Système cardiaque

Sept prélèvements de sang en trois semaines après une injection unique de dérivés perfluorés : 16 cochons juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'objectif déclaré est de savoir si le PFOB commercial, employé comme agent de contraste ou substitut sanguin, aboutit à la présence de PFOA dans le sang. Le porteur reconnaît que l'effectif de quatre animaux par groupe n'a pas été calculé et repose sur le caractère semi-quantitatif de l'étude. Les cochons ne peuvent pas être gardés en vie parce qu'ils risqueraient d'excréter ces PFAS dans l'environnement, et l'espèce a été retenue pour sa masse graisseuse où ces composés s'accumulent.

Objectifs

Le bromure de perfluorooctane (PFOB) est un liquide utilisé pour de nombreuses applications médicales comme agent de contraste, comme substitut sanguin ou comme agent principal lors de ventilation liquidienne totale. En raison de son processus de synthèse industrielle, le PFOB dans sa forme commerciale peut contenir des résidus d’iodure de perfluorooctane (PFOI) ou de perfluorooctane hydroxylé (PFOH). Ces deux composés pouvant potentiellement se transformer lentement dans l’atmosphère, en présence d’un rayonnement infrarouge, en acide perfluorooctanoïque (PFOA) qui est un composé dérivé des substances perfluoroalkylées et polyfluoroalkylées (PFAS), il est nécessaire de savoir si le PFOB commercial peut aboutir à la biosynthèse de PFOA in vivo. Cela permettra d’évaluer le potentiel toxique de ce composé commercial sur les patients traités et d’envisager éventuellement une stratégie de purification du PFOB commercial. Ces substances sont en effet aujourd’hui au centre des préoccupations en termes de toxicologie pour leur persistance dans l’organisme. Leur demi-vie d’élimination est en effet très longue (plusieurs années pour le PFOA) et ils peuvent présenter une toxicité hépatique. L’objectif est donc d’évaluer si le PFOB commercial peut aboutir à la présence de PFOA dans le sang et de déterminer l’origine (PFOB, PFOI et/ou PFOH) de ce PFOA éventuel. Un objectif secondaire de cette étude est de déterminer les paramètres pharmacocinétique de ces molécules dans le sang des animaux. Pour cela, les animaux recevront une injection de PFOB commercial ou une injection de PFOB pur ou une des deux impuretés principales (PFOI et PFOH) purs. Chez ces animaux, le PFOB, PFOI et PFOH et la présence de PFOA seront ensuite dosé toutes les semaines dans le sang pour déterminer si le PFOB commercial peut mener à la production de PFOA et l’origine de cette production de PFOA.

Bénéfices attendus

Nous évaluerons la présence de PFOA dans les 4 groupes afin d’évaluer la cinétique de biotransformation éventuelle en PFOA des différentes molécules injectées.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse unique de dérivés perfluorés dilués dans 1ml et à des prises des sang régulières (7 prélèvements de sang sur 3 semaines). La durée de l’injection sera de l’ordre de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les composés dérivés des PFAS sont des molécules présentant une toxicité très chronique (plusieurs années). La durée d’étude du présent protocole rend très improbable l’observation du moindre effet clinique des composés utilisés. Néanmoins, lors de l’injection si un effet délétère est observé (crise convulsive) alors nous considérerons cette observation comme un point limite et l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole, en effet, les composés administrés appartiennent à la classe des PFAS et peuvent constituer un risque de pollution environnementale. Il n’est donc pas possible de garder les animaux en vie en raison du risque d’excrétion de ces molécules dans l’environnement

