Système cardiaque

4443 souris vont être utilisées pour une zone de peau fibrosée de moins d'un centimètre carré dans le bas du dos, chacune recevant des injections répétées d'un agent inflammatoire cinq jours par semaine pendant deux semaines. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées pour analyses. Le projet observe comment la rigidité du tissu modifie la migration des cellules immunitaires dans la peau. L'effectif de plus de quatre mille animaux n'est rattaché qu'à un objectif de connaissance fondamentale, sans justification détaillée du nombre.

Objectifs

La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches. 1)L’épiderme, la couche la plus superficielle 2)Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. 3) l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique. Dans le derme et l’épiderme, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Certaines cellules immunitaires (les cellules dendritiques) se déplacent dans les tissus en prélevant des échantillons de leur environnement. Elles migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques drainant leur tissu d’origine. Ces 2 étapes (échantillonnage en périphérie et migration vers les ganglions) sont clefs dans la mise en place de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Dans les tissus, la migration des cellules dendritiques est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation. Notre projet vise à comprendre comment la modification des propriétés mécaniques de la peau modifie la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans la peau et dans les ganglions. La compréhension de ces mécanismes mis en jeu pourra s’appliquer à d’autres pathologies dans lesquelles la modification de la structure du tissu est majeure. La modification de la structure tissulaire et de ses propriétés physiques est maintenant connue dans de nombreuses pathologies notamment au sein de divers cancers, où le la modification du collagène semble favoriser la survenue de métastases en inhibant la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Comprendre comment l’installation d’une fibrose modifie les propriétés mécaniques des tissus et la migration des cellules immunitaires permettra d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus. Nous focalisons nos recherches sur les cellules dendritiques, cellules sentinelles du système immunitaire indispensable pour le déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique. Nos premiers résultats mettent en évidence une accumulation de cellules dendritiques en cas de fibrose, qui sont incapables de migrer au ganglion lymphatique. Nous souhaitons adapter cette DAP afin de préciser les mécanismes moléculaires mis en cause dans ce défaut de migration. Ces mécanismes pourront être utilisés dans de nombreuses autres pathologies où la modification de la structure du collagène joue un rôle majeur dans la progression de la maladie et la réponse immunitaire, notamment en cas de cancer, où la migration des cellules dendritiques est également défectueuse. La modification proposée permettra d’identifier des mécanismes précis qui régulent la migration des cellules dendritiques, et pourra s’appliquer à d’autres pathologies (cancer).

Procédures

Dans un premier lot, les animaux anesthésiés recevront des traitements par injection à raison de maximum 1 injection par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines (durée de chaque anesthésie de 5 minutes maximale). Certains de ces animaux recevront également un second traitement soit par injection à raison d’1 injection par jour pendant 5 jours consécutifs au maximum (durée du geste inf à 10sec) soit par application cutanée (application unique – durée du geste de 3 minutes). Dans un second lot, les animaux vigiles recevront une application cutanée unique de produit (durée du geste inférieure à 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de produits seront celles liées à la piqûre (douleur de courte durée). L’injection d’un agent inflammatoire induira une inflammation chez les animaux. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et non générale, et modérée. La gêne est caractérisée par l’apparition d’une desquamation principalement entre les 12e et 16e jours après injection, et la présence d’un érythème dont l’intensité est maximale du 9e au 14e jour. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines afin d’étudier la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets rémanents après la fin des injections. La surface attendue de la zone fibrotique de la peau du bas du dos de la souris est inférieure à 1cm. Nous porterons notre attention spécifique sur cette zone. Nous ne nous attendons pas à des conséquences sur la mobilité des souris, la zone fibrotique étant à distance des articulations des membres supérieurs et inférieurs. Un éventuel effet sur la mobilité n’a d’ailleurs pas été décrit dans la littérature.L’application cutanée d’un marqueur fluorescent sans addition de molécule pro-inflammatoire induira une réaction locale éventuelle (mais non décrite dans la littérature). L’application cutanée d’un marqueur fluorescent associé à une molécule proinflammatoire pourra induire un aspect inflammatoire local (rougeur, chaleur).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L’influence du microenvironnement tissulaire sur la migration des cellules immunitaires a été démontré par de nombreuses équipes au cours de la dernière décennie. Ces cellules répondent à des signaux de dangers, largement étudiés in vitro , comme par exemple la présence de composants bactériens. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu, qui répond également à la présence de signaux de dangers. Il n’est donc pas possible d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’utilisation de différents modèles in vitro (matrice en fibres 3D) ou ex vivo (explants de peau humaine) ne permettent pas de reconstituer la complexité du tissu cutané : - Sa structure en 3 couches (épiderme, derme, hypoderme) et la structure des fibres de collagène formant le tissu de soutien aux cellules. - Nombreux types cellulaires présents : kératinocytes dans l’épiderme, fibroblastes dans le derme, adipocytes (manquant dans les modèles in vitro), extrémités neuronales (non présents dans les modèles in vitro) et l’infiltrat immunitaire comportant de multiples types cellulaires différents. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permettra alors d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Par ailleurs, Le modèle in vivo est indispensable pour déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires et la migration d’un organe à l’autre, dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que la peau). Une première expérience sera réalisée afin de déterminer les meilleurs temps expérimentaux à utiliser. Les échantillons issus de cette expérience seront également utilisés pour les analyses des procédures suivantes. Le maximum d’échantillons d’intérêt a été et sera prélevé lors de la mise à mort des souris (peau, ganglions, sérum) et conservés pour des analyses ultérieures. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Grâce à nos résultats préliminaires, nous avons pu supprimer une procedure initialement prevue qui n’a plus de rationnel scientifique. A partir de données publiées et accessibles, nous avons ici déterminé le nombre d’animaux nécessaire comme étant le plus petit nombre d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative dans notre modèle expérimental (induction de fibrose cutanée).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Pour cela : -Les souris sont habituées à l’animalerie (accoutumance après transfert) et habituées à être manipulées par le même expérimentateur avant le début de la procédure, afin de limiter le stress après le début de la procédure. -Un suivi clinique renforcé sera réalisé pendant les 30 min suivant l’injection sous-cutanée, puis 6h après, puis une fois par jour pendant 10 jours, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. -Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de la procédure (traitement antalgique, mise à mort). -Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans les procédures antérieures (au fur et à mesure de l’avancée du projet). Nous n’avons pas observé d’effet secondaire inattendu lors des premières expériences réalisées. Pour éviter l’inconfort et la douleur lors des procédures, des anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

