Système cardiaque

2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

Soumis à une ligature d'artère coronaire de vingt-cinq minutes qui leur provoque une insuffisance cardiaque, 404 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois mois plus tard, une fois la défaillance installée, ils passent quelques jours exposés à une chaleur de type canicule, avec cinq échocardiographies et quatre épreuves d'effort, et 40 % d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour l'implantation d'un capteur de télémétrie. Le calcul des effectifs intègre la mortalité attendue dans ce modèle. Le porteur décrit pourtant des "examens non douloureux" et un "environnement sécurisé et surveillé", et présente le projet comme un moyen de mieux protéger les personnes fragiles pendant les fortes chaleurs.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront différentes interventions, principalement dans un but d’observation ou de mesure. Certaines procédures sont non invasives, comme les échocardiographies (5 fois, 15min max, espacées d'au moins 48h) ou l’évaluation à l’effort (4 fois, 30min max, espacées d'au moins 72h). D’autres sont plus invasives, comme la pose de puces sous-cutanées pour suivre la température ou la pression artérielle (1 seule injection, 2 min max), ou une chirurgie d’implantation de capteur de télémétrie pour effectuer les mêmes mesures (1 seule intervention de 35min concernant 40% des animaux maximum). La mise en place du modèle d’insuffisance cardiaque est obtenue par chirurgie de ligature coronaire sous anesthésie générale avec gestion de la douleur péri et post-opératoire (1 seule intervention de 25min concernant tous les animaux). Tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et selon les normes éthiques en vigueur, avec un suivi rigoureux du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront exposés à certaines contraintes liées à leur état de santé, à la chaleur ambiante ou aux examens nécessaires. Les principales nuisances prévues sont : une tolérance réduite au stress, un risque modéré lié à la chaleur (perte d’appétit, fatigue, aggravation cardiaque), une à deux chirurgies espacées d'au moins 3 mois (avec antidouleurs adaptés), et des examens répétés mais non douloureux (échographies, suivi de la température).

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque.

Remplacement

Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection réduite. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : tout d'abord, l'utilisation d'outils statistiques pour déterminer les effectifs minimum permettant l'obtention de données robustes, la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place pour garantir le bien-être des animaux et limiter toute souffrance. Des critères cliniques stricts sont utilisés pour évaluer l'état de santé des animaux, permettant d'interrompre toute procédure en cas de signes de souffrance et d'opter pour une euthanasie anticipée si nécessaire. Les interventions stressantes sont réparties de manière à éviter les cumuls sur un même animal, et l'hébergement des animaux en condition de "canicule" est limité dans le temps, avec un suivi clinique renforcé et des aménagements pour améliorer leur confort. De plus, l'utilisation de thermopuces pour la surveillance thermique réduit le besoin d'interventions chirurgicales, et les éventuelles chirurgies, telles que l'implantation de dispositifs de télémétrie, sont réalisées sous anesthésie appropriée, avec des soins analgésiques avant et après l'intervention. Enfin, un suivi clinique rigoureux est effectué pour assurer la santé des animaux tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats Wistar, est motivé par plusieurs facteurs. Les rats Wistar sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. Au début du projet, les animaux seront âgés de 8 semaines. Ce modèle récupère bien d’une chirurgie réalisée au cours de leur 10ème semaine de vie, présentent une insuffisance cardiaque 3 mois après cette chirurgie, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, choisies pour leur incapacité à rejeter des cellules humaines. 1 120 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules souches du sang humaines modifiées par thérapie génique, après un conditionnement qui leur fait perdre du poids, et un prélèvement sanguin qui peut leur léser un œil. La mise à mort sert à récupérer leur moelle osseuse et à mesurer si les cellules injectées s'y sont installées, l'enjeu déclaré étant d'évaluer la toxicité à long terme de ces modifications avant leur passage chez des patients.

Objectifs

Parmi les méthodes thérapeutiques modernes, on retrouve la greffe de cellules souches sanguines (CSH). Le but est de permettre l’installation de ces cellules dans la moelle osseuse des patients au sein de « niches », où elles pourront produire de nouvelles cellules fonctionnelles et saines nécessaires à la personne traitée. Ces cellules peuvent être modifiées par thérapie génique dans le but d’améliorer et de corriger leur activité. Il est cependant nécessaire d’évaluer l’impact et l’efficacité de ces modifications, d’autant qu’elles peuvent induire une toxicité non souhaitée pour les CSH. Cette étude vise à déterminer si les modifications sont toxiques à long terme.