Remplacement

La pharmacocinétique est une science intégrant l’ensemble de l’effet des organes sur le devenir des molécules. Il est donc impossible de reproduire l’intégralité des phénomènes pharmacologiques ou toxicologiques in vitro (absence de Remplacement possible). L’étude de la biotransformation de molécules doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Afin de mesurer la présence ou non de PFOA et d’établir des critères permettant de caractériser la pharmacocinétique, le projet sera constitué de 4 animaux dans chaque groupe. Le nombre d’animaux utilisé n’a pas été calculée mais repose sur le fait qu’il s’agit d’une étude descriptive semi-quantitative pour laquelle le critère primaire est la présence ou non de PFOA dans le sang. Avec ce nombre d’animaux, nous pourrons établir des ordres de grandeur de paramètres pharmacocinétique sans pour autant déterminer précisément leurs valeurs, ce qui n’est pas l’objet du projet. La variabilité attendue d’après les résultats de la littérature est relativement faible et nous estimons que 4 animaux par groupe (2 mâles et 2 femelles) permettront aussi de mettre en évidence des variabilités du métabolisme lié au sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes collectifs, par groupes de 4 animaux, avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Tout au long de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter une éventuelle prostration ou une baisse de l’état général. Afin d’éviter que les prises de sang constituent une source de stress trop importante pour les animaux, une sédation sera mise en place. La procédure n’étant pas douloureuse, aucune analgésie n’est envisagée. Lors de l’injection des molécules, si un effet délétère est observé alors nous considérerons cette observation comme un point limite et l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme (notamment au niveau du métabolisme des xénobiotiques) et de la répartition de sa masse graisseuse qui peut constituer un tissu préférentiel d’accumulation des composés perfluorés. D’autre part, la taille de ces animaux permet de rendre possible des prélèvements sanguins aussi importants qui ne pourraient pas être réalisés chez d’autres espèces plus petites. Nous utiliserons des porcs juvéniles de 30 kg car ce poids facilite la manutention de l’animal et ce jusqu’à la fin du projet en considérant la prise de poids durant 21 jours.

300 souris subissent une chirurgie unique sous anesthésie provoquant un accident vasculaire cérébral, ischémique ou hémorragique selon le groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite observées six ou vingt-quatre heures, avec deux prélèvements de sang et deux évaluations neurologiques, puis tuées pour doser des biomarqueurs et mesurer le volume de la lésion cérébrale. Le porteur reconnaît que certaines présentent après l'opération une fatigue, une perte de mobilité ou des difficultés à se nourrir pouvant durer jusqu'à la fin de la période d'observation. Il écrit que, malgré plus de vingt ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible n'explique l'évolution de ces marqueurs, et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une urgence médicale majeure et constitue l’une des principales causes de décès et de handicap dans le monde. Parmi les AVC, ceux causés par un caillot qui bloque une grosse artère dans le cerveau (appelés AVC ischémiques) peuvent bénéficier de traitements efficaces. Cependant, même avec une prise en charge rapide, plus d’un patient sur deux reste dépendant trois mois après l’AVC. Le facteur le plus important pour améliorer les chances de récupération est le temps : chaque demi-heure de retard augmente considérablement le risque de décès ou de séquelles. Or, avant d’initier un traitement, les médecins doivent réaliser une imagerie (scanner ou IRM) pour vérifier s’il s’agit d’un AVC ischémique (avec occlusion d’une artère) ou hémorragique (avec saignement d’une artère), car les traitements sont opposés selon le type. Ce délai d’attente est donc un obstacle majeur. Des travaux récents ont identifié des molécules présentes dans le sang (biomarqueurs) qui pourraient permettre de reconnaître rapidement le type d’AVC. Mais ces biomarqueurs n’ont pas encore été testés dans des conditions permettant leur utilisation fiable en pratique. En particulier, on ne connaît pas leur évolution dans le temps ni leur réponse spécifique selon le type d’AVC. Ce projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, l’évolution de ces biomarqueurs dans des modèles expérimentaux d’AVC ischémique et hémorragique. Grâce à un environnement contrôlé, il sera possible de mieux comprendre leur comportement dans le temps et d’identifier ceux qui permettent de différencier rapidement les types d’AVC. À terme, ces résultats pourraient contribuer au développement d’un test sanguin rapide chez l’humain, utilisable dès les premiers instants, pour orienter plus vite les patients vers le bon traitement, et ainsi diminuer la mortalité et le risque de séquelles neurologiques sévères après un AVC.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet cherche à repérer des marqueurs biologiques dans le sang qui réagissent très tôt après un accident vasculaire cérébral (AVC). L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans le corps dès les premières heures, et de voir si certains marqueurs sanguins permettent de faire rapidement la différence entre les deux grands types d’AVC : l’AVC ischémique (lié à un caillot) et l’AVC hémorragique (lié à une rupture de vaisseau). Cette phase permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes de l’AVC et d’identifier des éléments utiles pour améliorer le diagnostic dans les services d’urgence. À long terme, ces découvertes permettront de créer un outil de diagnostic simple et rapide, basé sur un test biologique réalisable dès la première prise en charge du patient. Cet outil pourra : •Accélérer la mise en route du bon traitement, ce qui est essentiel car chaque minute compte. Un gain d’une heure pourrait réduire d’environ 20 % les risques de décès ou de handicap. •Orienter le patient directement vers le service le plus adapté à sa situation (urgences classiques, service spécialisé, salle d’imagerie interventionnelle), en évitant les pertes de temps liées à des transferts inutiles. À plus long terme, ce système pourrait aussi être intégré dans les études cliniques testant de nouveaux traitements, pour pouvoir les administrer plus tôt et de façon plus ciblée. En résumé, ce projet a pour but d’améliorer la rapidité et la précision du diagnostic des AVC, ce qui bénéficiera directement aux patients en augmentant leurs chances de survie et de récupération. Il contribuera aussi à une meilleure organisation des soins d’urgence et à une avancée importante dans le domaine des maladies neurologiques.