116 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour un prélèvement terminal des organes. Placées sous un régime très enrichi en phosphore pendant cinq à dix jours, elles peuvent perdre 10 à 20 % de leur poids, une perte de 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à comprendre comment le phosphate provoque des calcifications des artères chez les personnes en insuffisance rénale chronique. Le porteur justifie le recours à l'animal entier par le caractère systémique de la maladie et fonde l'effectif sur son expérience passée plutôt que sur un calcul statistique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associé au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes de maladie rénale chronique (MRC). En effet, la MRC aboutit à une augmentation de la concentration de Pi qui déclenche la calcification de la paroi artérielle, ce qui entraîne une rigidification du système artériel et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV soit largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de la MRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques capables de contrecarrer ses effets délétères. Pour comprendre le rôle du Pi dans les CV, nous travaillons sur une protéine dont le rôle est de transporter le Pi et de ressentir les variations de concentration extracellulaire de Pi. Notre objectif est d’évaluer les effets de la diminution d’expression de cette protéine, dans l’apparition des CV en contexte de maladie rénale. Pour cela, nous utiliserons un modèle de maladie rénale chez la souris. Pour la réalisation de ce projet, 116 souris au maximum seront utilisées.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’action du phosphate dans l’apparition des calcifications vasculaires pourra servir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

micro-prélèvements sanguins (au maximum 2 fois) - mise sous régime très enrichi en phosphore (pendant 5 ou 10 jours)

Impact sur les animaux

Les micro-prélèvements sanguins peuvent générer un stress et une douleur de classe légère. Le régime très enrichi en phosphore peut ne pas être bien toléré par les animaux, pouvant parfois aboutir à une perte de poids d’environ 10-20%.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélèvement terminal pour des analyses sur organes d’intérêt.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour cette étude (116 souris) a été calculé sur la base de notre expérience antérieure, nos discussions avec d’autres laboratoires utilisant ce modèle et sur la littérature. Nous allons commencer le projet par une expérience pilote en vérifiant l’apparition des calcifications vasculaires et en apportant des améliorations si nécessaire.

Raffinement

Un suivi quotidien du poids des souris sera effectué. Points limites définis : 1) 10% perte de poids, 2) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 3) Posture de prostration. Pendant le suivi quotidien du poids de la souris, si une baisse de 10% du poids initial est observé (#1), les animaux seront suivis attentivement pendant 24h supplémentaires puis transférés sur un régime alimentaire standard. Si leur état ne s’améliore pas et en cas d’atteinte des points limites (#2, 3), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous nous intéressons au rôle d'une protéine transporteur de phosphate dans l’apparition des calcifications vasculaires en contexte de maladie rénale. L’utilisation de la souris génétiquement modifiée permet d’identifier le rôle de cette protéine dans un organisme entier. Les animaux seront des adultes âgés de 12-20 semaines.

76 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang intracardiaque et de tissus. Pendant douze semaines, elles reçoivent des régimes riches en gras et en sucre, des prélèvements sanguins répétés à l'entaille de la queue, des gavages de glucose et de lipides et des injections d'insuline et d'héparine. Le porteur note que les prises de sang répétées sur douze semaines peuvent générer un stress modéré malgré l'espacement des tests. L'étude cherche à mesurer l'effet d'une féverole fermentée sur le métabolisme et le microbiote, et n'inclut que des mâles.

Objectifs

Ce travail s’inscrit dans une démarche globale d’exploration des bénéfices potentiels de la substitution partielle de protéines animales par des protéines végétales fermentées, dans le cadre d'un programme qui promeut le développement et la valorisation des protéines végétales dans l’alimentation humaine. La féverole (FB) (Vicia faba) est une légumineuse cultivée en Europe et reconnue pour sa forte teneur en protéines (25–30 %). Elle représente une piste majeure pour diversifier les sources protéiques et réduire la dépendance aux protéines animales dans un contexte de transition agroécologique. Sur le plan nutritionnel, elle est riche en acides aminés essentiels, en fibres fermentescibles et en composés bioactifs. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels peut limiter sa digestibilité. La fermentation lactique des concentrats de féverole constitue une approche prometteuse pour améliorer ses qualités nutritionnelles en augmentant la digestibilité, en réduisant les composés antinutritionnels et en modulant favorablement les populations bactériennes intestinales. Dans ce contexte, ce projet vise à déterminer dans quelle mesure la substitution d’une partie des protéines animales par des protéines de (FB) fermentées peut influencer la santé cardio-métabolique et les composition/fonction du microbiote intestinal. L’étude des effets métaboliques d’une consommation de concentrats protéiques fermentés chez la souris après le sevrage, permettra d’évaluer l’impact de différents régimes (protéines animales, FB non fermentée, FB fermentée) sur la croissance, le métabolisme lipidique, la tolérance au glucose, l’inflammation de bas grade ainsi que la santé intestinale et la composition du microbiote. Des approches métabolomiques et transcriptomiques permettront d’identifier les voies biologiques modulées par ces régimes. L’impact de ces régimes sur le microbiote intestinal sera analysé en caractérisant sa composition taxonomique et fonctionnelle. Nous rechercherons si la fermentation des protéines de FB modifie favorablement la structure et les fonctions microbiennes intestinales. Ce projet vise à apporter des connaissances nouvelles sur le rôle d’ingrédients fermentés issus de légumineuses dans la prévention des pathologies métaboliques, sur les mécanismes impliquant le microbiote intestinal, et sur le potentiel de leur intégration dans l’alimentation humaine dans un objectif de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances essentielles sur l’impact de protéines végétales fermentées issues de la féverole (Vicia faba L.) sur la santé cardio-métabolique d’un mammifére et sur son microbiote intestinal. Les résultats attendus présentent un double intérêt, à la fois scientifique et sociétal. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets des protéines végétales fermentées sur la santé cardio-métabolique, en évaluant leur impact sur le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que sur l’inflammation de bas grade. Il contribuera également à identifier des signatures métaboliques et microbiennes associées aux régimes à base de féverole, offrant de nouveaux biomarqueurs pour les recherches futures. Les résultats soutiendront le développement d’aliments plus durables et plus sains, en cohérence avec les objectifs du programme scientifique, et pourraient contribuer à la prévention des pathologies métaboliques chez l’humain.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés les semaine 1, semaine 6, semaine 9, semaine 10, semaine 11 et semaine 12 du protocole sur animal vigile pour effectuer les tests de tolérance au glucose et aux lipides. Aprés administration des solutions (glucose, lipide) par biberonage ou gavage, des préevements sanguins seront effectués pour des dosages. Ils sont effectués par incision superficielle de l’extrémité de la queue, après désinfection et application préalable de lidocaïne et sont réalisés à 1 semaine d’intervalle minimum. Chaque goutte de sang correspond à un volume d’environ 5µL et le recueil ne dépassera pas 70µL par session sauf pour le test de tolérance aux lipides où le volume devra être de 180 µL au total. L’hémostase au niveau de la queue sera assurée par compression locale pendant 60 secondes à chaque prélèvement. Seulement en cas de nécrose de la queue, le prélèvement de sang sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale après réchauffement de la queue de la souris sur un pad chauffant, ou bien un prélèvement dans la veine faciale submandibullaire.

