une contention manuelle. En fin d’étude, les animaux seront mis à mort et les organes prélevé (pancréas, muscles…) pour réalisation d’études histologique, protéomique et génomique.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, il pourrait être envisagé le dévelopement d'un phénotype diabétique chez les souris KO. Ainsi, une dégradation de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. etc... Néanmoins, l’insulino-thérapie qui sera mise en place pour traiter l'hyperglycémie devrait empêcher ces nuisances.
Devenir
L'objectif du projet est d'aborder l'expression de SELENON dans les tissus pancréatiques dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, son activité dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie. Ainsi, les devenir des animaux après chaque procédure se justifie par : - Procédure 1 : Cette procédure permet d’obtenir des îlots pancréatiques, source de cellules indispensable pour les études menées sur le diabète (mécanismes moléculaires de l'insulino-sécrétion physiologique et physiopathologique...). - Procédure 2 : L’euthanasie des animaux nous permettra de réaliser des études histologiques, de protéomique et de génomique sur les différents organes impliqués dans la régulation de la glycémie et sur les organes impactés par le diabète. Ceci nous apportera de cruciales informations sur le rôle de SELENON dans le développement du diabète afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutique de cette maladie. Enfin, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement.
Remplacement
En dehors de notre lignée de souris transgénique, il n’existe pas d’autre modèle permettant d’étudier le rôle du gène SELENON dans la fonction musculaire et la régulation glycémique. Des études menées in vitro sur des cultures cellulaires de muscle nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires et voies cellulaires auxquels participe SELENON. Toutefois, ces études ne permettent pas de comprendre l’importance physiologique de ces processus dans la formation et la maintenance du tissu musculaire. Par ailleurs, un îlot pancréatique est un ensemble complexe composé de différents types cellulaires interconnectés les uns avec les autres pour réguler de façon adapté la fonction régulatrice de la glycémie par la sécrétion de différentes hormones telles que l’insuline, le glucagon etc… Les lignées cellulaires n’ont pas réussi à l’heure actuelle de reproduire efficacement ce fonctionnement. Ainsi, la culture primaire d’îlots pancréatiques est indispensable pour une telle étude in vitro. Enfin, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’évaluer le rôle de SELENON dans un environnement physiologique et physiopathologique, il est également impératif de l’étudier dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés.
Raffinement
Les cages ventillées des souris seront enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges et de carrés de nidification. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et de prise en charge des animaux tout au long de leur séjour dans notre animalerie. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle. De plus, concernant l’isolement d’îlots pancréatiques, la cathétérisation du canal cholédoque à ce stade de développement est bien maîtrisée au laboratoire et permet une bonne reproductibilité des rendements en îlots pancréatiques. Enfin, pour ce projet, les mâles et les femelles seront utilisés car nous souhaitons caractériser le rôle de SELENON dans la régulation glycémique quel que soit le sexe.
Etude de l activité motrice de souris deficiente pour l’activité mitochondriale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis roulant motorisé dix minutes par jour pendant quatre jours, et une partie reçoit une injection de fixateur sous anesthésie, pour mesurer l'effet d'une protéine sur l'activité motrice et le fonctionnement des mitochondries. Le porteur indique que le tapis peut provoquer un léger stress et de la fatigue. Il conduit une partie du projet sur des cellules in vitro et réserve l'animal aux tests d'effort et aux analyses de tissus.
Objectifs
Dans le cadre de notre projet nous nous intéressons à une famille de protéine, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, nous avons montré que des homologues de cette protéine possèdent la même fonction dans la régulation du métabolisme énergétique et nous avons donc mis en évidence un mécanisme original pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique, nous voulons étudier le rôle d’un des membres de cette famille de protéines selon 3 axes : 1-Tester l’impact de la protéine sur l’activité motrice de la souris puisque les attentes énergétiques engendrent des déficits musculaires et une intolérance à l’effort. Pour cela, nous souhaitons mesurer la vitesse roulant motorisé et l’endurance des souris à l’aide d’un tapis de course. La vitesse du tapis sera progressivement augmentée et l’activité locomotrice de l’animal sera monitorée grâce à une caméra hautes fréquences. 2-Nous voulons mesurer l’atteinte énergétiques au niveau des tissus par des tests biochimiques. 3- nous voulons voir les défauts d’organisation et de morphologie des usines énergétiques des tissus, les mitochondries) par des analyses histologiques.
Bénéfices attendus
La mitochondrie sont les usines de production d’énergie dans les tissues et elles sont donc nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Des déficits mitochondriaux induisent des pathologies sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, il est nécessaire de comprendre quelles sont les causes cellulaires de ces pathologies. Notre projet se place dans ce cadre. Nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une famille de protéines dans la production énergétique. La protéine que nous étudions dans ce projet fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille et cela permettra de développer des traitements pour ces pathologies à plus long terme.
Procédures
Concernant, les tests d'effort, les animaux seront placés sur un tapis roulant motorisé pour une durée maximale de 10 minutes pendant 4 jours consecutifs. De plus, 40 animaux seront soumis a une injection unique de fixateur de tissus. Ces injections se feront sur des animaux anesthésiés. Au total, cette intervention dure 15 minutes au total.