Bénéfices attendus

Cette étude portant sur les greffons sanguins permettra de caractériser les modifications apportées aux CSH modifiées par thérapie génique ainsi que leurs capacités de greffe (survie, auto-renouvellement, différenciation). Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les greffons de thérapie génique avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques modifiés par thérapie génique, et (iii) d'évaluer le risque à long terme de la toxicité de la thérapie génique.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet seront anesthésiées avant d’être soumises à une greffe de cellules. Il s'agit d’injections réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Les injections se feront sur animaux vigiles (2 à 24h d’intervalle). Le suivi de la prise de greffe se fait par un unique prélèvement sanguin sous anesthésie (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des microenvironnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH, analyse de la génotoxicité) seront réalisées chaque fois que possible en vue de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions d’optimisation testées, le nombre d’animaux injectés a été fixé à 7, qui est le nombre minimum d’animaux pour avoir une significativité suffisante lors de la réalisation des tests statistiques. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation. Les souris seront hébergées en animalerie adaptée aux souris immunodéprimés, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en conformité avec la réglementation en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu adapté pour entretenir le bien-être des animaux. L’ensemble des animaux recevront un traitement analgésique et/ou anesthésique prévu pour parer à toute souffrance ou stress, réfléchit pour chaque acte pratiqué. Les points limites ont été définis et appliqués pour le suivi de ces animaux. Notamment, la souffrance et la gêne des animaux seront évaluées à travers une grille de points limites adaptée permettant d’anticiper au plus tôt la souffrance des animaux et de mettre en place les procédures conservatoires adéquates.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons des souris immunodéficientes. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression. Cette souche de souris représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

Gavées, mises à jeun jusqu'à douze heures et soumises à dix prélèvements sanguins sur animal vigile, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes. L'objet déclaré est de comprendre comment les cellules immunitaires du foie participent à l'athérosclérose, avec l'espoir lointain de nouvelles cibles thérapeutiques. Sur la façon dont ces 1 600 animaux ont été comptés, le résumé tient en une ligne, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de décès dans les pays développés. Parmi elles, l’athérosclérose, une maladie caractérisée par le dépôt de graisses dans les artères, est particulièrement redoutée pour ses conséquences, comme la crise cardiaque. L'inflammation joue un rôle central dans l'évolution de l'athérosclérose, ce qui fait de sa compréhension et de sa modulation une priorité de santé publique. Les cellules immunitaires du foie jouent un rôle dans la régulation de l’inflammation au sein de cet organe, et pourraient également contribuer, à plus large échelle, à l’inflammation chronique des artères et des organes immunitaires, associée aux maladies cardiovasculaires. L’objectif de ce projet est d’étudier la contribution des cellules immunitaires du foie dans le développement de l’inflammation et des maladies cardiovasculaires. Nous allons utiliser un modèle d’athérosclérose chez la souris pour explorer les mécanismes immunitaires et inflammatoires impliqués dans le développement de ces maladies. Les objectifs de ce projet sont de 1) caractériser les cellules immunitaires du foie ainsi que leur devenir dans les maladies cardiovasculaires et 2) étudier leur contribution dans l’athérosclérose et l’inflammation.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes liant le foie à l’athérosclérose, et pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires du foie, chez les patients souffrant d’athérosclérose.

Procédures

Les animaux auront jusqu'à 4 injections sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection). Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : - la préhension et contention des animaux génèrent un inconfort léger et de courte durée - la mise à jeun avant les tests de tolérance à l'insuline (5h) et au glucose (12h) génère un inconfort - l'individualisation des animaux génère un stress léger durant la durée des tests - le gavage génère un stress et un inconfort légers de courte durée - les prélèvements de sang génèrent une douleur légère de courte durée - l'injection génère une légère douleur de courte durée au point d’injection - le prélèvement sanguin génère un stress et une douleur modérée de courte durée - l'anesthésie gazeuse génère un stress et une hypothermie légère de courte durée

Devenir

A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt.

Remplacement

Actuellement il n'existe pas de modèle plus pertinent que la souris pour l’étude de l’athérosclérose et de l’obésité. L’expérimentation animale est également le seul moyen permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans ce contexte.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel technique qualifié de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. La mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie locale adaptées.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude de l’athérosclérose et l'obésité avec notamment le développement de plaques d’athérosclérose et du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle animal dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Grâce à ces modèles, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’athérosclérose est corrélé à l’âge, c’est pour cela qu’on utilisera des souris adultes.

Pour savoir si des œstrogènes ou des molécules apparentées protègent encore les artères après la ménopause, 1 320 souris subissent l'ablation des deux ovaires, la souris n'ayant pas de ménopause naturelle. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit ensuite une injection unique du composé à tester, l'autre moitié une capsule à libération prolongée posée sous la peau, avant prélèvement des tissus. Le porteur ramène les effets indésirables à une douleur, une perte de poids et un stress, et renvoie à une grille d'évaluation de la douleur appliquée après chaque chirurgie, sans dire quel seuil déclenche la mise à mort.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité chez les femmes, mais leur lien avec la ménopause reste encore mal compris. Après cette période, la chute des œstrogènes augmente le risque de développer des problèmes cardiaques. Ce projet vise à déterminer si certains traitements à base d’œstrogènes ou de molécules similaires peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, un modèle de souris dont les ovaires sont retirés est utilisé afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes, puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle. L’effet des traitements sera évalué en étudiant comment les gènes des vaisseaux réagissent. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé en culture cellulaire, car les cellules perdent rapidement leur capacité à détecter et répondre aux œstrogènes une fois isolées et cultivées en laboratoire. L’expérimentation animale est donc indispensable pour reproduire les conditions hormonales et physiologiques d’un organisme vivant. L’objectif est d’identifier les types d’œstrogènes ou les molécules capables de bien activer leur récepteur, afin de préserver la santé des vaisseaux sanguins après la ménopause. Ces résultats pourraient contribuer au développement de traitements mieux adaptés pour prévenir les maladies cardiovasculaires chez les femmes.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1320 animaux 2-Injection aigu de composé (1min) 660 animaux 3-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 660 animaux