Impact sur les animaux

Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées aux manipulations pour l’administration de lipide par gavage, de glucose par gavage ou biberonage, l’injection d’insuline, l’injection d’héparine, les prises de poids, les prélèvements sanguins ainsi que la mise à mort des animaux. Les prélèvements de sang réalisés à l’extrémité de la queue peuvent provoquer une gêne passagère, un stress léger et une douleur brève au moment de l’incision. Le test fonctionnel de tolérance au glucose implique l’administration d’une solution de glucose par biberonnage volontaire des souris ou bien par gavage gastrique, pouvant générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation, de courte durée. Il en est de même pour le test fonctionnel de tolérance aux lipides qui implique un gavage en contention douce de l’animal, provoquant ainsi un stress transitoire. L’injection intrapéritonéale d’insuline générera un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la procédure invasive. L’injection unique d’héparine en fin de protocole est également susceptible d'entraîner une gêne momentanée. L’ensemble de ces effets indésirables est attendu comme léger à modéré, transitoire, et limité par des pratiques de raffinement (contention douce, personnel formé, surveillance des animaux, arrêt anticipé en cas de signe clinique anormal). Cependant les prises de sang répétees sur la durée de 12 semaines d'expérimentation, bien que espacées d'au moins 1 semaine entre 2 tests peut générer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la réalisation des analyses biologiques finales sur prélèvements de sang intracardique et de tissus, indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Aucun animal n’est maintenu en vie à la fin du protocole.

Remplacement

Le recours au modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les interactions entre alimentation, métabolisme, microbiote intestinal et inflammation impliquent des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits ni par des modèles in vitro, ni par des simulations in silico. Les paramètres étudiés (tolérance au glucose, sensibilité à l’insuline, régulation lipidique, réponses inflammatoires systémiques, modifications du microbiote) nécessitent un organisme entier dans lequel les systèmes digestif, immunitaire et métabolique et microbien, interagissent. Aucun modèle alternatif ne permet aujourd’hui de refléter fidèlement cette intégration physiologique. Le recours aux animaux est donc justifié scientifiquement et constitue la seule approche pertinente pour répondre à la question posée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant l’objectif de minimiser l’utilisation d’animaux. Une analyse de puissance satistiques indique qu’un effectif théorique de 12 animaux par groupe serait nécessaire. Nous choisissons d’utiliser 14 animaux par groupe, cet effectif correspond au standard utilisé dans l’unité pour les études nutritionnelles et métaboliques, où il permet régulièrement d’obtenir des résultats robustes malgré la variabilité biologique qui est relativement faible pour des animaux consanguins. Par ailleurs, toutes les mesures physiologiques (poids, prise alimentaire, glycémie, insulinémie, prélèvements sanguins, collectes fécales) sont réalisées longitudinalement sur les mêmes individus, ce qui maximise la quantité de données obtenues par animal et évite la constitution de groupes supplémentaires. Pour tester l'appétit des souris (procédure 1) nous utilisons un effectif minimal (6 animaux) puisque le but est juste de vérifier que les animaux mangent et ne perdent pas de poids. Ainsi, le design expérimental adopté permet de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire, tout en garantissant la validité et la robustesse des résultats. Nous ne testerons les effets des régimes que sur des souris de sexe mâle.

Raffinement

Les procédures ont été conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Les manipulations (pesées, collecte fécale, distribution des aliments) sont non invasives et réalisées avec une contention minimale, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné. Le stress généré par la pesée des animaux et des prélèvements sanguins seront limités du fait de leur mise en oeuvre dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes de sang prélevés. Les tests métaboliques (OGTT, ITT, OFTT) sont effectués par du personnel expérimenté, avec des jeûnes courts (4h à 12h) pour réduire le stress. Les animaux sont hébergés par 2 dans des cages enrichies à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et font l’objet d’une surveillance quotidienne. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement et les observations seront recueillies dans un fichier de suivi des souris (Annexe 1). Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 20 %, une léthargie marquée, un refus persistant de s’alimenter, une respiration anormale ou un comportement anormalement agressif persistant sera immédiatement retiré du protocole en accord avec le resposnable SBEA. Toute souffrance est anticipée par des points limites stricts (Annexe 2) ce qui conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique sous-cutané dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance ou si score de point limite supérieur à 22 (Annexe 2) a mise à mort sera proposée par le responsable SBEA et réalisée sous anesthésie générale profonde, garantissant l’absence de douleur.