Impact sur les animaux
Le versant comportemental de notre étude est basé sur une analyse de la marche sur tapis roulant. Ce test peut engendré un stress leger chez l'animal du à la découverte de l appareillage. Ces tests de efforts pouvent engendrés de la fatigue physique. Pour ce qui est de la perfusion intracardiaque, la procédure réalisée sur animal anesthésié suit les normes et pratiques en vigueur.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses biochimiques et histologiques sur les tissus en postmortem.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests d'effort locomoteur (sur tapis roulant) et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et des voies de signalisation sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro au niveau de l’organisme. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les tests biochimiques (20 animaux) et histologiques (40 animaux) seront effectués à partir des tissus collectés sur les animaux évalués sur tapis roulant (60 animaux). Cette approche combinée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation du projet.
Raffinement
Nos souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les animaux sont hébergés en cages collectives dans les conditions les mieux adaptées au modèle murin. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique permettant la création de nids (important pour les femelles gestantes et allaitantes) des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Dans le ,cadre spécifique de la procédure du projet, nous avons inclus une étape préalable d’habituation aux appareillages afin de limiter le stress et l'anxiété des animaux. Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant, et appliquons systématiquement un traitement analgésique et des mesures de soins lorsque nécessaire. L’ensemble des procédures est encadré et mis en oeuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des animaux adultes âgés de 10 à 14 semaines. A cette période, les souris sont adultes et présentent la capacité d’activité élevée. Ainsi, il est plus facile d’observer des différences entre les phénotypes, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou du composé X dans la cicatrisation chez la souris C57BL/6
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux cent quarante subissent une chirurgie créant deux plaies sur le dos, jusqu'au muscle, pour tester si un régime cétogène ou un composé favorise la cicatrisation. Le porteur écrit que l'étude vise à apporter la preuve exigée pour déposer un brevet. Il indique traiter la douleur par de la buprénorphine et affirme que seul un modèle in vivo garantit des conditions proches de la clinique.
Objectifs
Le composé X est produit naturallemnt par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Le composé X a montré sur les cellules immunitaires des propriétés benefiques lors de leurs infiltration des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire ou l’application topique de ce composé X lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire (brûlures, plaies…) peut être bénéfique au patient. Ce composé peut être délivré par injection ou en application topique. Ce projet a été évalué par cellule de valorisation de brevets et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce régime chez la souris est demandée.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales qui permettront de caractériser les cellules de l'immunité, les macrophages , les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. A titre d’exemple, nous pouvons citer les lésions post-ischémiques ou la cicatrisation de grandes zones cutanées (grands brulés). De plus, le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Ce composé a montré des propriétés benefiques sur les cellules immunitaires dans un contexte de réparation tissulaire. Ce projet a été évalué par Ouest Valorisation et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce composé chez la souris est demandée.
Procédures
L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 2 procédures du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Elle concerne tous les animaux, soit 340 au total. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. Le paracetamol sera contenu dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle et jusqu’à la fin de la procédure 2. Pour la chirurgie induisant les lesions cutanées, les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine. Le maintien de l’anesthésie durant la procedure chirurgicale se fera par isofluorane. La chirurgie durera environs trente minutes et sera effectuée sur 240 souris. La buprénorphine sera administrée régulièrement en sous cutanée ) avant le réveil, 1h et 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la buprénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel sera mise à disposition des souris pour la nuit.
Impact sur les animaux
Les animaux seront utilisés une semaine après leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ils subiront ensuite une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure. Les animaux ne sont pas réveillés car nous allons prélever le sang et différents organes pour des évaluations biochimiques et histologique.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (340 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle de cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en suivant le test de Wilcoxon-Mann Whitney.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience . Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques, seront donnés. La douleur des animaux sera gérée en pré-opératoire par l’adjonction de paracétamol (1mg/ml) dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle de cicatrisation. Les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine (100microg de kétamine et 10 microg de xylazine par gramme de souris). Le maintien de l’anesthésie se fera par isofluorane 2%. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de l’opération et jusqu’à leur réveil. Des doses de buprénorphine seront administrées régulièrement (0,1mg/kg) en sous cutanée (sous 100 microL) avant le réveil, une seconde 1h après (100 microL) puis 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la burénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel (15μg/ml) sera mise à disposition des souris pour la nuit. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les modèles de cicatrisation chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester le composé X afin de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.
Rôle des cellules progénitrices dans le remodelage du tissu adipeux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras, soumises à des cycles de perte et de reprise de poids, à des gavages de tamoxifène ou de doxycycline et à des prélèvements sanguins répétés, certaines isolées cinq jours en cage de calorimétrie, pour étudier les cellules progénitrices du tissu adipeux. Le porteur écrit que "chaque animal sera exploité afin d'apporter le maximum d'information". Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces fonctions et que seule une approche in vivo permet de les explorer.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer l'implication des progéniteurs du tissu adipeux dans les fonctions du tissu adipeux et les conséquences métaboliques à l'échelle des tissus adipeux et systémiques Nous chercherons (i) à identifier des acteurs moléculaires importants dans la fonction fibrotique et inflammatoires de progéniteurs et (ii) à savoir si moduler la fonction des progéniteurs suffit à améliorer en locale les fonctions du tissu adipeux et le métabolisme systémique dans le contexte de l’obésité et des variations pondérales.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'identifier les acteurs moléculaires critiques de la fonction des progéniteurs du tissu adipeux, ce qui permettra à terme de développer des stratégies innovantes pour permettre de limiter les désordres métaboliques qui sont associés à l'obésité. De plus, nos résultats permettront également de trouver des moyens d'optimiser la perte de poids et ses effets métaboliques.