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie, l'injection en aigu de composé ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

Le processus vasculaire implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales, d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentes dans le vaisseau perdent leur capacité à réagir aux œstrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle de mise à mort, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont issues d’une lignée génétique bien connue, souvent utilisée pour mieux comprendre les maladies du cœur et des vaisseaux. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.

384 souris porteuses d'une mutation qui détruit la cohésion des cellules du cœur vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La thérapie génique leur est injectée entre le deuxième et le cinquième jour de vie, sur souriceau vigile, puis chaque animal passe quatre à six examens cardiaques, électrocardiogramme sans anesthésie ou échographie sous anesthésie légère. Le porteur indique qu'une mort subite peut survenir à partir de huit mois, comme chez les personnes atteintes, et que les souris reproductrices seront tuées à cet âge. Il décrit par ailleurs les tissus cardiaques humains qu'il fabrique en trois dimensions à partir de cellules souches comme très prometteurs, avant de conclure qu'un modèle animal "reste nécessaire".

Objectifs

La cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit est une maladie génétique du cœur qui touche environ 1 personne sur 5000, soit plusieurs milliers de cas en France. Elle provoque une perte de cohésion entre les cellules du cœur, ce qui entraîne des troubles du rythme cardiaque et peut provoquer une mort subite chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour cette maladie. Les recherches se concentrent sur le muscle du cœur, pour mieux comprendre sa structure et son fonctionnement. Pour étudier la maladie de façon réaliste, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris qui reproduit fidèlement la maladie humaine. L’objectif est de tester chez ces souris une thérapie génique capable de prévenir l’apparition de la maladie ou, au minimum, d’en ralentir le développement.

Bénéfices attendus

Ce projet utilise un modèle de souris déjà existant, qui reproduit très fidèlement la maladie humaine appelée cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. Cette maladie génétique empêche les cellules du cœur de bien rester attachées entre elles, ce qui provoque des troubles du rythme cardiaque et peut conduire à une mort subite chez de jeunes adultes. Les résultats de ces recherches permettront de valider une stratégie de thérapie génique et pourront aussi aider à mieux comprendre d’autres formes de la maladie causées par d’autres gènes. À long terme, l’objectif est de mettre au point une thérapie génique capable de traiter tous les patients atteints de cette maladie, quelle que soit l’anomalie génétique en cause.

Procédures

Dans ce projet, la thérapie génique sera testée avec une seule injection, effectuée sur le souriceau vigile. L’injection ne dure que quelques secondes. Pour suivre l’évolution, chaque souris sera examinée minimum 4 fois au cours de sa vie (et 6 foix au maximum) grâce à des méthodes simples et indolores : un électrocardiogramme sur animal vigil pour contrôler le rythme du cœur, ou une échographie cardiaque sous légère anesthésie pour observer son fonctionnement. Ces examens sont rapides (environ 15 minutes au total) et réalisés de façon regroupée pour limiter le stress et les manipulations des animaux.

Impact sur les animaux

L’injection prévue peut provoquer une douleur légère et passagère chez le nouveau-né. Comme pour toute injection, il existe aussi un faible risque d’infection à l’endroit où elle est réalisée. La manipulation des animaux peut être une source de stress. Avant l’âge de 8 mois, certains animaux peuvent présenter une augmentation des troubles du rythme cardiaque, ce qui peut leur causer un inconfort. À partir de 8 mois, une mort subite peut survenir, comme cela est décrit dans cette maladie. Les examens cardiaques (électrocardiogramme et échographie)sont non invasifs et largement utilisés, sans effets secondaires connus. Pour l’échographie, une anesthésie légère est nécessaire : elle peut entraîner un refroidissement de l’animal, un ralentissement de la respiration et du rythme cardiaque, mais ces effets sont contrôlés et réversibles.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux surnuméraires dans un groupe serviront pour compléter d'autres groupes. En fin d'inclusion, des euthanasies seront effectuées par une méthode règlementaire.