Procédures

Le projet sera mené sur 300 souris, réparties en quatre groupes correspondant à différents modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). Chaque souris sera observée et suivie selon une organisation identique comprenant une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours, un examen de base avant l’intervention durant 5 minutes et une prise de sang de très faible volume. Chaque souris sera utilisée pour une unique intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie durant moins de 20 minutes. Ensuite elle sera observée pour une durée de 6h ou de 24h où elle subira deux prélèvements veineux durant moins de 10 secondes et deux évaluations cliniques durant moins de 5 minutes sans aucune contention prolongée.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines interventions peuvent entraîner un inconfort ou des effets secondaires chez les souris, mais toutes les procédures sont encadrées et réalisées dans le respect du bien-être animal. Les tests neurologiques réalisés après l’intervention peuvent provoquer un léger stress, mais celui-ci est de très courte durée. Les prélèvements de sang effectués sur des animaux éveillés peuvent entraîner un bref inconfort, comparable à une piqûre, mais ils sont très courts et les volumes prélevés sont minimes. De même, les injections (sous la peau ou dans l’abdomen) peuvent provoquer un léger inconfort au moment de l’acte, mais la douleur est passagère. Concernant les chirurgies pratiquées dans ce projet, une douleur modérée et transitoire est possible au niveau de la zone opérée. Après la chirurgie, certains animaux peuvent présenter une gêne neurologique : fatigue, perte de mobilité ou difficultés à se nourrir. Ces effets sont surveillés et pris en charge, mais peuvent durer jusqu’à la fin de la période d’observation. Dans tous les cas, des traitements antidouleur adaptés sont administrés, et des critères précis sont mis en place pour limiter toute souffrance inutile. Les animaux sont étroitement surveillés tout au long de l’étude, et toute détresse conduit à une intervention immédiate.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort à un temps défini dans le cadre d’un recueil d’organes et de tissus (sang, cerveau) nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. La mise à mort est indispensable pour l’analyse biologique (dosage de biomarqueurs), histologique (analyse du volume lésionnel) et immuno-histochimique (étude de l’expression et de la localisation tissulaire des protéines d’intérêt).