Procédures
Les animaux seront rendus obèses à l’aide d’un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines. Chez les animaux anciennement obèses, la perte de poids) est permise soit par le remplacement du régime gras par du régime chow sans restriction calorique et donc disponible ad libitum ; soit par une restriction calorique modérée opérée alors que les animaux sont toujours sous régime gras. Dans ces 2 cas de figure, la perte de poids s’étend sur une période de 4 semaines. Pour le modèle yoyo, l’obésité est induite par un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines, ensuite une perte de poids est induite par le remplacement du régime gras par du régime chow (ad libitum) pendant 4 semaines. Puis une ré induction de l’obésité est opérée par une réexposition au régime gras pendant 4 semaines. Chez les souris minces, obèses, anciennement obèses ou yoyo, pour l'étude du contrôle de la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 4 heures et ils subiront des prises de petits volumes de sang (environ 150ul). Ainsi qu'un gavage ou une injection ip en début d'expérience. Le test de tolérance au glucose ou le test de sensibilité à l’insuline durent environ 2,5 heures. Chaque gavage ou injection dure moins de 20 secondes. Les prises de sang durent moins de 30 secondes. Pour les besoins de certains modèles OGM inductibles, les animaux se verront administrer du tamoxifène par gavage (5jours successifs, 150ul en moyenne, chaque gavage dure moins de 20 secondes) ou de la doxycycline (ajoutée au régime gras pendant 8 semaines ou ajoutée au régime chow pendant les 4 semaines de perte de poids). Afin d'étudier l'homéostasie énergétique, certains animaux seront analysés en cage de calorimétrie pendant 5 jours, ce qui nécessite l’isolement des animaux au cours de la période d’analyse. L’analyse de composition corporelle par RMN ne dure pas plus de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les différents tissus adipeux.
Remplacement
Dans le tissu adipeux, la fonction cellulaire des progéniteurs va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. De plus, nos données montrent que l’état d’activation des progéniteurs va en retour avoir des conséquences histologiques et fonctionnelles sur le tissu adipeux. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions des progéniteurs in situ. L’évaluation de l’activité des cellules progénitrices du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.
Réduction
Chaque animal sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les modèles de souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. L’approche de croisement pour produire les animaux génétiquement modifiés est optimisée pour qu’une majorité des animaux produits soient utilisés. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. 984 animaux sont impliqués
Raffinement
Les animaux sont regroupés à 4-5 animaux par cage et le milieu est enrichi avec des bandes de papier et des abris en carton à usage unique. Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).
Choix des espèces
Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. La présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 8 semaines.
Résilience au stress et impact sur le vieillissement cellulaire chez la caille japonaise
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
96 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de plumes et de sang, et pour une partie un protocole de stress chronique associant chaleur, exposition à une silhouette de prédateur avec diffusion de cris, et confrontation à un objet nouveau, pour étudier l'effet du stress sur le vieillissement cellulaire. Le porteur indique que ce protocole vise à perturber l'homéostasie des oiseaux et à provoquer une angoisse, sans souffrance physique attendue selon lui. Les cailles sont tuées par dislocation cervicale sans anesthésie pour prélèvement de tissus.
Objectifs
L’évolution de nos sociétés modernes expose de façon croissante les animaux et les humains à une multitude de stimuli stressants. Chez l’humain et l’animal, il est connu qu’une exposition accrue au stress et à l’augmentation associée d’hormones glucocorticoïdes peuvent accélérer le vieillissement, mais les mécanismes physiologiques sous-jacents restent mal connus et débattus. Les télomères qui sont les extrémités protectrices de nos chromosomes raccourcissant avec l’âge et l’exposition à divers stress cellulaires, sont un marqueur cellulaire de vieillissement chez les vertébrés endothermes. Leur longueur et la vitesse à laquelle ils raccourcissent sont des prédicteurs de la survie et longévité chez l’hommes et de nombreuses espèces aviaires. L’exposition à divers stress environnementaux est connue pour accélérer le raccourcissement des télomères, mais des questions importantes restent non élucidées et sont le but de ce projet de recherche. Premièrement, il n’est pas clair si les effets du stress chronique sur le vieillissement cellulaire sont directement et/ou uniquement liés à l’augmentation chronique des hormones glucocorticoïdes, ou bien à d’autres bouleversements de l’homéostasie intervenant lors d’une exposition chronique à un environnement stressant. Deuxièmement, les mécanismes cellulaires liant exposition au stress et accélération de la vitesse d’érosion des télomères restent débattus. En effet, il a initialement été suggéré que l’augmentation des glucocorticoïdes avait pour conséquence de favoriser un état de stress oxydant qui est connu pour accélérer l’érosion des télomères, mais cette hypothèse a récemment été remise en question par la ‘metabolic telomere attrition hypothesis’. Cette dernière stipule que le raccourcissement des télomères lors d’un stress chronique est la conséquence d’une reprogrammation du métabolisme cellulaire (y compris du fonctionnement mitochondrial via la répression de mTOR (mechanistic target of rapamycin)) favorisant la restauration de la balance énergétique en conditions de stress. Apporter une réponse à ces deux premiers points permettra de savoir quelle stratégie thérapeutique potentielle pourrait être employée pour limiter les effets délétères du stress sur le vieillissement cellulaire. Enfin, nous n’avons pas tous la même sensibilité par rapport au stress. Déterminer si la sensibilité individuelle au stress influence l’impact du stress sur le vieillissement cellulaire est le troisième objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Le projet apportera des bénéfices en termes de connaissances fondamentales concernant : - l’origine de l’effet du stress sur l’accélération du vieillissement