Remplacement

Depuis plusieurs années, nous essayons de développer des modèles de cœur humain en laboratoire, grâce à des cellules souches et à des techniques de bioingénierie en 3 dimensions. Ces approches permettent de créer des tissus cardiaques et de réduire l’utilisation d’animaux pour les recherches. Cependant, il n’est pas encore possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un organisme vivant, avec l’ensemble des mécanismes qui régulent le cœur et expliquent l’apparition de maladies comme la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. De plus, l’effet réel d’une thérapie génique ne peut pas encore être évalué uniquement avec ces méthodes de substitution, même si elles sont très prometteuses. C’est pourquoi un modèle animal reste nécessaire pour répondre à certaines questions essentielles, notamment pour vérifier et valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour ce projet, nous avons utilisé des simulations statistiques afin de déterminer le nombre minimal de souris nécessaires. L’objectif est d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Les calculs tiennent compte des différents groupes de comparaison (selon les gènes et les traitements) et de la mortalité attendue dans certains cas. De cette façon, nous nous assurons d’avoir 5 à 10 animaux par groupe en fin d’étude, ce qui est le strict minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides. Les deux sexes sont utilisés et répartis de façon équilibrée. Les naissances sont ajustées au fur et à mesure pour éviter un excès d’animaux, et les souris surnuméraires sont intégrées uniquement si elles permettent de compléter un groupe manquant. Au total, le plan de recherche prévoit environ 384 souris sur 5 ans, auxquelles s’ajoutent une petite marge liée à la reproduction nécessaire pour maintenir la lignée. Ce chiffre correspond au nombre le plus réduit possible, tout en permettant de répondre aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans de bonnes conditions de confort, en groupe avec leurs congénères, dans des locaux où la température, l’humidité et l’alternance jour/nuit sont soigneusement contrôlées. Elles ont en permanence accès à de la nourriture et de l’eau grâce à un système automatique. Leur environnement est maintenu parfaitement sain grâce à la stérilisation du matériel et à l’utilisation d’eau purifiée. Des objets d’enrichissement (papier, coton, bois, rouleaux en carton ou abris) sont également ajoutés pour stimuler leur comportement naturel. La santé des animaux est vérifiée chaque jour. Pour limiter le stress, les manipulations sont réduites au minimum, faites rapidement et avec douceur. Lors des injections, tout est prévu pour réduire au maximum l’inconfort : les souriceaux sont sortis de la cage pour une durée très courte, maintenus au chaud, manipulés avec précaution, puis replacés immédiatement dans leur nid, avec vérification qu’ils soient bien repris par leur mère. Pendant les examens cardiaques non-invasifs, des mesures spécifiques assurent leur bien-être : l’échographie est réalisée sous une anesthésie très légère pour stabiliser cœur et respiration, et un gel protecteur est appliqué sur les yeux si l’examen dure plus de dix minutes ; l’électrocardiogramme (ECG) est effectué sans anesthésie, afin d’éviter des manipulations supplémentaires. Les animaux sont suivis attentivement tout au long de leur vie. Une surveillance renforcée est mise en place dès l’âge d’un mois pour les animaux les plus fragiles. Si un problème de mobilité survient, de la nourriture hydratée est placée au sol pour qu’ils puissent s’alimenter facilement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé et le mieux documenté pour étudier les maladies du cœur. La lignée sur laquelle nous travaillerons reproduit fidèlement la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit chez l’homme, une maladie grave pour laquelle il n’existe pas encore de traitement curatif. C’est le seul modèle connu qui permette de tester une thérapie génique et d’étudier les modifications au niveau des cellules, des molécules et du fonctionnement du cœur. L’objectif est de stabiliser les structures des cellules cardiaques affectées par la maladie. Le suivi du cœur se fera grâce à des examens non invasifs qui permettent de mesurer le rythme et la contraction cardiaque, et de vérifier l’efficacité de la thérapie. Les résultats obtenus chez la souris pourront ensuite servir à envisager un développement de cette thérapie chez l’homme. Comme la maladie se déclare tôt chez l’homme, les injections de thérapie génique seront réalisées sur des souris très jeunes (2 à 5 jours), et les animaux seront suivis jusqu’à l’âge de 6 mois. Les souris utilisées pour la reproduction seront employées jusqu’à 8 mois avant d’être euthanasiées, conformément aux règles de l’expérimentation animale.

Sensibilisées puis soumises à un choc allergique, 60 souris reçoivent quatre injections et un prélèvement sanguin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après prélèvement et imagerie. L'objectif déclaré porte sur les événements vasculaires de l'anaphylaxie, la perméabilité des vaisseaux et la perte de volume sanguin qui accompagnent les formes les plus graves. Le porteur mentionne que "la chirurgie peut causer des saignements", sans que le RNT décrive nulle part quelle intervention chirurgicale les souris subissent.

