Système cardiaque

Chaque souris subit une ovariectomie puis la pose d'une capsule hormonale, avant une lésion électrique ou mécanique de la carotide. 540 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but déclaré est de mesurer la cicatrisation des artères après la chute hormonale, pour comparer différents œstrogènes censés protéger les vaisseaux après la ménopause. Le porteur résume les conséquences de ces trois interventions par animal, soit 1 620 opérations au total, en une seule phrase qui mentionne une douleur, une perte de poids et un stress.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sont la première cause de décès chez les femmes. Pourtant, on ne comprend pas encore très bien comment la ménopause joue un rôle dans ce phénomène. Après la ménopause, le taux d’œstrogènes (les hormones féminines) chute, ce qui pourrait augmenter le risque de problèmes cardiovasculaires. Ce projet cherche à savoir si certains traitements à base d’œstrogènes, ou de substances qui agissent comme eux, peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, on utilise un modèle de souris dont on retire les ovaires, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (car les souris n'ont pas de ménopause naturelle). L’efficacité des traitements est mesurée en observant comment les artères se réparent après une petite blessure, ce qui permet de voir si les molécules testées aident à maintenir une bonne santé vasculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 540 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 540 animaux 3-Lésion életrique de la carotide (20min) 270 animaux 4- Lésion mécanique de la carotide (20-30min) 270 animaux. Les animaux subissant la lésion électrique de la carotide ne sont pas les mêmes que ceux subissant la lésion mécanique.

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’agression de la carotide (mécanique ou électrique), l’ovariectomie ou la pose de capsule à libération prolongée peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des oestrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 5 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisament prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont sous fond génétique C57BL6 qui est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.

Tous les rats de cette lignée naissent homozygotes pour une mutation qui leur fait développer une polykystose rénale, avec des kystes dans les reins et parfois le foie, une hypertrophie rénale et une insuffisance rénale chronique. 650 rats vont naître de ces accouplements et être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la seule intervention déclarée étant la mise en accouplement. Le porteur écrit que les élever sur place réduit les coûts d'acquisition et permet d'adapter la production à l'avancement de ses projets. Il annonce que 100 % des animaux seront replacés dans l'élevage ou utilisés dans d'autres projets du laboratoire, tout en indiquant qu'aucun ne sera gardé au-delà de six mois et qu'ils seront mis à mort à cet âge, avant que la maladie n'entre dans sa phase sévère.

Objectifs

La polykystose rénale (PCK) autosomique est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente, et généralement liée à des mutations des gènes. La polykystose rénale autosomique se caractérise aussi par des atteintes cardiaques et vasculaires, lesquelles sont potentiellement impliquées dans la progression de la dysfonction rénale. Ce sont des animaux génétiquement altères (AGA) car Ils portent une mutation spontanée ou induite dans un gène impliqué dans la polykystose rénale autosomique récessive (ARPKD). Cette mutation est héréditaire et stable, transmise selon un mode autosomique récessif. Elle provoque la formation de kystes rénaux et parfois hépatiques, mimant la maladie humaine.

Bénéfices attendus

La polykystose rénale autosomique est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente, caractérisée par un déclin lent et progressif de la fonction rénale. Malgré les traitements actuels, cette pathologie évolue inévitablement vers une insuffisance rénale terminale. L’élevage de ces rats directement au laboratoire présente plusieurs avantages. D’une part, cela permet de réduire les coûts d’acquisition ; d’autre part, disposer des animaux sur place nous offre la possibilité d’adapter la production en fonction des besoins spécifiques et de l’avancement de chaque projet. En outre, ces animaux étant généralement produits aux États-Unis, leur élevage local permet d’éviter le stress lié à un transport prolongé, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être. Nous élevons des rats PCK homozygotes (génotype PCK/PCK), un modèle reposant sur une mutation autosomique récessive. De ce fait, tous les descendants expriment systématiquement le phénotype pathologique. Nous avons choisi d’utiliser cette lignée car elle développe spontanément une polykystose rénale autosomique récessive, la maladie que nous souhaitons étudier dans le cadre de nos deux projets scientifiques. Ce modèle présente l’avantage de développer rapidement une insuffisance rénale chronique, caractérisée par l’apparition de kystes corticaux et médullaires, ainsi qu’une hypertrophie rénale progressive. Cela nous permet de réduire le temps de maintien des animaux en animalerie et de les utiliser rapidement dans nos expérimentations.