cellulaire - les mécanismes cellulaires sous-tendant l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire - l’importance de la sensibilité au stress sur le vieillissement cellulaire Ces connaissances fondamentales sont notamment nécessaires dans une optique de mise au point d’interventions limitant les effets délétères du stress chronique sur le vieillissement (e.g. supplémentation en antioxydants si le stress oxydant est un point central vs. supplémentation en rapamycin si l’inhibition de mTOR est identifié comme un facteur clé), aussi bien chez des animaux d’élevage que chez l’humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’interventions : - Prélèvement de plumes de poitrine (4x étalé sur 40j) - Prélèvement sanguin à la veine alaire (5x étalé sur 40j) - Contention de 10min pour induction d’un stress de contention (1x sur les groupes CONT et STRESS, 12x sur le groupe STRESS, c’est à dire 2x/semaine, car partie prenante du protocole de stress chronique modéré) Les animaux du groupe STRESS seront également soumis à : - Stress thermique de chaleur (passage de 21°C à 30°C) pendant 4h une fois par semaine, soit 6 fois au total - Stress de prédation (silouhette de prédateur au plafond et playback de vocalisations) pendant 2h une fois par semaine, soit 6 fois au total - Stress lié à la présence d’un nouvel objet pendant 4h une fois par semaine, soit 6 fois au total
Impact sur les animaux
Les protocoles de stress chronique et d’augmentation des glucocorticoïdes sont conçus pour engendrer une perturbation de l’homéostasie des animaux pouvant ralentir modérément la croissance des individus (non-observé aux doses choisies, voir références ci-dessous) et créer une potentielle angoisse, mais théoriquement pas de souffrance physique. Ils ont déjà été employés avec succès chez le modèle aviaire choisi, et ce à des stades de développement équivalent et à des degrés plus sévères : glucocorticoïdes dans l’eau de boisson : https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2007.06.423 ; stress chronique multifactoriel: https://doi.org/10.1016/j.bbr.2011.08.010. L’induction d’un ‘stress‘ modéré chez les animaux n’est pas un effet indésirable mais l’effet désiré dans le cadre de la question scientifique de ce projet.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale (sans anesthésie) pour permettre le prélèvement de tissus (principalement muscle pectoral et foie, mais les autres organes tels que le cerveau, le cœur et les organes reproducteurs seront aussi collectés et conservés à -80°C pour de potentielles mesures en collaboration avec d’autres laboratoires). Une partie des tissus fraichement collecté sera utilisée pour l’évaluation du fonctionnement mitochondrial, et une partie stockée à -80°C pour la détermination de la longueur des télomères, du stress oxydant, et de l’expression génique de plusieurs cibles par RT-qPCR (e.g. mTOR, nr3c1). Cette étude sur tissus est nécessaire pour évaluer la potentielle conservation des effets des hormones glucocorticoïdes et de l’exposition au stress entre organes, ce qui ouvrirait la porte à l’utilisation future des cellules sanguines comme cible principale peu invasive pour l’évaluation de l’impact de ces facteurs sur la physiologie du vieillissement.
Remplacement
Le projet vise à comprendre l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacent. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives à ce jour.
Réduction
Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire (32/groupe) à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs (détection d’un effet modéré Cohen’s d = 0.50). Cela a été possible grâce à deux éléments clés : - L’utilisation partielle d’un suivi longitudinal où chaque individu sera échantillonné (sang et plumes) avant d’entrer en procédure, ce qui permettra de corriger les données similaires obtenues post-traitement par la variabilité interindividuelle initiale - L’utilisation de trios d’individus ayant les mêmes parents, ce qui permettra d’augmenter la puissance statistique pour détecter des effets liés au traitement pour les paramètres présentant une héritabilité moyenne à forte ; l’héritabilité des télomères étant forte chez la caille japonaise (h2 ~ 0.65)
Raffinement
Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux expérimentaux aussi bien avant l’entrée en protocole, que pendant les procédures : -incubation/éclosion en conditions optimales chez l’éleveur spécialisé - transport à un âge (jour 5) résultant du meilleur compromis entre précocité (nécessaire pour le projet) et robustesse des poussins (nécessaire pour le bien-être) - transport par un transporteur agréé (SLAT services) à une température optimale (+26°C). - phase d’habituation au nouvel environnement de stabulation (5j), boxes de stabulation dédiés aux oiseaux entièrement rénovés - stabulation en groupes mixtes au sol en densité modérée et adaptée (boxes de 3.5m2 pouvant accueillir 32 individus 150g), nourriture et eau ad libitum - enrichissement structurel (cachettes, brises-vue, capsules de bouteilles plastiques) et enrichissement alimentaire (litière dense propice au fouissage, vers de farine dispersés 1x/jour dans la litière) selon https://doi.org/10.1080/00071660601084333 - suivi quotidien par un personnel qualifié (3 animalières + porteur de projet) et tenue d’un cahier de suivi - Tenues de couleur spécifique pour le personnel lors de l’induction de stress chronique par contention, ajout de nouvel objet, etc. - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être chez cette espèce) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance et/ou gain de masse < 20% du gain de masse du groupe contrôle (= points limites) - Procédure d’euthanasie réalisée par le porteur du projet car expérimenté sur cette espèce
Choix des espèces
La caille japonaise (Coturnix japonica) est un excellent modèle aviaire pour les études en laboratoire, notamment dans un contexte d’étude du vieillissement. Leur cycle de vie court (50-60j entre l’éclosion et la maturité sexuelle) permet de réaliser des études couvrant toute la vie ‘précoce’ des individus en un temps réduit, et comme la grande majorité du raccourcissement des télomères intervient durant la croissance, notamment chez ce modèle aviaire, c’est de ce fait le modèle le plus adapté au questionnement scientifique du projet décrit dans ce document. Les animaux seront utilisés au stade poussin (début de procédure à 10j), car la majorité du raccourcissement des télomères est observé lors de la croissance (éclosion au jour 60) des individus comme précédemment démontré chez cette espèce.