Objectifs

Selon l’Organisation mondiale de la santé, l’allergie est une réaction d’hypersensibilité systémique dont les formes les plus sévères peuvent mettre la vie en danger. Elle se manifeste par une apparition rapide de troubles respiratoires, circulatoires ou des voies respiratoires, potentiellement mortels, et s’accompagne généralement – mais pas systématiquement – de modifications cutanées ou des muqueuses. Il est donc essentiel d’en étudier les mécanismes afin d’améliorer la qualité des soins et la prise en charge des patients. Le système cardiovasculaire est l’un des principaux systèmes impliqués dans la physiopathologie de la réaction. Plus précisément, le système vasculaire joue un rôle clé car il est impacté par les médiateurs biologiques libérés par différents types de cellules impliquées dans la réaction allergique. L’altération des vaisseaux provoque une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins et une perte conséquente du volume sanguin circulant vers l'espace extracellulaire entraînanant une hémorragie. L'objectif principal est d'étudier les événements vasculaires se produisant dans un modèle d'allergie chez la souris.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de faire progresser la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans les réactions allergiques et anaphylactiques les plus sévères. L'objectif est de rechercher de nouvelles stratégies immunothérapeutiques pouvant être utilisées en pratique clinique et de rechercher des marqueurs de gravité permettant de personnaliser les traitements des patients afin d'améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’allergie réalisé sous anesthésie générale et analgésie systématique. Le protocole comporte quatre injections (incluant les traitements et l’analgésique), chacune durant environ 5 secondes. Les souris feront également l’objet d’un prélèvement sanguin, dont la durée est estimée à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur légère de courte durée. L’induction de l’allergie (sensibilisation) peut causer une réaction inflammatoire au site d’injection.. La chirurgie peut causer des saignements.

Devenir

Les souris seront mises à mort après prélèvements sanguins et analyse par imagerie.

Remplacement

À l'heure actuelle, il est impossible de réaliser des études sur les cellules pour atteindre les objectifs du projet, car il est obligatoire de disposer d'un système physiopathologique chez l'animal intact qui reproduit les conditions qui se produisent dans les cas d'allergie alimentaire, d'asthme et d'anaphylaxie pour transférer les conclusions à la situation clinique.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière optimisée sur la base d’études antérieures, afin de garantir l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. L’analyse des résultats reposera sur des méthodes statistiques appropriées, assurant une interprétation rigoureuse des données tout en respectant le principe de réduction de l’usage des animaux

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur potentiellement liée au modèle, un traitement antalgique sera administré en amont des manipulations expérimentales. L’état de santé des animaux sera suivi de manière rigoureuse à l’aide d’une grille d’évaluation spécifique, incluant des points limites stricts et adaptés au projet. Ce dispositif permettra une détection rapide de toute souffrance, assurant une prise en charge appropriée. En cas de douleur, un traitement adapté sera mis en place, et si nécessaire, une mise à mort sera effectuée conformément à la réglementation en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge 10 semaines. C'est l’âge où le système immunitaire est mature.

20 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Entre leur quarantième et leur quarante-huitième semaine de vie, elles reçoivent une injection cinq jours sur sept et passent deux fois un électrocardiogramme et une échocardiographie sous anesthésie générale. Cette étude pilote cherche à savoir si le tofacitinib, déjà utilisé en médecine humaine contre des maladies inflammatoires, freine la fibrose cardiaque. Le porteur écrit que ce modèle "mime parfaitement" la maladie génétique visée, tout en précisant que ces souris ne développent ni bloc de conduction complet ni tachycardie ventriculaire sévère, contrairement aux patientes et patients les plus atteints.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer si un traitement chronique au tofacitinib, une molécule déjà utilisée en pharmacopée humaine pour le traitement de diverses maladies inflammatoires, permet de bloquer la survenue de fibrose cardiaque dans un modèle de souris transgénique. Ce modèle mime parfaitement une maladie génétique caractérisée par des troubles progressifs de la conduction cardiaque et la survenue de fibrose cardiaque au cours du vieillissement. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement préventif médicamenteux pour les patient.e.s affecté.e.s par cette maladie, dont les plus séverement touché.e.s doivent être implanté.e.s avec un stimulateur et/ou un défibrillateur cardiaque. Pour ce projet, 20 souris transgéniques, mâles et femelles, seront traitées chroniquement avec le tofacitinib, ou le véhicule, pendant 8 semaines à partir de l'âge de 40 semaines, qui correspond au début du remodelage fibrotique. L'effet du traitement sur la survenue de fibrose cardiaque (analyse histologique), ainsi que sur la fonction électrique (électrocardiogramme) et contractile (échocardiographie), sera évalué en fin de traitement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une prévention, au moins partielle, du remodelage fibrotique cardiaque normalement observé dans le modèle transgénique à partir de 40 semaines.