Choix des espèces

Le modèle murin C57BL/6J est une lignée de souris est largement utilisé en recherche métabolique et nutritionnelle car il développe de manière reproductible une obésité, une altération de la tolérance au glucose, ainsi qu’une résistance à l’insuline lorsqu’il est exposé à un régime riche en sucre et graisse. Par ailleurs, le microbiote intestinal de la souris est l’un des plus étudiés en recherche préclinique, avec des signatures microbiennes bien référencées, ce qui en fait un modèle pertinent pour examiner les interactions nutrition–microbiote. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou alternatif ne permet actuellement de reproduire l’ensemble des interactions physiologique entre digestion, microbiote, immunité et métabolisme. Ce choix est donc scientifiquement justifié, cohérent avec les standards internationaux en nutrition/microbiote, et indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux à leur arrivée à l’animalerie auront 28 jours. À cet âge, les souris sont pleinement autonomes : elles ont achevé la transition alimentaire vers le solide, régulent correctement leur température corporelle et ne dépendent plus des soins maternels. A 35 jours de vie nous leur apporterons les différents régimes alimentaires à tester. A cet âge la croissance somatique des souris est presque stable et leur poids proche du plateau physiologique. Les régimes seront appliqués pendant 12 semaines. Les variations pondérales que nous observerons au cours du protocole reflèteront essentiellement des modifications de la composition corporelle — notamment l’accumulation de masse grasse induite par les différents régimes — et non la croissance physiologique normale des animaux. Ce stade post-sevrage avancé constitue également une période pertinente pour étudier la maturation du microbiote intestinal, qui est suffisamment structuré pour permettre l’analyse des interactions nutrition–microbiote, tout en restant sensible aux modifications alimentaires. Par ailleurs, les tests métaboliques tels que tolérance aux sucres et aux ainsi que les suivis physiologiques (poids, mesures des lipides plasmatiques) présentent à cet âge une fiabilité et une reproductibilité reconnues. L’utilisation d’animaux plus âgés ne permettrait pas d’évaluer l’impact des régimes durant les fenêtres critiques de maturation métabolique, tandis que l’utilisation d’animaux plus jeunes exposerait inutilement à des contraintes supplémentaires et obligerait à prendre en compte la croissance.

Greffées avec des cellules leucémiques humaines puis suivies par imagerie, 1 290 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit des injections répétées, jusqu'à sept séances de chimiothérapie, des prises de sang mensuelles et des ponctions de moelle osseuse au genou. Le projet étudie la distribution de cellules d'une leucémie de mauvais pronostic et la résistance aux traitements. Le porteur retient des souris immunodéprimées, qui acceptent la greffe de cellules humaines sans rejet, et écarte le poisson zèbre jugé trop éloigné du système sanguin des mammifères.

Objectifs

Sur la base de donn?es cliniques obtenues au laboratoire ? partir de patients atteints d?un cancer du sang d?un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de d?terminer l?implication, dans le processus de d?veloppement et de la r?sistance aux traitements de cette leuc?mie, de deux prot?ines retrouv?es dans les cellules malades de ces patients. Pour cela, nous d?velopperons un mod?le de greffe chez la souris de cellules de patients, qui expriment une prot?ine qui ?met de la lumi?re, et o? la pr?sence de ces deux prot?ines sera ?ventuellement modifi?e. Nous pourrons ainsi suivre la distribution des cellules leuc?miques dans la souris greff?e gr?ce ? des m?thodes d?imagerie du petit animal. Ce mod?le, s?il mime cette h?mopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les m?canismes responsables de la r?sistance aux traitements de ce type de leuc?mie chez l?Homme. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour d?velopper des th?rapies adapt?es ? ce sous-type particulier de leuc?mie lymphoblastique qui ?chappe aux th?rapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s?int?gre dans un projet de recherche translationnelle, ? partir d?observations cliniques, qui ont permis de mettre en ?vidence l?expression massive de deux prot?ines pour un sous-groupe particulier de patients atteints de cancer du sang de mauvais pronostic. Une meilleure compr?hension des m?canismes de d?veloppement de la maladie et de sa r?sistance aux traitements permettra d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Des mod?les murins nous permettront d?une part, de contr?ler l?expression des deux prot?ines et d??tudier les cons?quences de leur expression sur la distribution des cellules canc?reuse dans la moelle osseuse. Une meilleure connaissance des processus de diss?mination des cellules leuc?miques est n?cessaire pour d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques. Le projet d?crit ici est int?gr? dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autres, le criblage de mol?cules sur des lign?es cellulaires de patients de ce sous-groupe de leuc?mie pour identifier de nouveaux m?dicaments qui permettraient de cibler ces cellules leuc?miques particuli?res, et de gu?rir les patients.