Réponses métaboliques précoces chez la souris axénique recevant par voie orale un microbiote intestinal de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
32 souris axéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées sans microbiote, elles reçoivent un unique gavage de flore intestinale de souris, puis sont tuées entre six heures et trois jours après pour analyse des tissus. Le porteur décrit une intervention réduite, une sonde souple maniée par du personnel expérimenté, et n'attend pas de réaction inflammatoire. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité d'étudier hors de l'organisme vivant les effets du microbiote sur le métabolisme.
Objectifs
Les maladies cardio-métaboliques (CMD) sont aujourd'hui la principale cause de maladie et de décès dans le monde. Elles causent non seulement des souffrances considérables aux millions de personnes touchées, mais aussi des coûts considérables pour la société et les systèmes de santé. Le terme CMD englobe différentes composantes telles que l'athérosclérose, la résistance à l'insuline / diabète sucré de type 2, la dyslipidémie et la stéatose hépatique / stéatohépatite non alcoolique. Cependant, il n'existe toujours pas de traitement efficace. Le microbiote intestinal, c'est-à-dire toutes les bactéries présentes dans notre intestin, est de plus en plus reconnu comme étant un facteur important dans de nombreuses pathologies, y compris les CMD. Cependant, les connaissances détaillées des mécanismes reliant le microbiote intestinal aux CMD font encore largement défaut. En particulier, on sait encore très mal comment, en conditions physiologiques, le microbiote régule le métabolisme et comment les organismes hôtes réagissent au contact du microbiote. Le projet actuel vise à étudier ce phénomène. L’étude de la dynamique d’adaptation du microbiote à l’hôte permettra de savoir quelles populations bactériennes sont impliquées dans la régulation du métabolisme. L’analyse des fluides et tissus biologiques par spectrométrie de masse donnera une image quasi-exhaustive des métabolites produits ou modifiés par le microbiote. La caractérisation approfondie du métabolisme des lipides et des voies inflammatoires sera particulièrement pertinente pour les CMD. En effet, le métabolisme des lipides et l’inflammation sont les deux voies menant à la maladie athérosclérotique, à l’épuisement des cellules pancréatiques beta (diabète de type 2) et à la stéatose hépatique non alcoolique. Les connaissances issues de ce projet permettront par la suite de concevoir des expériences ciblant des domaines spécifiques des CMD, en utilisant des modèles animaux ad hoc (ex : régime alimentaire riche en graisse pour étudier la stéatose hépatique).
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, les bénéfices attendus sont un gain et un raffinement des connaissances fondamentales sur les interactions entre le microbiote intestinal et son hôte dans le domaine des régulations métaboliques. Il s’agit donc ici de contribuer à faire progresser les connaissances génériques sur la physiologie de l’organisme. Dans un second temps, nous escomptons qu’une meilleure compréhension des interactions mutuelles entre le microbiote et l'hôte aidera à mieux comprendre la physiopathologie des CMD et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées.
Procédures
Quatre groupes sur 7, soit 32 souris sur 56, seront soumis à un unique gavage en début d'expérimentation, avec une dilution de microbiote intestinal de souris.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation oro-gastrique avec 200 µL de dilution de microbiote intestinal. Ce geste technique sera effectué à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Le microbiote inoculé étant issu de souris SPF, il sera dépourvu de micro-organismes pathogènes, de telle sorte qu’une réaction inflammatoire systémique suite à cette inoculation est très improbable. Les souris seront mises à mort entre 6 heures et 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecte et analyse de tissus.
Remplacement
L'évaluation des effets du microbiote intestinal sur le métabolisme de l'hôte n'est possible que chez les animaux vivants, du fait notamment des interactions complexes entre différents organes qui déterminent les réponses métaboliques globales.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour estimer le nombre minimal d’animaux requis pour avoir des résultats exploitables. Ce nombre est de 8 par groupe. Le protocole comporte 7 groupes, ce qui aboutit à un total de 56 animaux.
Raffinement
Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 4 individus par cage, sur une litière de copeaux. Nourriture et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Les animaux seront visités une fois par jour avant la procédure d’inoculation oro-gastrique, puis 2 fois par jour pendant les 3 jours qui suivront cette procédure. L’inoculation oro-gastrique sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. A la fin de l’expérience, soit au plus 3 jours après le gavage, les souris seront anesthésiées profondément avec de l'isoflurane avant d’être mises à mort par dislocation cervicale. Ce geste sera effectué par le personnel expérimenté de l’animalerie.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal et les maladies cardio-métaboliques, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 8-10 semaines.