Procédures

A l'âge de 39 semaines et de 48 semaines, les souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) et un examen échocardiographique (15-20 min) réalisés sous anesthésie générale. Entre 40 et et 48 semaines, les souris seront soumises à une injection 5 jours sur 7.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme pour les patient.e.s, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme chez les patient.e.s les plus sévèrement touché.e.s. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. Les examens électrocardiographiques et échocardiographiques ne sont pas des techniques générant de la douleur mais seront cependant réalisés sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse) pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable, en contrôlant leur température corporelle. Sur la base de la bibliographie, aucun effet indésirable du tofacitinib n'est attendu à la dose utilisée. Les injections seront l'acte produisant le plus d'effets indésirables, en particulier de stess, lors de la manipulation.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l'issue de l'étude, après la dernière échographie, afin de prélever leur coeur pour des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la structure et la fonction cardiaque. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal.

Réduction

Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots de souris a été déterminée à l'aide d'un logiciel de statistiques sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale à l’isoflurane. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 39 semaines, le traitement commencant à l'âge de 40 semaines, jusqu'à l'âge de 48 semaines.

Pour tester des candidats médicaments contre l'accident vasculaire cérébral hémorragique, 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. L'hémorragie est provoquée par une injection de collagénase dans le striatum, au cours d'une chirurgie d'une vingtaine de minutes, suivie d'un prélèvement sanguin à J1, J3 ou J7 et d'une évaluation neurologique. Le porteur indique que ce modèle peut provoquer des douleurs, de la prostration, des difficultés à se déplacer et une perte de poids. Il annonce des points limites stricts et une mise à mort si la souffrance se prolonge, sans indiquer les seuils retenus.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral hémorragique représente un problème de santé publique (20 à 30% de toutes les pathologies neurovascualaires) et ne disposent actuellement d’aucune thérapeutique efficace pour en réduire la gravité. Ils surviennent lorsque les vaisseaux sanguins dans le cerveau se rompent, entraînant une hémorragie. Le taux de mortalité est le plus élevé parmi les pathologies neurovasculaires. L’accident vasculaire cérébrale hémorragique déclenche une réponse immunitaire et inflammatoire qui aggrave les lésions cérébrales en favorisant l’expansion de l’hématome (épanchement de sang) et formant un oedeme autour de l’hématome. Ce dernier est associé à un mauvais pronostic neurologique. Actuellement, les mécanismes impliqués dans le développement de cet œdème sont complexes et mal compris. Les objectifs de ce projet seront d’une part de comprendre la physiopathologie de l’oedeme formé autour l’hématome et d’autre part d’évaluer la tolérance et l’efficacité de nouveaux traitements sur la résorption ou non de l’hématome et de l’œdème formé à la suite d’un accident vasculaire cérébral hémorragique

Bénéfices attendus

A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébrales hémorragiques. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral hémorragique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) hémorragique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 20 minutes. Chaque animal recevra deux injections (traitement et anesthésie profonde) ainsi qu’un seul prélèvement sanguin (réalisé à J1, J3 ou J7). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle d’AVC peut provoquer des douleurs anisi que prostration, difficultés à se déplacer et perte de poids. L’injection de collagènase dans le striatum cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique dans l’accident vasculaire cérébral hémorragique. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet thérapeutique bénéfique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral hémorragique chez l'homme

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons sest bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux.

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie Nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Deux heures de chirurgie sous anesthésie pour implanter un dispositif d'observation du cerveau, puis un mois de traitement quotidien, deux séances d'imagerie et deux semaines de tests d'apprentissage, de mémoire et d'orientation spatiale à raison de vingt minutes par jour. 666 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les modèles transgéniques employés ne présentent aucun effet indésirable connu sur le bien-être des animaux non-humains, alors que les mêmes souris privées du gène Trim47 présentent, selon la partie scientifique du texte, des troubles cognitifs et une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. Toutes sont mises à mort en fin d'expérimentation pour prélever leur sang et leurs tissus.

Objectifs

La démence vasculaire est responsable de 45% des déclins cognitifs et de 25 % des AVC. L’une des premières causes de démence est la maladie des petits vaisseaux cérébraux (MPV) entrainant des lésions cérébrales et in fine des déficits cognitifs, des troubles de l’humeur et moteurs chez l’homme. Des études d’associations pangénomiques réalisées sur des cohortes de patients atteints de la MPV ont identifié de nouveaux déterminants génétiques potentiellement causatifs du développement de cette pathologie. Ainsi, une étude du laboratoire a permis d’identifier la protéine TRIM47 comme un nouvel acteur de la MPV. Les souris dans lesquelles le gène Trim47 a été désactivé pour étudier sa fonction présentent des troubles cognitifs, associés à une augmentation de la perméabilité de la barrière hémato- encéphalique (BHE) dues à diminution de la voie antioxydante. Ces travaux suggèrent que le ciblage de la voie de signalisation TRIM47 pourrait être une stratégie prometteuse pour la prévention ou le traitement de la MPV et des démences vasculaires. L’objectif scientifique du projet est ainsi étudier le potentiel thérapeutique de 2 interventions activant la voie antioxydante sur les fonctions cognitives, la perméabilité de la BHE et le couplage neurovasculaire dans notre modèle de souris Trim47 mutantes. Deux stratégies thérapeutiques seront testées : un traitement pharmacologique et une stratégie utilisant un oligoantisens.