Remplacement

À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant de répondre à la question scientifique posée sans recourir à l’expérimentation animale. Malgré plus de 20 ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible ne permet d’expliquer de manière précise et fiable comment évoluent certains marqueurs biologiques après un accident vasculaire cérébral (AVC). Les modèles développés en laboratoire (sur cellules, dits "in vitro") ne permettent pas non plus de reproduire l’ensemble des mécanismes complexes qui se déclenchent lors d’un AVC, comme les réactions inflammatoires, la coagulation, les atteintes des vaisseaux sanguins ou encore la souffrance neuronale. Les modèles animaux, en particulier chez la souris, sont aujourd’hui les seuls à permettre une reproduction fidèle de ce qui se passe dans le corps humain lors d’un AVC, que ce soit par obstruction d’un vaisseau ou hémorragique (saignement cérébral). Ces modèles sont déjà largement utilisés pour comprendre la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques. En l’absence d’alternative fiable chez l’humain ou en laboratoire, l’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour répondre à la question posée dans ce projet de recherche, dans le but de mieux comprendre la maladie et d’améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs stratégies ont été mises en place. Les marqueurs étudiés ont été directement sélectionnés à partir de données humaines déjà disponibles, issues de grandes bases cliniques, d’analyses de la littérature scientifique et de tests réalisés sur du sang de patients. Ensuite, chaque souris incluse dans le protocole permettra d’obtenir plusieurs prélèvements de sang à différents moments, ce qui évite d’utiliser un animal par point de mesure. Grâce aux progrès des techniques de laboratoire, de très faibles volumes de sang (quelques microlitres) suffisent désormais pour analyser les marqueurs recherchés. Ces prélèvements sont réalisés selon les recommandations internationales, sans dépasser les seuils autorisés. Enfin, un calcul précis du nombre de souris nécessaires a été réalisé avant le début du projet grâce à une évaluation statistique, pour s’assurer que chaque animal utilisé est indispensable. Grâce à l’organisation choisie, ce protocole permet de réduire d’environ deux à trois fois le nombre de souris qui aurait été nécessaire avec une approche classique. L’ensemble de ces mesures permet de respecter les principes éthiques de la recherche animale et de limiter son impact tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Avant toute procédure susceptible d’induire une douleur modérée, une analgésie préventive sera administrée. Une crème ou un spray anesthésique local sera également appliqué afin d’engourdir la zone traitée et de limiter l’inconfort au réveil. Les souris seront ensuite installées dans une chambre chauffée pour favoriser un réveil confortable. Les animaux auront un accès permanent à l’eau et à une alimentation adaptée, notamment sous forme gélifiée après l’intervention pour favoriser leur récupération. L’état de santé sera surveillé de manière rigoureuse grâce à des grilles d’évaluation précises, permettant de détecter toute douleur ou signe de détresse. Ces évaluations porteront à la fois sur le comportement de l’animal et sur ses capacités motrices. En cas de douleur mal soulagée ou de signes de souffrance importants, l’application de points limites stricts et spécifiques au projet sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Tous tués en fin de protocole pour le prélèvement du cœur et des tissus, 488 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension leur est induite par une mini-pompe implantée sous la peau sous anesthésie générale, puis leur fonction cardiaque est suivie par deux échocardiographies. Dans certains groupes, une mort encéphalique est provoquée sous anesthésie profonde, avec des perturbations physiologiques importantes attendues en péri-mortem. L'objectif est d'élargir les critères de sélection des donneurs de greffons cardiaques humains, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre état hypertendu, conservation du greffon et reperfusion, ce qui rend selon lui le recours au rat "nécessaire".