Etude du rôle d’un récepteur au froid (« TRPM8 ») au cours de la cardiomyopathie diabétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs organes, 44 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 44 un niveau modéré. Porteuses ou non d'une invalidation du gène d'un récepteur au froid (TRPM8), elles sont nourries seize semaines d'un régime standard ou riche en sucres et en graisses, avec une glycémie toutes les deux semaines, six heures de jeûne avant des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline, un test d'effort de 20 minutes sur tapis de course et une échographie cardiaque sous anesthésie. D'éventuels traitements pour les patients diabétiques relèvent du "plus long terme" et du conditionnel. Le porteur attend du régime "une prise de poids corporelle importante et rapide" et un dysfonctionnement cardiaque, puis écrit n'avoir "pas constaté d'effets indésirables".
Objectifs
Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or, le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce projet vise à comprendre le rôle du récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours d’un syndrome métabolique. En effet, nos derniers résultats ont montré un lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid. Nous avons pu montrer que lorsqu’on diminuait la quantité de récepteur au froid, cela induisait une augmentation des graisses insaturées. Nous pensons que le récepteur au froid pourrait jouer un rôle clé dans la modulation des complications cardiaques de la cardiomyopathie diabétique. Plus précisément nous nous attendons à une meilleure résistance des animaux invalidés au récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours du syndrome métabolique. La cardiopathie diabétique est la conséquence des altérations de structure et de fonction du tissu cardiaque survenant chez les diabétiques indépendamment des facteurs de risque. Nous allons utiliser un régime riche en sucres et en gras pour mimer cette pathologie, comparé à un régime contrôle. Les symptômes attendus sont une prise de poids importante, une fatigue accrue et un essoufflement plus important à l’effort. Des souris invalidées ou non pour le récepteur au froid seront soumises à un régime riche en sucres et en gras pendant 4 mois. Cette procédure permettra d’évaluer l’effet de l’absence du récepteur au froid sur la fonction contractile sous régime riche en sucres et en gras, par un test d’effort sur tapis de course, une échocardiographie sous anesthésie gazeuse, ainsi que sur le profil diabétique des souris par des tests de tolérance à l’insuline et au glucose et un test de signalisation à l’insuline. L'inflammation dans le sang et dans les tissus sera évaluée après mise à mort des animaux, en mesurant les taux sanguins de marqueurs inflammatoires et l’infiltration des cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles et lymphocytes) dans le tissu cardiaque.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet nous permettra de comprendre le lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid dans la cardiomyopathie diabétique. A plus long terme, ce travail pourrait ainsi proposer l’utilisation des modulateurs pharmacologiques du métabolisme des graisses, ainsi que des substituts pharmacologiques du récepteur au froid, permettant de rétablir une contraction normale cardiaque chez les patients diabétiques.
Procédures
Le protocole dure au total 16 semaines. La moitié des souris seront mises sous régime standard pendant 16 semaines et l’autre moitié sera mise sous régime enrichie en lipides et en sucrose. Toutes les 2 semaines un suivi du poids et de la glycémie sera effectué sur les souris (prise de la glycémie ~1min). Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 8 et 16 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Un test d’effort sera également effectué à 16 semaines sur tapis de course (durée du test : 20min). Les souris auront été au préalable habitué au tapis de courses, 1 fois par jour pendant 3 jours (2mn par session). Une échographie sera effectuée à 16 semaines sous anesthésie (durée anesthésie générale :30min).
Impact sur les animaux
Comme précisé dans le déroulé du projet, nous nous attendons, en réponse au régime riche en sucres et en gras, à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque, raison de l’étude. Nous n’avons pas constaté d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (16 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes
Remplacement
Le récepteur au froid dont il est question dans ce projet a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années. Ces études ont permis d’établir le potentiel de ce récepteur au froid comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver que l’implication de ce canal dans la modulation du métabolisme lipidique a un effet protecteur au cours de la cardiomyopathie diabétique, dans une étude physiologique sur organisme vivant.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats statistiquement exploitables. En outre, l’expérience et le recul de l’équipe concernant les régimes alimentaires utilisés et les examens prévus, permettent de prévoir un très faible taux de mortalité et d’échec. Par ailleurs, nous utiliserons les souris mâles et femelles pour optimiser les animaux issus de l’élevage. Ceci constitue en outre un effort de réduction à long terme, car les conclusions de ce projet permettront à l’avenir aux utilisateurs de cette lignée de clarifier l’effet du sexe sur la régulation du récepteur au froid au cours de la cardiopathie diabétique
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisés sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis.
Choix des espèces
Les modèles pathologiques développés chez la souris de cardiopathie diabétique miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid). De plus, au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, le fond génétique dont il est question dans ce projet est le plus utilisé pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet ont d’ailleurs été développés sur ce fond génétique). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines lors de la mise en place de la diète pour 4 mois, menant à un âge de 22-24 semaines à l'issue de la procédure. Le fait de réaliser des échographies sur des sujets jeunes va permettre de limiter l’intensité des cônes d’ombres dus aux côtes pendant les examens d’échocardiographie.
Analyse des cellules Bêta du pancréas dans le cas de diabète
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur leur administre du tamoxifène pour induire une mutation dans les cellules bêta du pancréas, puis les soumet à une thoracotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, sans réveil. Il précise que la mutation ne provoque ni diabète ni tumeur aux stades étudiés et que les analyses sont post-mortem. Il affirme que ses souris transgéniques sont les seules à permettre une telle étude représentative de la pathologie humaine.