Procédures

Mise en accouplement

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement. Dans le cas éventuel d’observation d’effets indésirables dus au génotype, nous utiliserons une grille d’évaluation du bien-être animal, sous forme d’un tableau. Le suivi clinique des rats révèle une progression caractéristique de la polykystose rénale au fil du temps. Jusqu’à l’âge de 4 à 5 mois, les animaux restent généralement asymptomatiques, bien que les kystes rénaux se développent progressivement de manière silencieuse.Les animaux seront mis à mort à l'âge de 6 mois avant que ne se déclarent des déficites sévères.

Devenir

Sur la totalité des animaux, 100% sont attendus pour avoir le bon génotype et seront replacés dans l’élevage ou utilisés pour d’autres projet du laboratoire. Nous élevons des rats PCK homozygotes (génotype PCK/PCK), ce modèle reposant sur une mutation autosomique récessive. Ainsi, tous les descendants expriment systématiquement le phénotype pathologique.

Remplacement

L’utilisation des animaux est obligatoire, car le développement de la dysfonction rénale et de la dysfonction cardiaque lors de la polykystose rénale autosomique est multifactoriel et aucune approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet d'établir l'implication/interaction de tous les mécanismes impliques. Cependant dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules) pour étudier les mécanismes impliqués dans les effets observés..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la lignée les couples initiaux seront réceptionné, plus accouplé, et des animaux des deux sexes seront replacés dans d’autres projet du laboratoire, afin d’utiliser l’intégralité des animaux générés à l’animalerie. Afin d’éviter la surproduction d’animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont spécifiquement adaptées : litière douce, enrichissement de l’environnement (abris, objets à ronger), et accès illimité à l’eau. Les animaux ne sont pas maintenus au-delà de 6 mois, afin d’éviter l’apparition de la phase terminale de la maladie. Étant donné que l’état pathologique commence à se dégrader de manière significative à partir de 6 mois, aucune mesure spécifique supplémentaire ne sera mise en place, puisque les animaux issus de notre reproduction ne dépasseront pas cet âge. Nous resterons cependant très attentifs à tout signe de perte de poids ou de déshydratation. Une surveillance rigoureuse de la consommation d’eau sera assurée, et des précautions particulières seront prises pour garantir un bon suivi. Des pesées régulières seront effectuées afin d’adapter l’alimentation, notamment par l’ajout de nourriture enrichie dans les cages si nécessaire.

Choix des espèces

Les effets de l’anticorps neutralisant la vasopressine seront déterminés en utilisant la souche de rats. Cette souche a la particularité de développer spontanément un polykystose rénale comparable à la polykystose rénale humain. De plus seul l'utilisation des animaux vivants permettent pour comprendre les interactions entre les différents organes (rein, cœur, foie...) et les altérations neuro-humorales, immunitaires, métaboliques. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles jeunes seront randomisés dès l'âge de 4 semaines renterrons dans le protocole scientifique à l’âge de 6 semaines. Les animaux ne seront pas maintenus au sien de notre animale au-delà de 6 mois. Nous effectuerons nous même au sein de notre animalerie les reproductions nécessaires pour obtenir les 400 pck/pck Les deux sexes seront utilisés. Il n’y aura pas de mise à mort précoce liée au sexe, puisque mâles et femelles seront intégralement inclus dans les deux projets scientifiques.

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

Greffées de cellules leucémiques puis traitées par des chimiothérapies choisies pour leur toxicité cardiaque, 392 souris reçoivent jusqu'à huit injections par semaine et une échographie sous anesthésie chaque semaine, pendant quatre semaines. Toutes sont déclarées en souffrance modérée et toutes sont tuées, un prélèvement sanguin terminal précédant le prélèvement de leurs organes. Le porteur écrit que les souris ne subiront de leur vivant que des "interventions d'intensité légère à modérée", puis signale, en majuscules, que la greffe de cellules leucémiques peut provoquer paralysie de l'arrière-train, fatigue sévère et amaigrissement. Le projet vise à décrire le métabolisme du cœur soumis à ces traitements, une étape de connaissance dont les patients ne verraient le bénéfice qu'à long terme.

Objectifs

Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux. NOUS PRÉCISONS QUE L'AJOUT DE LA SECONDE PROCÉDURE NÉCESSITE LA MISE À JOUR D'UN PROJET DÉJÀ AUTORISÉ AINSI QUE LA MODIFICATION DU NOMBRE TOTAL DE SOURIS QUI PASSE À 392.