Objectifs

La transplantation du cœur est souvent limitée par le nombre de cœurs disponibles. Pour pallier cette pénurie, les médecins utilisent parfois des cœurs dits « à risque », provenant de donneurs plus âgés ou ayant certaines maladies, comme l’hypertension artérielle. L’hypertension artérielle peut provoquer un épaississement de la paroi du cœur, rendant le tissu plus fragile lors de la transplantation. En effet, le cœur subit deux étapes critiques : le prélèvement, lorsqu’il est privé d’oxygène, et la réimplantation, lorsqu’il est à nouveau oxygéné. Ces phases peuvent provoquer des dommages aux cellules cardiaques, surtout si le cœur est déjà affaibli. Au niveau cellulaire, certaines protéines, comme YAP1, aident le cœur à résister au stress et à survivre aux contraintes. Des recherches récentes montrent que réguler cette protéine pourrait protéger les cellules cardiaques et améliorer le fonctionnement des cœurs transplantés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer, dans un modèle préclinique de rat hypertendu représentant des cœurs à critères élargis, comment une conservation contrôlée à température modérée (15–20 °C pendant 20 h), associée à une modulation ciblée d’une voie de signalisation spécifique, peut préserver la structure et la fonction du muscle cardiaque. L’ambition est de limiter les dommages cellulaires et tissulaires provoqués par la privation temporaire de sang (ischémie) et son rétablissement oxygéné (reperfusion) lors de la transplantation. L’hypertension chronique rend le cœur particulièrement vulnérable à ces lésions, aggravant la dysfonction du greffon et réduisant à la fois sa durée et la qualité de conservation. Les bénéfices attendus comprennent : • L’identification de nouvelles stratégies pharmacologiques ou combinatoires capables d’améliorer la tolérance des greffons cardiaques aux contraintes de la transplantation ; • La limitation de la perte fonctionnelle après greffe ; • L’élargissement potentiel des critères de sélection des donneurs, augmentant ainsi le nombre de cœurs disponibles. Enfin, ces résultats pourraient servir de base pour l’optimisation des solutions de conservation et le développement de traitements ciblés pour les greffons à critères élargis. Cette approche combinée devrait, à terme, améliorer la qualité des greffons, réduire les complications liées à l’ischémie-reperfusion et renforcer les résultats cliniques des transplantations cardiaques.

Procédures

Le protocole s’étendra sur 4 semaines. Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les groupes expérimentaux. L’hypertension artérielle sera induite par implantation sous-cutanée d’une mini-pompe, réalisée sous anesthésie générale (30–45 min). La fonction cardiaque sera suivie par deux échocardiographies non invasives (10–15 min), réalisées à 2 semaines d’intervalle sous anesthésie légère. Dans certains groupes, une mort encéphalique sera induite sous anesthésie générale profonde (30–60 min).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent principalement : - Induction de l’hypertension : inconfort local et douleur transitoire au site opératoire, avec une mortalité péri-opératoire faible mais possible, liée à des complications anesthésiques ou chirurgicales. - Examens échographiques : stress léger et de courte durée lors de l’induction et du réveil. - Induction de la mort encéphalique sous anesthésiée : des perturbations physiologiques importantes sont attendues en peri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de permettre la récupération des organes et tissus pour les analyses fonctionnelles, cellulaires et moléculaires. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale profonde, conformément aux recommandations vétérinaires et aux normes éthiques, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance.

Remplacement

Avant de recourir au modèle animal, la solution et la température optimale de conservation ont été testées sur des modèles cellulaires dans notre laboratoire, avec des résultats concluants. Cependant, aucun modèle in vitro ou alternative non animale ne permet de reproduire l’interaction dynamique entre l’état hypertendu, la conservation du greffon et la reperfusion, incluant les réponses systémiques, cellulaires et mitochondriales. Le rat est donc choisi comme modèle car il permet de reproduire de manière fiable et contrôlée l’hypertension induite par infusion d’Angiotensine II, ainsi que la physiopathologie complexe de la mort encéphalique. Cette approche est nécessaire pour répondre aux objectifs précliniques du projet et garantir la pertinence translationnelle.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Par ailleurs, les animaux de la première étape du projet seront intégrés aux groupes contrôles de la suite du projet. Le projet est organisé par étape de validation successives et seuls les paramètres optimaux sont appliqués d’une étape à l’autre.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur ou souffrance, les injections et prélèvements seront effectués sous prémédication analgésique associée à une anesthésie locale. Les examens échographiques seront réalisés sous anesthésie générale afin de garantir l’absence de stress ou d’inconfort. Les interventions chirurgicales seront menées sous anesthésie générale, précédée d’une prémédication analgésique administrée par voie sous-cutanée. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque type de procédure ont été définis, afin de garantir une prise en charge rapide en cas de signes de douleur, de détresse ou de complication.

Choix des espèces

Le rat est utilisé car ses cœurs isolés perfusés ont été largement étudiés et les voies de signalisation ciblées dans cette étude sont conservées chez l’homme. Les jeunes adultes (250–450 g) permettent de reproduire les altérations cardiovasculaires observées chez les patients hypertendus, offrant un modèle pertinent pour évaluer l’effet de la modulation des voies étudiées sur la fonction cardiaque et l’intégrité du tissu après conservation et reperfusion.