Objectifs
Chez l’homme, la mutation d'un régulateur de l'expression d'un gène pancréatique cause le développement d’un diabète ou/et d’insulinome (tumeur). Ceci démontre que ce facteur est un acteur clef de ces pathologies. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans l’apparition de ces maladies, le laboratoire a généré une souris transgénique représentative de la mutation de ces patients. Cette souris est porteuse de la mutation dans toutes ses cellules (modèle A). Nous avons également généré une variante de cette souris, dans laquelle la mutation étudiée est inductible spécifiquement dans les cellules bêta suite à l’injection d’une molécule particulière (Modèle B). Les cellules bêta sont les cellules du pancréas qui sécrètent de l’insuline, une hormone qui régule les niveaux de glucose dans le sang. Sur la base de la littérature, nous pensons que la masse de cellules bêta pourrait être perturbée chez nos animaux mutants. Nous allons donc utiliser une technique qui nous permettra de visualiser et mesurer la quantité de cellules bêta. Une altération de la masse de cellules bêta pourrait être associée à un diabète et une quantité excessive pourrait être liée à un insulinome. Ces expériences nous permettront ainsi de mieux comprendre le diabète et les insulinomes chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue une méthode innovante pour visualiser les îlots de Langerhans (cellules endocrines) dans le pancréas entier. Il permettra notamment de quantifier la masse totale de cellules bêta productrices d’insuline, en fonction de la présence d’un allèle sauvage ou d’une forme mutée du facteur de transcription pancréatique étudié. Les conclusions apportées par ce projet permettront de mieux comprendre l’implication de ce facteur dans le développement d’un diabète ou d’un insulinome (tumeur du pancréas endocrine) chez les patients porteurs de telles mutations. A ce jour, on ne connaît pas de drogue capable de moduler la voie de signalisation étudiée. Nous espérons qu’à l’avenir, nos travaux permettront de développer de nouveaux traitements du diabète et de l’insulinome.
Procédures
Les animaux vigiles recevront 1 injection intrapéritonéale ou 1 administration par voie orale de tamoxifène. Tous les animaux profondément anesthésiés subiront ensuite une procédure sans réveil (perfusion par voie intracardiaque (durée de l’anesthésie
Impact sur les animaux
Les mutations induites suite à l’injection d’une molécule particulière (tamoxifène) n’induisent pas de diabète ou d’insulinome chez nos souris aux stades étudiés. Nous souhaitons toutefois analyser en profondeur les changements des cellules bêta au niveau histologique et génétique (analyses post-mortem). Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s’arrêteront en fin de chirurgie (sans réveil)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les effets de la mutation étudiée ont déjà été décrits au laboratoire. Pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses in silico lors de comparaisons transcriptomiques. Nous souhaitons analyser les effets de la mutation du facteur étudié sur la masse et la biologie des cellules bêta. Les souris transgéniques sont les seules permettant une telle analyse représentative de la pathologie humaine.
Réduction
Une première étape de mise au point expérimentale sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux Nous analyserons ensuite un minimum d’animaux. Si la significativité est atteinte avec ce nombre, nous stopperons ces expériences. Cela permettrait de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux injectés au tamoxifène seront observés de façon hebdomadaire, de manière à surveiller l'état général de la souris. Nous n’avons pas observé de diabète ou d’insulinome chez ces animaux aux stades étudiés. Néanmoins, une grille de score sera utilisée afin d’avoir un suivi objectif des animaux. Au moindre signe de mal-être, les souris seront euthanasiées. Lors de la thoracotomie les animaux seront anesthésiés profondément avec une prise en charge de la douleur. Pour limiter la douleur, les contentions sont douces et la perfusion intra-cardiaque ne se fait que lorsque les animaux sont anesthésiés et complètement insensibles à la douleur (test de sensibilité par pincement au niveau des espaces interdigités des postérieurs). Nous utiliserons à la fois des antalgiques et des anesthésiques pour limiter la douleur.
Choix des espèces
Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier les effets des mutations étudiées. La souris constitue de par son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, un modèle de choix pour mener nos expériences. Les animaux seront analysés à 3 stades adultes : 3 mois, 12 mois et 24 mois, représentants différents stades du vieillissement de la souris. Par ailleurs, on sait que ce type de phénotype lié aux cellules bêta est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris. De plus, nous nous intéressons à la senescence des cellules bêta, qui pourrait être liée au vieillissement.
Influence de la supplémentation précoce en 2 bactéries sur le comportement alimentaire de jeunes ratons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 jeunes rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance, le porteur leur fait ingérer par la bouche des bactéries, puis mesure leur comportement alimentaire lors d'isolements répétés et d'un test à deux bouteilles opposant eau et solution sucrée, avant de les décapiter sous anesthésie pour prélever cerveau et sang. Il décrit un protocole sans douleur mais reconnaît le stress lié à l'isolement des ratons. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n'existe et que le rat Fischer est "nécessaire" à la continuité du projet.