Bénéfices attendus

Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimiothérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal (1 minute), directement suivi par la mise à mort des souris. Toutes les interventions que subiront les souris de leur vivant seront des interventions courtes de types injections (8 par semaine maximum, durée quelques secondes) sauf pour l'échographie sous anesthésie (1 par semaine, 10 min). Au total les souris seront manipulées de 1 a 5 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur dans des modèles murins porteur de tumeurs. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. LA GREFFE DE CELLULES LEUCÉMIQUES PEUT ENTRAINER DES ÉVÈNEMENTS INDÉSIRABLES SUR LES DERNIÈRES ÉTAPES DE LA MALADIE ; À SAVOIR PARALYSIE DE L'ARRIÈRE TRAIN, FATIGUE SÉVÈRE ET AMAIGRISSEMENT.

Devenir

La mise à mort des souris est nécessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanchés par les traitements anticancéreux toxiques.

Remplacement

Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements. De plus, notre projet s'intéressant à l'interraction entre coeur et cancer, cela nous oblige à procéder à des expériences in vivo.

Réduction

Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (392 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris (392), d'une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude du cancer de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment à l'internationnal. Nous utiliserons uniquement des souris adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.

Un infarctus du myocarde est provoqué chirurgicalement chez chaque souris, en moins de vingt minutes, puis suivi de sept injections quotidiennes et de deux échocardiographies sous anesthésie. 384 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente comme effets indésirables principaux l'inconfort de la préhension et une douleur légère au point d'injection, avant de décrire l'insuffisance cardiaque provoquée par l'opération, avec fatigue à l'effort, œdèmes et détresse respiratoire possible. Toutes sont tuées pour prélever le cœur et le sang, afin de mesurer l'effet d'un anticorps censé freiner la fibrose cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie qui se traduit par l’incapacité du coeur à assurer son rôle de pompe. Elle affecte plus d’un million de personne en France. La cause majeure de l’insuffisance cardiaque est l’infarctus du myocarde. Ce dernièr est caractérisé par une modification structurelle du tissu cardiaque résultant le développement de la fibrose. Ces modifications mèneront à l’augmentation de la rigidité du muscle cardiaque ce qui augmente le risque d’insuffisance cardiaque. Actuellement, il n’existe aucun traitement qui inhibe la fibrose et améliore la prise en charge des patients, d’où la nécessité de comprendre ses mécanismes et de limiter son développement par des traitements ciblés. L’objectif de ce projet est de produire un anticorps qui inhibe un facteur de croissance impliqué dans le développement de la fibrose cardiaque. En effet, l’expression de ce facteur de croissance diminue au cours du développement, et est très faible (voir meme absente) dans le coeur adulte mais augmente en réponse à un stress notamment en cas d’infarctus du myocarde. De même, ce facteur de croissance a été identifié dans la circulation sanguine, avec un pic de sécrétion dans le 2-4 jours après l’infarctus. Cet anticorps sera testé in vivo et nous validerons son action dans un modèle prè-clinique d’infarctus du myocarde. Ces résultats seront considérés comme un programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer un nouveau anticorps pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons : Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base, cet examen dure environ 10 min. Dans un second temps, induire un infarctus du myocardique. Cette intervention est unique, réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure moins de 20 minutes. Les souris seront injectées quotidiennement et pendant 7 jours, cette injection dure environ 5 secondes. 7 jours après la chirurgie, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque post chirurgie et post traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur légère de courte durée au point d’injection. Il y a également les effets indésirables liés à la chirurgie comme l’insuffisance cardiaque. En effet, la chirurgie est une source de douleur pour les animaux et l’insuffisance cardiaque engendrée par l’opération est également une source de souffrance pour la souris et se traduit généralement par une fatigue à l’effort, des Œdèmes et peux aller jusqu’à une détresse respiratoire.

Devenir

A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal, tous les animaux seront mis à mort dans le but de prélever le coeur et le sang. Ceci nous permettera d’étudier l’efficacité de l’anticorps à l’aide de différentes techniques d'analyse.

Remplacement

L’anticorps neutralisant à étudier fait l’objet de tests préliminaires in vitro qui permettent de démontrer son pouvoir neutralisant, d’évaluer sa puissance d’action et sa capacité à réduire l'activation des cellules impliquées dans la fibrose cardique. Notre projet nécessite d'utiliser ensuite un modèle in vivo pour valider ces effets, et ceci en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques.

Réduction

les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites stricts et adaptés au projet permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire.

Choix des espèces

La recherche clinique sur l’infarctus du myocarde chez l’humain est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations cellulaires sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 10 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.