Bénéfices attendus

Cette étude fournira le premier examen complet de la corrélation entre fonction neuronale et de la fonction vasculaire sur animaux vigiles présentant des troubles de comportement / maladies vasculaires. A terme, ce projet vise à accélérer le développement de nouvelles thérapies pour améliorer la prise en charge des troubles cognitifs chez les patients atteints de démences vasculaires.

Procédures

Chirurgie sous anesthésie (2h), 2 injections sous anesthésie (2 x 5 minutes), 2 séances d’imagerie (2x15 minutes). Traitement avec molécule (1 fois par jour sur un mois, durée totale 60 minutes) ou injection de molécule sous (2 x 5 minutes). Tests de comportements : 20 minutes/jour sur 2 semaines (3h d’intersession minimum) pour évaluer les fonctions cognitives des animaux telles que l’apprentissage, la mémoire, la capacité à s’orienter dans l’espace ou la prise de décision.

Impact sur les animaux

Les modèles transgéniques utilisés dans cette étude sont bien caractérisés et ne présentent aucun effet indésirable connu sur le bien-être des animaux. Modèle d’hypertension modéré et de courte durée : aucune nuisance attendue. Pour la chirurgie d'implantation, les nuisances/effets indésirables attendus sont : inflammation durant la première semaine ainsi qu’’une douleur post chirurgical possible et un inconfort. Pour les tests de comportement et l’imagerie sur animal vigil, un léger stress dû à la manipulation ou au changement d’environnement et un inconfort dans les premières séances d’imagerie sont attendus.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce protocole sont euthanasiés en fin d'expérimentation pour des prélèvements de sang et de tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale capable de reproduire fidèlement le fonctionnement du cerveau, notamment les interactions entre l’activité des neurones et la circulation sanguine (couplage neruovasculaire). Ces mécanismes complexes impliquent de nombreux types de cellules qui doivent être organisés de manière très précise, ce qui n’est pas possible dans des systèmes simplifiés comme des modèles de cultures cellulaires. Les fonctions cognitives (mémoire, apprentissage…) dépendent de réseaux de neurones répartis dans tout le cerveau, qu’on ne peut pas recréer en dehors d’un organisme vivant. Les modèles animaux restent aujourd’hui indispensables pour mieux comprendre ces phénomènes et l’impact de nouvelles molécules sur ces processus.

Réduction

L’utilisation d’imagerie longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux puisque ceux-ci ne sont pas euthanasiés à chaque temps d’étude. Chaque animal étant son propre contrôle de façon longitudinale permet de réduire les différences inter-individuelles et de réduire le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. La mise en place de points limites permet d'assurer une surveillance rigoureuse de l’état de santé des animaux par le personnel et d’interrompre l’expérience si nécessaire (l’expérimentateur est alerté).

Choix des espèces

La souris est à ce jour la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles d'études de maladies humaines. En outre, c’est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale des barrières hématoencéphaliques et du réseau vasculaire présentent de fortes ressemblances avec l'homme. Les modèles de modification de flux sanguin ont été développés et validés pour cette espèce et montrent leur pertinence pour créer des altérations cognitives et des altérations du tissus neuronal. Nous utiliserons des souris adultes de 4 mois, ayant un réseau vasculaire mature dans les organes notamment le cerveau. Pour l’implantation des lentilles, des souris adultes âgées de 3 mois d'un poids autour de 24-29g seront inclues.

Tous tués pour prélèvement d'organes, 169 120 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu peut passer sept séances d'imagerie avec coloration in vivo des tissus calcifiés, comptant 45 minutes de coloration et de lavage, et jusqu'à quatre échocardiographies. Certains sont soumis deux fois par jour à un régime riche en graisses pendant 90 jours ou plus, d'autres à un choc thermique local ou à des injections répétées, et les poissons génotypés sont isolés deux à sept jours en attendant le résultat de la biopsie. Le porteur explique cet effectif par la variabilité entre individus et par le caractère progressif de la calcification, et précise que 169 120 correspond au maximum qu'il peut utiliser.

Objectifs

La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes molécules thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.

Procédures

Pour tous les gestes techniques, les animaux seront anesthésiés. Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Les animaux seront analysés par microscopie d'imagerie en direct (10 minutes d'imagerie par point de temps) avec une coloration in vivo pour les tissus calcifiés (45 minutes de coloration et de lavage). Chaque animal sera soumis à cette procédure au maximum 7 fois (à 5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 jours post fertilisation) sur les 30 jours de l’expérience. Une échocardiographie (10 minutes d'imagerie par point de temps) sera réalisée au maximum 4 fois par animal sur une durée maximale de l’expérience de 60 jours. Certains poissons recevront 2 fois par jours une alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux sur une durée pouvant aller de 90 jours, voire plus. En ce qui concerne les traitements médicamenteux, si l'administration se fait dans un bain, l’incubation varie de 3 à 6h ; si l’administration du médicament se fait par injection, le temps d'anesthésie est inférieur à 2 minutes et l'injection est très rapide (quelques secondes). Les poissons seront traités pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. Les médicaments seront administrés en doses uniques ou répétées en fonction de leur durée de vie et des périodes d'absorption. Une autre intervention consistera en un choc thermique local d’une durée inférieure à une minute suivi de 10 minutes d'imagerie par point de temps. L’expérience pourra durer jusqu’à 90 jours, ou plus. Concernant le génotypage des poissons, les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) pour une biopsie (quelques secondes). Les poissons seront isolés jusqu’au résultat de la biopsie (2 à 7 jours).

Impact sur les animaux

Les animaux adultes seront soumis, lors de l'administration des médicaments ou des composés destinés au traçage et au marquage des cellules, à une injection d’une durée inférieure à 30 secondes, douleur légère. L'effet du médicament ou du traitement peut entraîner des phénotypes spécifiques d’une durée de 1 à 14 jours dont les douleurs seront de classe légère à modérée. Les études échographiques pourront engendrer une douleur légère de courte durée (5 minutes maximum). Pour les besoins expérimentaux, les animaux pourront être hébergés de manière isolée pouvant durer jusqu'à 14 jours (sévérité légère à modérée selon la durée). Les phénotypes dommageables potentiellement observés sur les lignées mutantes incluent des modifications de la morphologie (déformations squelettiques, variations de taille ou de l’opercule), des atteintes oculaires ou des nageoires, ainsi que des changements d’aspect ou de vitalité liés au vieillissement. Les niveaux de sévérité peuvent varier de léger à modéré sur une durée de 6 mois maximum. Une surveillance accrue sera effectuée afin de prévenir et limiter la souffrance des animaux. Tout individu présentant des effets indésirables entraînant une souffrance significative sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse.

Remplacement

Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro pour comprendre la calcification cardiovasculaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques complexes de ces maladies, puisqu'elles résultent de l'action de multiples facteurs et types de cellules. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.

Réduction

La diversité entre les individus, particulièrement prononcée chez les jeunes poissons zèbres (à leurs stades larvaires), explique pourquoi il est nécessaire d'utiliser un plus grand nombre d'animaux afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour valider nos résultats. De même, la calcification cardiovasculaire, qui évolue progressivement et de manière très variable, requiert également un nombre accru d'animaux pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que chaque fond génétique peut présenter une variabilité différente, nous prévoyons de réaliser nos expériences en plusieurs étapes, augmentant progressivement notre effectif, afin d'éviter d'utiliser un surplus d'animaux si la puissance statistique est atteinte avec un effectif moindre. Par conséquent, le nombre d'animaux requis correspond au maximum que nous pouvons utiliser. Étant donné la nature dynamique et hétérogène de la calcification cardiovasculaire, nous suggérons d'exploiter et de créer un grand nombre de lignées génétiques. Ceci permettra d'explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à l'établissement et à l'aggravation du phénotype de calcification. En utilisant des techniques d'imagerie en direct, nous serons en mesure de suivre la progression individuelle de la calcification chez les mêmes animaux, réduisant ainsi le recours habituel à un grand nombre d'animaux pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem ainsi que les coupes histologiques de tissus.

Raffinement

Tout au long de notre projet, les animaux seront maintenus dans des conditions optimisées pour assurer leur bien-être. Les paramètres de l’eau (température, conductivité et pH) ainsi que le cycle lumineux seront contrôlés. Un enrichissement sera assuré par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Des points limites sont fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. De plus, nous utiliserons des procédures non invasives (imagerie, échocardiographie) afin de caractériser le processus de calcification cardiovasculaire.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour la recherche en raison de ses caractéristiques uniques. Sa transparence durant les premières semaines après la fécondation permet des techniques d'imagerie exceptionnelles, impossibles avec d'autres modèles. Sa petite taille et sa grande progéniture facilitent son hébergement et sa manipulation, favorisant les études à haut débit. De plus, ses techniques avancées de transgenèse et de mutation offrent diverses méthodes pour étudier spécifiquement les gènes et les voies de signalisation. La similitude marquée entre le poisson zèbre et les mammifères renforce sa valeur en tant qu'organisme modèle. Sa remarquable capacité de régénération tissulaire tout au long de sa vie le rend particulièrement intéressant d'un point de vue d’application clinique. Pour notre projet, le poisson zèbre offre la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement et de cibler des cellules spécifiques grâce à des techniques d'ablation génétique. Cela en fait l'organisme idéal pour notre étude sur l'établissement de la calcification cardiovasculaire, aussi bien au cours du développement que chez les adultes. Nous examinerons les stades larvaires et juvéniles (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 jours post-fécondation) pour comprendre les étapes clés du développement cardiovasculaire, ainsi que les stades adultes (60, 90 et >90 jours post-fécondation) pour observer les tissus sains et malades chez les jeunes et les animaux plus âgés.