Procédures

MODIFICATION : Les animaux seront soumis ? deux injections sur animal vigile. Pour les animaux trait?s par chimioth?rapie, 7 injections de produits de chimioth?rapies seront r?alis?es sur animal vigile au cours de la proc?dure par semaine (traitement sur 4 semaines). Pour suivre l??volution de l?h?mopathie attendue, 2 ? 12 prises de sang, ? raison d?une prise par mois ou au maximum deux pr?l?vements de moelle osseuse (r?alis?s sur animal anesth?si?, avec au minimum 2 mois entre les deux pr?l?vements), pourront ?tre r?alis?s sur la souris. Les souris seront anesth?si?es pour suivre la distribution des cellules qui ?mettent de la lumi?re dans un appareil d?di? apr?s une injection d'un produit de d?tection (3 injections / semaine). La dur?e des chaque geste ne d?passe pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite ? l?injection de cellules leuc?miques, les souris sont susceptibles de d?velopper une leuc?mie. La majorit? des effets d?l?t?res sera d?e ? l??mergence de cette maladie : l??tat de sant? des souris greff?es peut se d?grader rapidement, n?cessitant un suivi tr?s r?gulier. Les leuc?mies entrainent une forte perturbation de la formule sanguine : en cons?quence, elles perdent du poids et, dans les stades avanc?s, pr?sentent des signes de dyspn?e, d?an?mie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostr?es, avec un pelage non entretenu. L?imagerie de bioluminescence n?cessite l?injection de luciferine sur animal vigile et une anesth?sie des souris ce qui peut constituer une nuisance temporaire g?n?ralement bien support?e. La ponction de moelle osseuse ?tant r?alis?e au niveau du genou, la souris peut avoir des l?sions au niveau du cartilage qui peuvent provoquer des douleurs et perturber temporairement ses d?placements. Enfin, il existe toujours un risque d?infection ou d?inflammation au niveau des points de ponction ou d?injection.

Devenir

Les animaux seront mis ? mort ? la fin des proc?dures pour pr?l?vements et analyses ult?rieures sur les tissus pr?lev?s. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres exp?rimentations.

Remplacement

L?impact des modifications d?expression de CDX2 et/ou UBTF-ATXN7L3 sur la canc?rog?n?se et la distribution dans le corps de la souris des cellules leuc?miques avant et apr?s traitement chimioth?rapeutique sera ?tabli in vivo dans les mod?les murins de greffes. Ce mod?le permet le suivi de cellules leuc?miques dans leur environnement m?dullaire qui est un environnement complexe difficilement mod?lisable in vitro ou ex vivo, et dans un environnement extra-m?dullaire. Cette ?tude de la biodistribution des cellules leuc?miques n?cessite donc l?utilisation d?animaux vivants. Les ?tudes m?canistiques associ?es, non d?crites ici, seront r?alis?es ? partir de mod?les de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lign?es cellulaires en culture mais ne peuvent pas r?pondre aux questions abord?es par un mod?le murin in vivo dans lequel la distribution m?dullaire et extra-m?dullaire peut ?tre suivie et o? l?interaction avec les cellules de la niche est essentielle. L?utilisation d?un autre mod?le animal, par exemple le poisson z?bre, ne permettrait pas non plus de r?capituler la complexit? du syst?me h?matopo??tique des mammif?res.

Réduction

Les chiffres indiqu?s dans le dossier correspondent au nombre estim? maximal d?animaux utilis?s pour les exp?riences envisag?es. Le nombre d?animaux minimum et suffisant a ?t? d?termin? avec un outil math?matique ? 10 animaux par groupe au minimum pour obtenir des r?sultats robustes et fiables statistiquement. La possibilit? d?imager les animaux, d?analyser la num?ration sanguine des animaux par prise de sang et d?immunoph?notyper les cellules de moelle osseuse ponctionn?es au niveau du genou permet une ?tude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilis?s.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en groupes dans des conditions sanitaires contr?l?es et permettant un bien-?tre optimal dans des portoirs ventil?s (igloo, tubes de cellulose pour la fabrication des nids, balan?oires, liti?re d?poussi?r?e). Ils seront acclimat?s au moins deux semaines apr?s leur arriv?e ? l?animalerie et avant le d?but de toute proc?dure. Les proc?dures ont ?t? ?tablies afin de r?duire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux exp?rimentations. Une anesth?sie sera pratiqu?e pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveill?s quotidiennement durant les proc?dures. En cas de signes d?infection, la plaie sera trait?e avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analg?sique. Des points limites pr?coces ont ?t? d?finis afin d?interrompre les proc?dures et limiter la souffrance animale et garantir le bien-?tre animal.

Choix des espèces

L'esp?ce utilis?e est la souris (Mus musculus) qui repr?sente l?esp?ce animal la plus propice pour ce type d??tude pour les raisons suivantes : ?nombreux protocoles bien ?tablis pour cette esp?ce ?possibilit? d'avoir acc?s ? des animaux g?n?tiquement modifi?s, notamment permettant les greffes de cellules humaines sans rejet (animaux immunod?prim?s) ?mod?les mimant tr?s bien les cancers h?matologiques et qui ont d?j? fait l?objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilis?s car les potentielles applications th?rapeutiques s'adresseront ? une population humaine adulte.

Non pour répondre à une question scientifique mais pour maîtriser les gestes d'anesthésie et de chirurgie, 6 lapines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ovariectomie d'une à deux heures sous anesthésie, avec pose de cathéters et prélèvements de sang et d'urine. Le projet prépare un futur modèle de ménopause destiné à étudier les troubles cardiaques des femmes. Le porteur présente cette étape comme une mise en main du matériel et des bonnes pratiques avant une vraie étude.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que certains troubles du rythme cardiaque tels que la fibrillation auriculaire (FA) et l’insuffisance cardiaque (IC) diffèrent entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA (typiquement de 10 ans) et elles présentent des symptômes plus marqués et plus durables, avec un risque plus élevé et d'issues graves, notamment d'accident vasculaire cérébral. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Les mécanismes à l’origine des changements de la fonction cardiaque suite à la perte de signalisation des hormones sexuelles féminines sont encore peu connus. Un modèle animal chez le lapin nous présente l’opportunité d’étudier les mécanismes fondamentaux responsables de la sensibilité des femmes au développement de pathologies cardiovasculaires, en lien étroit avec la diminution des hormones sexuelles. Ce projet vise à encadrer la mise en place de ce nouveau modèle de ménopause, avec le but de maitriser les gestes et les bonnes pratiques d’anesthésie, de chirurgie et de suivi.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de maitriser les procédures et les bonnes pratiques sur un modèle de ménopause, pour, dans un deuxième temps, mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la survenue des maladies cardiaques, notamment de la fibrillation auriculaire et l’insuffisance cardiaque, pour permettre, à terme, une meilleure prise en charge des pathologies cardiaques chez les femmes et une meilleure prévention.

Procédures

Dans ce projet, 6 animaux seront traités. Chaque animal sera soumis à une opération chirurgicale. L’intervention sera réalisée en une seule fois (environ 1h-2h) sous anesthésie générale. Toute la procédure sera effectuée sous surveillance des paramètres vitaux. Au cours de la procédure expérimentale, des prélèvements sanguins (artère et veine) et urinaires seront réalisés sur chaque animal et sous anesthésie générale. Chaque prélèvement sera réalisé via la pose d’un cathéter adapté en fonction de l’abord artériel, urinaire et de l’abord veineux choisi, et ne durera que quelques minutes. Chaque animal fera ainsi l’objet d’un prélèvement urinaire, d’un prélèvement artériel ainsi que d’au moins un prélèvement veineux à trois reprises. Il s’agira donc de réaliser 1 prélèvement sanguin et urinaire en début de la phase 1, puis 1 prélèvement sanguin et urinaire en début et 1 prélèvement sanguin et urinaire en fin de la phase 2 de la procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels d’intensité modérée, peuvent apparaitre pendant la période intra-opératoire (1h- 2h), liés à l’anesthésie (hypoventilation, hypotension, hypothermie) et à la chirurgie (sensation de douleur, hémorragie; 1j-7j), ou pendant la période post-opératoire (désorientation, réactivité réduite, infection, réouverture de la plaie chirurgicale; 3j-15j). Les arrêts de transit peuvent être relativement fréquents en post-opératoire chez cette espèce, et seront pris en charge. De plus, des effets indésirables d’intensité modérée, peuvent survenir en post- opératoire, liés à l’implantation des équipements médicaux (réouverture de la plaie chirurgicale, infection; 3j-15j).

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire, moléculaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de la fibrillation auriculaire et de l’insuffisance cardiaque.

Remplacement

Le projet prévoit dans un premier temps, la réalisation des procédures chirurgicales sur des cadavres de lapines, permettant aux expérimentateurs d’acquérir une première maîtrise technique sans recours à l’animal vivant. En revanche, les processus d’anesthésie et d’analgésie ne peuvent être reproduits de manière satisfaisante sur des tissus inertes ou modèles cellulaires in vitro, et nécessitent le recours à un modèle animal vivant. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal pour cette étude. S’y ajoute qu’il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique pour répondre aux objectifs souhaités.

Réduction

Nous avons estimé un effectif total de 6 animaux pour l’ensemble de cette étude. L’ensemble des animaux sera mobilisé pour permettre la prise en main du matériel et l’acquisition des gestes peropératoires indispensables, notamment pour les techniques d’anesthésie et de chirurgie. La mise en place de ce nombre a été fixée de manière à permettre des ajustements expérimentaux et des vérifications de faisabilité, tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Il s’agit du nombre minimal d’animaux requis à la fois pour maitriser, d’après notre expérience, les gestes chirurgicaux, ainsi que pour estimer, au bout de la procédure, la variabilité des paramètres physiologiques et cardiaques mesurés entre chaque animal. Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux et dans le cadre d’une DAP scientifique suivante, nous allons quantifier les changements de la fonction cardiaque et la concentration de molécules d’intérêts et les comparer par des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. L’ensemble des animaux est hébergé par deux, entre animaux socialement compatibles, ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (bâtonnets à ronger et/ou foin ajoutés dans les cages, etc.). D’autre part, l’intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Des moyens pour éviter ou minimiser l’impact sur l’animal seront mis en place (protocole anesthésique et analgésique approprié, apport d’oxygène pendant toute la procédure, et contrôle de la voie aérienne, mise à disposition de tapis chauffants, maîtrise des saignements et vérification de ligatures et sutures et antibiotiques administrés pour prévenir l’infection). Pour faciliter le réveil, les animaux seront placés dans un environnement calme, chauffé et sous surveillance, afin de détecter rapidement toute complication éventuelle. Un suivi particulier sera porté à la bonne cicatrisation de la plaie pendant le post- opératoire (au moins 7 jours). Un examen clinique avec évaluation de l’état général, de la prise d’aliment, de l’activité et de la présence de la douleur sera réalisé pendant la période post-opératoire afin de détecter des possibles complications et de mettre en place les mesures thérapeutiques adaptées. Des critères d’alerte précis et des effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adéquates seront mises en place dans le plus court délai (administration d’un traitement contre la douleur ou bien augmentation des doses si un traitement est déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire désigné seront contactés pour la prise de décisions dans le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (brebis, porc, chèvre, chien, lapin), le lapin a été identifié comme le plus adéquat en tant que modèle animal bien connu et largement caractérisé dans des domaines variés de la recherche : •Cet animal présente également un fonctionnement cardiaque très proche de celui de l’être humain, notamment en termes de morphologies et de structures des cavités cardiaques et de réponse liée à l’activité électrique du cœur. Cette similarité en fait un modèle pertinent pour étudier les mécanismes d’action de différentes substances médicamenteuses sur le système cardiovasculaire. •Pour finir, notre étude inclut des femelles de 6 mois, car à cet âge elles permettent de reproduire de façon contrôlée une situation comparable à la ménopause chirurgicale chez la femme.

Mises sous régime gras dès le vingtième jour de vie, prélevées à la queue chaque semaine, soumises à des injections de glucose et d'insuline puis à une échocardiographie et à un cathétérisme cardiaque sous anesthésie, 965 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à comprendre comment l'obésité de l'adolescence perturbe la maturation du cœur et augmente le risque d'insuffisance cardiaque. Les retombées annoncées pour les patients, un diagnostic plus précoce et des pistes de prévention, restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cœur, et les mères sont tuées au sevrage parce qu'elles sont jugées trop âgées pour l'étude.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente. L’une de ses formes, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), concerne aujourd’hui plus d’un patient sur deux et pourrait représenter jusqu’à 80 % des cas d’ici 2035. Cette pathologie touche principalement les femmes âgées et se caractérise par une altération de la relaxation du cœur, sans modification de sa capacité de contraction. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif ou préventif efficace, en grande partie en raison d’une compréhension encore limitée des mécanismes biologiques impliqués. L’obésité constitue un facteur de risque majeur de l’ICFEp, près de 80 % des patients étant en surpoids ou obèses. Or, la prévalence de l’obésité augmente fortement chez les enfants et les adolescents. Pourtant, l’impact d’une obésité précoce sur le développement du cœur et sur le risque ultérieur d’insuffisance cardiaque demeure peu étudié. Nos travaux récents ont mis en évidence, chez la souris, une phase de développement cardiaque jusque-là méconnue, survenant après le sevrage, entre le 20ème (P20) et le 60ème jour (P60) de vie. Cette période est marquée par l’apparition de structures spécifiques au sein des cellules musculaires cardiaques, essentielles à la maturation de la fonction de relaxation. Leur altération ou leur absence est associée à une dysfonction diastolique conduisant au développement d’une ICFEp. De manière originale, nous avons montré que ces structures sont régulées selon le moment de la journée, suggérant un lien étroit entre développement cardiaque et horloge biologique. Nous avons également identifié un dimorphisme sexuel de ce développement, influencé par les hormones féminines, pouvant contribuer à la plus forte prévalence de l’ICFEp chez les femmes. La période P20–P60 chez la souris correspondant à l’adolescence et au début de l’âge adulte chez l’Homme, ce projet vise à étudier comment l’obésité perturbe le développement cardiaque durant cette fenêtre critique et augmente le risque de dysfonction cardiaque précoce. L’objectif est d’identifier des marqueurs précoces ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention et de traitement.

Bénéfices attendus

L’étude de l’impact d’un régime obésogène sur la maturation du cœur au cours de la transition adolescence–jeune adulte permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la perturbation du développement normal de la fonction cardiaque en situation pathologique. Ces connaissances sont particulièrement pertinentes dans un contexte où les régimes alimentaires riches en graisses et en sucres, de type « fast-food », sont de plus en plus répandus chez les adolescents. Les résultats de ce projet contribueront à l’identification de mécanismes précoces associés à la dysfonction cardiaque (ICFEp), susceptibles d’améliorer le diagnostic précoce et d’orienter une prise en charge plus personnalisée, en tenant compte des différences liées au sexe ainsi que des variations biologiques dépendantes du moment de la journée. À plus long terme, ces travaux pourraient participer à l’élaboration de stratégies de prévention visant à réduire le risque de développer une ICFEp à l’âge adulte.

Procédures

Dans le 1er établissement utilisateur, la 1ère intervention sur l’animal au 20ème jour de naissance est une anesthésie sous anesthésie gazeuse pour l’échocardiographie cardiaque. Ensuite, entre le 20ème (P20) et le 40ème (P40) jour de naissance, il y a un prélèvement à la queue sur animal vigile une fois par semaine (moins de 15sec chaque prélèvement). A P40, 2 tests métaboliques (espacés chacun d’une semaine) sont réalisés chez la souris. Cela implique, 1 injection d’insuline (moins de 15 sec) ou 1 injection de glucose (moins de 15 sec) en injection intrapéritonéale à l'aide d'aiguille 30G et neuf prélèvements à la queue pour chaque test selon la cinétique suivante : 15 minutes avant l’injection puis au moment de l’injection puis 15 min après l’injection et ainsi de suite toutes les 15 minutes jusqu’à 120 minutes (un total de 9 prélèvements). Au 60ème jours de naissance, l'échocardiographie nécessite une anesthésie gazeuse et une chirurgie est réalisée impliquant une injection intrapéritonéale avec une aiguille de 30G d’analgésie et 1 une injection sous cutanée au niveau du cou d'anesthésique à l'aide d'une aiguille de 30G. Dans le second établissement, l’euthanasie des souris implique, de la même manière, une injection d’analgésie (moins de 15 sec) au niveau de la cage thoracique en sous cutanées à l'aide d'une aiguille de 30G.

Impact sur les animaux

Lors de la mise sous régime à P20 : modifications digestives (diarrhée, constipation), modification comportementale (légère léthargie). Lors des échocardiographies doppler ou pendant le cathétérisme ventriculaire : une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Par ailleurs, lors de la dissection de la carotide commune lors de la cathétérisation, il est possible de léser des vaisseaux adjacents entraînant une hémorrhagie légère et un risque d'inconfort. Les effets indésirables potentiels liés aux expérimentations métaboliques : stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie, inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline ou glucose (une fois, durée max 15 sec), inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue et au niveau mandibulaire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux sont tous euthanasiés. Lorsqu'il est nécessaire, un prélèvement du cœur est effectué à des fins d’analyses cellulaires et moléculaires sous anesthésie profonde et analgésie, puis une méthode secondaire réglementaire d'euthanasie est utilisée pour la mise à mort. Les petits arrivant à 15 jours de naissance, ils sont avec leur mère qui est euthanasiée dés le sévrage. En effet, ces femelles sont trop âgées pour entrer dans notre étude.

Remplacement

Ces investigations doivent être réalisées sur des modèles animaux vivants, car elles nécessitent l’étude du cœur en fonctionnement. En particulier, l’impact d’un régime obésogène initié à l’adolescence (20 jours après la naissance) sur la fonction diastolique à l’âge adulte (60 jours après la naissance) ne peut être évalué que dans un organisme vivant, compte tenu de la complexité des mécanismes de développement cardiaque impliqués. Les altérations structurelles et fonctionnelles associées à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), ainsi que l’influence de facteurs environnementaux tels que l’alimentation ou l’alternance jour/nuit, ne peuvent être étudiées à l’aide de modèles alternatifs. Elles nécessitent à la fois des analyses fonctionnelles in vivo et, lorsque requis, un prélèvement cardiaque permettant un accès direct au tissu et à l’architecture des cellules contractiles cardiaques.

Réduction

L’équipe a développé une méthode de prélèvement cardiaque optimisée permettant de préserver au mieux l’architecture des cardiomyocytes, notre centre d’intérêt dans ce projet, et d’analyser un même échantillon par plusieurs techniques complémentaires. Cette approche optimise l’utilisation des animaux en permettant d’obtenir, à partir d’un seul animal, différents types de données structurales et fonctionnelles. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie fonctionnelle non invasives, telles que l’échocardiographie Doppler, permet de réaliser un suivi longitudinal de la fonction cardiaque, et ce avant le prélèvement terminal du tissu si nécessaire. Ainsi, un même animal peut être utilisé successivement pour des analyses fonctionnelles in vivo et pour des analyses tissulaires post-mortem. Ces stratégies expérimentales permettent de maximiser l’exploitation des données obtenues, de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire et de garantir une analyse statistiquement robuste et une évaluation complète de l'architecture cardiaque et de sa fonction, tout en tenant compte des différents facteurs biologiques étudiés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive 2010/63/UE, dans le respect des cinq libertés fondamentales. Des enrichissements du milieu (papier, carton, tunnels) sont fournis afin de favoriser la construction de nids, l’expression des comportements naturels, l’activité physique et les interactions sociales. Un test des pièces d’hébergement des animaux est effectué tous les 3 mois pour garantir leur statut sanitaire SPF. Une grille de suivi (grille de scoring de notre projet), élaborée en collaboration avec les zootechniciens, permet une surveillance régulière de l’état de santé des animaux et une adaptation rapide des conditions expérimentales si nécessaire, afin de limiter au maximum toute douleur, souffrance ou détresse (analgésie et anesthésie ont été définies pour éliminer toutes douleurs).

Choix des espèces

La souris constitue un modèle particulièrement pertinent pour nos études en raison de sa forte similitude avec la physiologie humaine, notamment pour les processus cardiaques. En effet, notre équipe a mis en évidence l’impact du jour et de la nuit sur la fonction cardiaque chez l’Homme et la souris, justifiant l’utilisation de ce modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à cette fonction et ses altérations. Par ailleurs, la majorité des travaux portant sur l’impact du sexe sur le fonctionnement cardiaque et sur l’impact de l’obésité ont été réalisés chez la souris, fournissant un cadre méthodologique et conceptuel solide. Ce modèle nous permet donc de poursuivre des recherches en cohérence avec la littérature existante et de capitaliser sur des données validées. Enfin, les techniques employées dans ce projet ont été optimisées pour la souris, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs spécifiques de chaque expérience, afin d’évaluer les effets du régime obésogène sur le développement et la fonction cardiaque. Au 20ème jour après la naissance, le cœur est encore en pleine maturation. Des processus essentiels, tels que la formation et la structuration des cardiomyocytes sont alors actifs. Ce stade est crucial pour étudier l’impact de facteurs environnementaux précoces, notamment alimentaires, sur le développement du cœur. Comme montré par notre équipe, ce stade de développement est déterminant pour la fonction cardiaque adulte. Au 60ème jour après la naissance, correspondant au jeune adulte, le cœur a terminé son développement structural et fonctionnel. Ce stade permet d’évaluer les conséquences du régime obésogène instauré précocement sur la fonction cardiaque et sur l’architecture des cardiomyocytes à l’âge adulte.

Soumises pendant douze semaines à un régime enrichi en graisse, à des injections quotidiennes et à des échocardiographies hebdomadaires sous anesthésie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet vise à préciser le rôle d'une enzyme, PIKfyve, dans la cardiomyopathie du diabète et à tester des pistes thérapeutiques. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seul le recours à un "organisme entier" permet de prévoir la réponse au traitement et conclut que la souris est "indispensable".

Objectifs

L’insuffisance cardiaque (IC) est l’une des premières causes de mortalité/morbidité dans le monde. Le diabète est une complication majeure de l’IC, et l’augmentation épidémique actuelle de l’obésité et du diabète font que la cardiomyopathie de type diabétique devient un problème majeur de santé publique, pour lequel les solutions thérapeutiques sont très limitées. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d’une enzyme spécifique dans le développement de la cardiomyopathie de type diabétique et également de tester de nouvelles thérapeutiques pour lutter contre cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle d’une enzyme dans la progression de la cardiomyopathie diabétique, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe. A long terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer les traitements existants et offrir de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrant de cette pathologie, réduisant ainsi la morbi-mortalité associée.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée enrichie en graisse pendant 12 semaines ; des examens hebdomadaires du cœur par échocardiographie (une fois par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié) ; des mesures de la composition corporelle (% masse grasse) réalisées en début et à la fin du protocole (sur animal vigile, 2 min par mesure) ; des injections journalières pendant 12 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile) ; des exercices physiques adaptés, en début et en fin de protocole (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en début, milieu et fin de protocole (intervention de 2h). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1.

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de protocole afin de permettre les prélèvements d’organes et leurs analyses, qui ne peuvent pas être réalisés sans mise à mort.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre les différents types cellulaires cardiaques, les systèmes vasculaire et immunitaire. Seul le recours à un organisme entier permet de prévoir la réponse thérapeutique à la molécule testée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de caractéristiques du développement de la pathologie (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires). Ceci permettra de limiter au maximum le nombre de souris utilisées au final.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Les échocardiographies seront réalisées sous anesthésie légère avec maintien thermique et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, perte de poids. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé pour les études sur l’insuffisance cardiaque et le plus représentatif de la pathologie humaine. Ainsi, les résultats obtenus seront plus facilement transposables à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge de 2 mois, correspondant à un stade jeune adulte, adapté aux objectifs de l’étude.