Injectées deux fois par semaine pendant huit semaines sur animal vigile, saignées quatre fois sur la même période, puis anesthésiées pour un temps de saignement mesuré jusqu'à trente minutes, 448 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles ont été génétiquement modifiées pour développer un lupus et présentent dès huit semaines perte de poids, défaut de toilettage, gonflements articulaires et inflammation des reins. Le traitement testé cible les plaquettes sanguines, dont le nombre chute chez les personnes atteintes de lupus, et l'étude mesure son effet sur l'arrêt du saignement. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur décrivant des procédures invasives et terminales incompatibles avec un réveil, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune (le système de défense de l’organisme s’attaque aux constituants normaux de l’organisme) responsable d’une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des lésions d’organes avec présence d’une inflammation généralisée. L’objectif de notre étude est de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement suite à une lésion et les fonctions des plaquettes sanguines. La thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes) et l’activation plaquettaire sont fréquemment observées chez les patients présentant un lupus, contribuant à des complications de type formation d’un caillot sanguin et hémorragie, ainsi qu’à des atteintes de la peau et des reins. Les plaquettes activées favorisent leurs interactions avec les globules blancs ce qui amplifie la pathologie. Il est proposé aujourd’hui d’utiliser un traitement ciblant les plaquettes sanguines afin de diminuer leur capacité à former des agrégats et à interagir avec les globules blancs, prévenant ainsi l’inflammation et la réduction du nombre de plaquettes dans le cadre du lupus. Néanmoins, l’effet de ce traitement sur l’arrêt du saignement, les fonctions plaquettaires ainsi que sur la réduction du compte plaquettaire associés au lupus est à ce jour peu décrit. Comprendre l’impact du lupus sur l’arrêt du saignement et la fonction plaquettaire permettra d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des traitements dans le cadre du lupus.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement et les fonctions plaquettaires. Cela permettra d’identifier de nouveaux traitements qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus et donc leur qualité de vie.

Procédures

Un lot d’animaux sera soumis à un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 prélèvements sanguins sous anesthésie : l’un d’une durée de 5 minutes, l’autre de 20 minutes. Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile) et un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile), 4 prélèvements sanguins sur ces 8 semaines (durée de 5 minutes chacun, animal anesthésié) et 1 prélèvement sanguin d’une durée de 20 min sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux atteints de lupus présentent, aux alentours des 8 semaines de vie, une perte de poids, un défaut de toilettage, des gonflements articulaires et ganglionnaire, ainsi qu’une inflammation des reins provoquant une présence de protéines dans les urines, ce qui est caractéristique des maladies auto-immunes. Le traitement testé pourrait réduire les signes de la maladie. Les procédures réalisées peuvent également induire des nuisances : >Anesthésie : impact sur le rythme respiratoire >Prélèvements sanguins : risque de douleur modérée et de saignement au site de prélèvement >Injection : durcissement de la peau et lésion au site d’injection

Devenir

Les procédures expérimentales réalisées sont invasives et terminales, ce qui ne permet pas le réveil des animaux sans induire une forme de souffrance incompatible avec leur bien-être. Par conséquence, à la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort selon les méthodes réglementaires. Après la mise à mort, leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Remplacement