Objectifs
Ce projet repose sur la constatation qu’un enfant présente plus de risque de développer une obésité si sa mère était en surpoids ou présentait une obésité avant ou pendant la période périnatale. Etant donné que l’obésité modifie la composition du microbiote en faisant augmenter la présence de bactéries néfastes pour le métabolisme, la question est de savoir si le comportement alimentaire de l’enfant né par voie basse et allaité peut être influencé par le transfert du microbiote maternel. Selon cette hypothèse, le microbiote maternel modifierait, par l’intermédiaire de métabolites bactériens, le neurodéveloppement du petit dans les structures cérébrales liées au comportement alimentaire. Les deux premières parties du projet ont abouti aux résultats suivants : 1. Les ratons à qui l’on a fait ingurgiter par têtage dès la naissance un mélange de microbiotes vaginaux, laitier et fécaux provenant de rates obèses s’alimentent plus que des ratons ayant ingurgité un microbiote de mères non obèses (ingéré laitier doublé, par exemple) et développent une préférence pour les aliments gras et/ou sucrés jusqu’au stade jeune adulte. 2. L’analyse des microbiotes des mères et des ratons a mis en évidence la présence d’espèces bactériennes dont les abondances/absences étaient corrélées avec des caractéristiques du comportement alimentaire des petits. L’expérimentation décrite dans cette demande vise à déterminer si les supplémentations en 2 des espèces bactériennes identifiées, et supposées favorables (car abondantes chez les rates non obèses), peuvent effectivement modifier le comportement alimentaire des ratons en le modérant. Celui-ci sera examiné à 3 temps de leur croissance : pendant la lactation, à l’adolescence et au stade jeune adulte.
Bénéfices attendus
Si l’obésité est un des grands problèmes de santé des pays industrialisés, l’obésité des enfants est doublement préoccupante, car un enfant en surpoids a toutes les chances de souffrir de ce problème et/ou de diabète de type 2 dans sa vie d’adulte. Les traitements classiques –régimes, restriction alimentaire, activité physique etc- restent généralement en échec, car trop difficiles à poursuivre dans la durée. De nouvelles sources thérapeutiques doivent donc être envisagées. L’influence du microbiote dans les problèmes métaboliques est désormais bien reconnue. La question du projet validé par l’ANR était de savoir si le microbiote maternel, transmis lors de la naissance et de la lactation, pouvait influer sur le comportement alimentaire des petits. L’objectif était d’identifier des espèces bactériennes favorables ou néfastes, dans la perspective plus lointaine de modifier et corriger le microbiote défavorable. Nous avons mis en évidence, dans une première partie, des espèces bactériennes plus abondantes dans le microbiote des ratons résistant à l’obésité et nous allons ici déterminer leur impact sur le comportement alimentaire de jeunes rats. Si les bactéries étudiées dans cette expérimentation se révélaient bénéfiques en induisant une baisse de la prise alimentaire, cela pourrait contribuer à la mise en place de nouveaux traitements par supplémentation bactérienne
Procédures
Hormis la récupération de féces dans les pots de pesée des ratons, il n’y a pas de prélèvement sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Ce protocole n’engendrera aucune douleur, mais des isolements seront nécessaires, en raison de la mesure de l’ingéré alimentaire en différents points. Dès la naissance, les ratons nouveaux nés recevront par têtage de petits volumes (25µl) de liquide (eau salée) contenant ou non les bactéries étudiées. Cet acte est réalisé avec le plus grand soin possible par des intervenants expérimentés. La goutte de liquide est déposée sur la cavité orale des ratons, sans forcer l’introduction. A J15, les ratons seront isolés de leur mère pendant 2 heures, puis remis à têter pendant 1 heure. A J34, 8 ratons dans chaque isolateur seront placés dans des cages individuelles pendant 1 heure, le temps de consommer un aliment appétent (céréales chocolatées) puis remis dans leurs cages d’origine, et ce pendant 10 jours, puis ils seront euthanasiés le 11ème jour. A J62 les ratons restants seront placés dans des cages individuelles pour l’habituation à un test 2 bouteilles, l’une contenant de l’eau et l’autre une solution sucrée. La consommation de ces boissons sera mesurée pendant 3 jours et les ratons seront euthanasiés. Le stress dû à l’isolement sera donc limité autant que possible.
Devenir
Les animaux seront décapités après anesthésie profonde à l’isoflurane afin de récupérer le sang du tronc et le cerveau. Des analyses de peptides liés à l’alimentation seront effectuées.
Remplacement
Ce projet vise à déterminer l’effet de la supplémentation de 2 bactéries sur le comportement alimentaire du jeune. Ces bactéries ingérées sont susceptibles de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales liées à l’alimentation, par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.
Réduction
Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire, par un calcul statistique de puissance (n=8 par temps, traitement et sexe) .
Raffinement
Il n’y a pas douleur particulière liée à la réalisation de ce protocole. Les ratons seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors de l’isolement pour la mesure de l’ingéré laitier, ils seront isolés par portée entière, dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du sopalin déchiqueté par la mère. L’ingéré alimentaire est mesuré de plusieurs façons, mais chaque fois sur des ratons différents qui sont euthanasiés après ces mesures. Par conséquent, l’isolement nécessaire pour la mesure sera le plus bref possible et n’interviendra qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés deux fois par semaine. Tout signe indiquant un mal-être est surveillé (prostration, perte de 10% de poids par rapport à la mesure précédente, dos vouté, pelage dégradé, blessure). Bien que peu probable, un incident d’expérimentation peut survenir. Dans le cas d’un animal en détresse, une surveillance de 24 h sera effectuée, et si l’état de l’animal reste non satisfaisant, il sera exclu de l’expérience et euthanasié.
Choix des espèces
C’est le comportement alimentaire du jeune qui nous intéresse, et nous utliserons donc des ratons âgés de 15 à 70 jours, des deux sexes. Le rat Fischer est un bon modèle pour les études nutrionnelles et métaboliques ; ce modèle a été utlisé dans la première partie de l’expérimentation, et il est nécessaire pour la continuité et la cohérence du projet.