Toutes tuées pour que leur aorte soit prélevée, 558 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord détruit par irradiation aux rayons X, puis remplacé par une greffe de moelle osseuse injectée en intraveineuse, avec un risque d'anémie et de sensibilité aux infections si la reconstitution échoue. Elles sont ensuite nourries au régime riche en graisses et saignées à la veine sous-mandibulaire sans anesthésie, quatre semaines après la greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de passer par la souris et annonce de nouvelles stratégies contre des maladies cardiovasculaires qui tuent 17 millions de personnes par an, quand le projet mesure l'usage du glucose par des sous-populations de monocytes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires entraînent la mort de plus de 17 millions de patients par an dans le monde. La prévalence de ces pathologies accroit de manière progressive et représente un problème majeur de santé publique. L'athérosclérose est la principale cause du développement de maladies cardiovasculaires, et peut notamment provoquer des infarctus du myocarde ainsi que des accidents vasculaires cérébraux. L'athérosclérose se caractérise par la dégradation de la paroi des vaisseaux sanguins, au sein de laquelle une accumulation de graisses et de globules blancs appelés monocytes forme ce que l'on appelle une plaque d'athérome. Lors d'un développement avancé des plaques d'athérome, celles-ci peuvent totalement obstruer le vaisseau sanguin et bloquer la circulation. Elles peuvent également se rompre et déverser dans la circulation sanguine de petits fragments de plaque pouvant obstruer des vaisseaux sanguins plus étroits, par exemple au niveau du cerveau. Des études récentes ont permis de mettre en évidence un rôle central du métabolisme, et notamment du glucose, au cours du développement de la plaque d’athérome. Ce projet vise à comprendre comment les différents types de monocytes et leur utilisation du glucose affectent la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à diminuer la mortalité induite par les maladies cardio-vasculaires. Les résultats issus de ce projet permettraient de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les voies immuno-métaboliques identifiées dans les sous-populations de monocytes du sang afin de réduire la morbidité et mortalité due aux maladies cardio-vasculaires.

Procédures

Les souris seront irradiées et ensuite elles seront injectées par voie intraveineuse avec de la moelle ossesuse. L’irradiation des souris consiste en l’exposition à une dose de rayon X induisant une ablation totale du système immunitaire de la souris hôte afin de pouvoir le remplacer par le système immunitaire d’une souris donneuse de même sexe et de même fond génétique. Une prise de sang sera effectuée sur les souris vigiles dans la veine sous-mandibulaire 4 semaines après l'injection. Les animaux injectés seront nourris avec un régime riche en graisse et suivis au cours du temps.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont celles liées (i) à l’irradiation des souris receveuses (ii) à l’injection par voie intraveineuse de la moelle osseuse. Ils subiront également une prise de sang (au niveau de la veine sous-mandibulaire) entrainant également une douleur et un stress dû à la contention. L'irradation induit une déplétion du système immunitaire de la souris receveuse ce qui pourrait induire des complication comme une anémie ou une susceptibilité aux infections si le système n'est pas reconstitué. L'injection par voie intraveineuse peut engendrer un stress pour la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les aortes dans le but d’analyser la diversité des cellules immines dans les plaques d'athérome.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, des études sont réalisées sur des lignées de cellules différenciées en macrophages. Cependant, pour comprendre la diversité et les fonctions des sous-populations des monocytes dans le développement de l’athérosclèrose, il est indispensable de réaliser des études chez les souris car les études sur des lignées cellulaires ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans la plaque d’athérome.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons une approche statistique nous permettant de prévoir le nombre d’animaux nécessaires pour répondre clairement à notre question scientifique, sans utiliser plus de souris que nécessaires. De plus, nous utiliserons aussi bien les souris mâles que les souris femelles.

Raffinement

La mise en place de points limites régissant le déroulement précis des procédures permet l’amélioration du bien-être animal afin de diminuer de manière optimale la détresse et l’angoisse des animaux. Pour chaque procédure, nous avons pris en compte la gestion de la souffrance, l'angoisse et la douleur pour nos animaux. Notamment, des buchettes de bois seront mises à disposition des animaux nourris avec de la nourriture riche en graisse (nourriture molle) afin de répondre à leur besoin naturel de ronger.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins précliniques est indispensable afin de répondre à notre hypothèse de travail. Les modèles de souris athérogéniques sont commercialement disponibles et présentent un profil lipidique proche de celui retrouvé chez l'Homme donnant une opportunité unique de développer des stratégies translationnelles. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 12 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs. Cette fenêtre d'âge permet d'étudier dans les meilleurs conditions la contribution des cellules immunes au développment de la plaque d'athérome. Dans la fenêtre indiquée le système immunitaire est mature mais ne présente pas encore de dysfonctionnements liés à l’âge.