Les fonctions plaquettaires ainsi que l’arrêt du saignement sont des processus particulièrement complexes, faisant intervenir plusieurs types de cellules ainsi que des conditions physiques (pression artérielle, flux sanguin). Les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles cellulaires humains permettant d’étudier le lupus et capable de générer assez de plaquettes pour les analyses prévues.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum tout en permettant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, du fait d’une différence de sévérité du lupus en fonction du sexe de l’animal, les données obtenues pour les femelles et les mâles seront analysés séparément. A la fin des procédures, les souris seront mises à mort, puis leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Une acclimatation de 14 jours ara lieu entre l’arrivée des animaux à l’animalerie et leur utilisation. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : >Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (tissu, tunnel, …), >Par une anesthésie avant et pendant les procédures expérimentales, >Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales > Les souris avec un phénotype impactant la qualité de vie auront accès à de la nourriture sous forme de pâté, ainsi qu’à de l’eau gélifiée. Elles seront suivies 3x par semaine pour détecter tout inconfort. Les souris atteignant un point limite seront soustraite à l’expérimentation. Durant toutes les procédures, les animaux seront suivis par un personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’un mammifère proche de l’Homme pour sa physiologie et ce modèle de souris génétiquement modifié se rapproche fortement de la pathologie humaine. Nous utiliserons dans ce projet des souris mâles et femelles de manière équilibrée, car une différence dans le développement de la pathologie est attendue entre mâle et femelles. A partir d’environ 8 semaines d’âge, les souris présenteront la maladie, associée à une thrombopénie. Le traitement testé dure 8 semaines. De plus, il est nécessaire que les individus aient un poids suffisant. Les animaux utilisés dans ce projet auront donc entre 7 et 16 semaines d’âge, ce qui correspond à un stade adulte, tout en évitant les effets liés au vieillissement.

L'automutilation, les vocalisations ou l'agression des petits par la mère déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort. 806 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les vingt-quatre premières heures de vie, les ratons passent quatorze jours en atmosphère hyperoxique pour reproduire l'hypertension pulmonaire des grands prématurés, leurs mères échangées tous les jours pour épargner à elles seules la toxicité de l'oxygène, avant des échographies cardiaques, des mesures de pression et une pléthysmographie invasive sous anesthésie. Le porteur justifie la cotation modérée par le fait que les animaux ne seront pas soumis à l'effort, seule situation où la gêne respiratoire s'exacerbe selon lui.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons un modèle animal (rats) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (J15 etJ60 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence l’effet thérapeutique de deux molécules pharmacologiques ciblant cible thérapeutique. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme avec un rapport bénéfice- risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. Des substances pharmacologiques dirigées vers la cible thérapeutique seront injectées soit en intranasal soit en intrapéritonéal pour le protocole préventif et pour le protocole curatif. Après 14 jours, une partie des ratons sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du tissu. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du tissu. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le tissu. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60 jours. Durant cette période, les animaux auront une échographie cardiaque sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole jusqu’à J60. Ainsi, les animaux explorés à J60 auront au total 2 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue du protocole, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la survenue de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Etant donné que les substances pharmacologiques sont déjà utilisées en clinique, on ne s’attend pas à l’observation d’effets secondaires importants. Globalement, les nuisances suivantes seront surveillées par les expérimentateurs ou les animaliers : Anesthésies répétées Concentrations potentiellement toxiques en oxygènes Points d’injections à répétition Prise de poids ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer les tissus pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie le poumon gauche, une planification des expériences sera établie pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal et enfin des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales en culture exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre chercheurs/enseignant-chercheurs statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur le modèle de ratons HTP-DBP donc l’utilisation des animaux contrôles pourra être optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires afin d’utiliser tous les tissus disponibles. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). Nous avons besoin de 6 lots différents par condition car les expériences doivent être réalisées sur différentes lots et nos expériences nécessitent de conditionner les poumons différemment, de plus étant donné la petite taille des poumons, nous avons besoin de plusieurs poumons pour réaliser toutes les expériences avec un nombre d’expériences entre 6 et 9 en fonction des expériences. L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire et en accord avec les données de la bibliographie. Le nombre d’animaux sera ensuite réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12 ratons et 1 rate seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement par les expérimentateurs ou les animaliers et conservés sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. Différents paramètres physiologiques (courbe de poids, piloérection, détresse respiratoire) seront surveillés. Un arrêt de la courbe de croissance ou une baisse de poids corporel prolongé dans le temps et non réversible, un comportement anormal des animaux (vocalisation, comportement malveillant vis-à-vis des bébés, automutilation) ou des signes de détresse respiratoire conduiraient à un arrêt du protocole et à la mise à mort de l’animal. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et seront pesés tous les deux jours. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal. L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques, un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduiraient à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. De plus, le rat est particulièrement adapté pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux.