Système cardiaque

24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.

Objectifs

Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).

Devenir

Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.

Réduction

Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.

Raffinement

Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.

Choix des espèces

Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois millilitres d'air injectés sous la peau du dos pour former une poche, puis des cristaux injectés dans cette poche, subissent l'ablation de la rate au cours d'une opération de trente minutes, jusqu'à vingt-huit gavages quotidiens et huit semaines de régime gras. Le porteur annonce l'identification, "à moyen terme", de cibles thérapeutiques contre les lésions cardiovasculaires liées à la goutte et à la chondrocalcinose, et une amélioration des soins "à long terme". Sur le remplacement, il décrit des tests sur lignées cellulaires qui servent à caler les doses avant le passage aux souris.

Objectifs

Les maladies à dépôts de microcristaux de pyrophosphate de calcium (PPC) et d’urate de sodium (UMS) sont les rhumatismes inflammatoires les plus fréquents de l’adultes, responsables respectivement de la chondrocalcinose et de la goutte. Ces cristaux déclenchent des arthrites aiguës récidivantes qui dépendent de médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-1β. Les crises inflammatoires déclenchées par ces 2 types de cristaux sont associées à un risque accru d’événements et d’accidents cardiovasculaires (CV). L’élévation persistante de l’urate sanguin et l’inflammation modifient la réponse immunitaire et stimulent des changements des précurseurs des cellules immunitaires dans la moelle osseuse en stimulant la formation de cellules plus inflammatoires. Cette modification de la réponse immunitaire, appelée immunité innée entraînée peut accélérer l’athérosclérose et contribuer à l’augmentation du risque CV observée chez des patients goutteux ou souffrant de la maladie à dépôts de cristaux de PPC. Dans les modèles expérimentaux d’athérosclérose, un régime riche en gras en alternance accélère les lésions vasculaires et favorise les ruptures de plaque qui dépendent de l'IL-1β, cytokine clé de l’inflammation microcristalline. Les objectifs de ce projet sont, d'une part, de caractériser l’impact des crises inflammatoires microcristallines dans le changement des cellules immunitaire de la moelle, d'autre part, d'étudier l’implication de cette mémoire entrainée sur le développement de l’athérosclérose expérimentale, et enfin, d’en identifier les mécanismes physiopathologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à moyen terme : 1. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d'athérosclérose liées aux crises inflammatoires microcristallines, 2. L'identification de cibles thérapeutiques pour prévenir les lésions cardiovasculaires, 3. L'identification des mécanismes de régulation épigénétique et métabolique liés aux crises inflammatoires microcristallines et 4. L'identification des mécanismes de régulation inflammatoire par l'urate soluble. A long terme, il permettra l'amélioration des soins chez des patients en identifiant des cibles thérapeutiques permettant de mieux contrôler les conséquences de l'inflammation microcristalline et de réduire les risques cardiovasculaires et donc la mortalité.

Procédures

Création d'une poche à air par injection dans la région dorsale de 3 ml d'air sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 2 fois, 30 secondes par geste. Injection dans la poche à air de cristaux sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 1 fois, 30 secondes. Injection d'agent pharmacologique sur animaux vigiles: 1 fois, 30 secondes. Prélèvement sanguin sur animal endormi : 1 à 4 fois, 1 minute ; Splénectomie sur animaux anesthésiés : 30 minutes. Gavage quotidien pendant 1 à 4 semaines. Un gavage par jour, nombre de gavage maximal par animal: 28. Régime riche en graisse pendant 8 semaines

Impact sur les animaux

Dans le modèle de splénectomie des douleurs sont attendues durant au maximun 3 jours avec possiblement une perte de poids et une réduction de l'activité. De plus, la répétition de manipulation des animaux peut engendrer un stress notamment pour les injections répétées d’anticorps. Les injections et prélèvements pourraient également entrainer des douleurs locales très légères. La technique de gavage pourrait également entrainer une gêne chez l’animal du fait d’une contention serrée durant le passage de la canule

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. L'évaluation finale nécessite la mise à mort de l'animal car les analyses sont effectuées sur des tissus de plusieurs compartiments

Remplacement

Des tests in vitro seront utilisés au maximum pour déterminer les conditions optimales des études in vivo : tests sur des lignées cellulaires pour déterminer la dose thérapeutique efficace d'un agent pharmacologique avant son utilisation chez l'animal; tests in vitro pour identifier le meilleur modulateur de l'immunité entraînée avant de l'étudier chez l'animal : blocage de médiateurs inflammatoires par exemple et tests in vitro pour valider les mécanismes cellulaires avant validation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses de l’inflammation dans les liquides de lavage des poches à air, analyses anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et composition cellulaire de l’aorte, analyses métabolomiques dans le sang et transcriptomes des cellules de la moelle.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages enrichies en cotons, maisons, bois, papiers dans les conditions standardisées d'hébergement et d'élevage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, une surveillance quotidienne et/ou hebdomadaire sera mise en place. La réalisation de la splénectomie sera effectuée en plaçant les animaux sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C après anesthésie générale. Les animaux recevront deux doses d’analgésique en pré (30 min) et post opératoire (6 heures). Une 3ème injection peut être réalisée le lendemain si l'animal est douloureux. Une anesthésie locorégionale sera réalisée en péri-opératoire sur les plans cutanés et musculaire . Une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place après les injections, le gavage et la splénectomie. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été établis et en cas de douleur ou comportements anormaux les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous sédation préalable.

Choix des espèces

Les modèles expérimentaux reproduisent les maladies humaines et sont reconnus sur le plan international : modèle de poche à air pour étudier l’inflammation, modèle génétiquement modifié et régime WD pour étudier l’athérosclérose Les souris génétiquement modifiées développent, sous régime riche en matières grasses, des lésions d’athérosclérose similaires aux plaques d’athérosclérose humaines. Ces souris développent sous régime riche en matières grasses une hypercholestérolémie principalement sur la fraction des LDL, comme chez l’homme. Ces 2 modèles (inflammation dans poche à air et athérosclérose chez souris génétiquement modifiées) sont nécessaires dans l’exploration des mécanismes physiopathologies impliqués dans le développement de l’athérosclérose lié à l’inflammation microcristalline. Les souris génétiquement modifiées (Gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. Jeune adulte entre 2 et 5 mois permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent.

Les souris utilisées sont diabétiques par construction génétique, nourries d'un régime riche en graisses et rendues hypertendues par une molécule administrée en continu, ce qui les affaiblit et allonge leurs délais de cicatrisation. 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever cœur, foie, poumons et rate. Elles passent deux ou trois échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie gazeuse et reçoivent trois injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire, l'anesthésie répétée pouvant provoquer une hypothermie. Le porteur a ajouté 30 % d'animaux à son effectif pour anticiper la mortalité prématurée qu'il attend de ce modèle, sans indiquer combien de souris devraient mourir avant la fin du protocole.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) est une forme particulière d’insuffisance cardiaque dans laquelle le cœur pompe normalement, mais se remplit mal. Elle représente environ la moitié des cas d’insuffisance cardiaque et touche de plus en plus de personnes, notamment en lien avec le diabète et l’obésité. Les traitements restent encore peu efficaces et les modèles expérimentaux sont limités. Dans cette étude, nous testons de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur de petites structures libérées naturellement par les cellules cardiaques issues de cellules souches. Ces structures, appelées vésicules extracellulaires, pourraient aider à réparer le cœur grâce à leurs effets protecteurs. Nous utilisons pour cela un modèle de souris conçu pour reproduire les principaux signes de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet atteindra deux objectifs clés : 1. Cette étude a pour objectif de développer un modèle murin pertinent pour l’évaluation de traitements ciblant l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. 2. Nous visons à démontrer que les vésicules extracellulaires représentent une stratégie thérapeutique prometteuse pour améliorer la fonction cardiaque diastolique et réduire la fibrose et l'inflammation dans un modèle de souris d'insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée.

Procédures

Les souris subiront des échocardiographies d’une durée d’environ 20 minutes chacune. Dans la première procédure, deux échocardiographies seront réalisées (aux semaines 6 et 12), tandis que dans la deuxième procédure, trois échocardiographies seront effectuées (aux semaines 6, 12 et 15). Dans la deuxième procédure, les animaux recevront trois injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire, administrées sur une période de deux semaines, aux jours 0, 5 et 10 après la semaine 12. Toutes les interventions (échocardiographies, injections et prélèvements d’organes) seront réalisées sous anesthésie gazeuse anesthésie. L’anesthésie sera induite pendant environ 3 minutes, jusqu’à l’absence de réponse au test de pincement (pinch test). Une fois l’animal profondément anesthésié, il sera placé sous masque facial avec un maintien de l’anesthésie gazeuse à tout au long des procédures : environ 20 minutes pour les échocardiographies, 5 minutes pour le prélèvement cardiaque, et 5 minutes pour les injections.

Impact sur les animaux

Le diabète induit, l'obésité et l'hypertension peuvent être des sources de douleur pour la souris. De plus, les animaux peuvent présenter des signes de stress lors de l'anesthésie, ainsi qu'une douleur légère et de brève durée au point d'injection intraveineuse (rétro-orbitaire). L’anesthésie générale utilisée pour les échocardiographies peut entraîner une hypothermie. Le modèle db/db peut induire un affaiblissement général et un allongement des temps de cicatrisation.

Devenir

Pour évaluer la distribution dans le cœur et d'autres organes (foie, poumons, rate) à une échelle microscopique, ces tissus doivent être prélevés pour une analyse, ce qui nécessite la mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les vésicules extracellulaires ne seront injectées par voie intraveineuse (rétro-orbitaire) chez les souris qu’après validation de leur fonctionnalité et de leur bioactivité par des tests sur cellules humaines, incluant notamment des essais de viabilité cellulaire et d’angiogenèse. Les études sur des souris vivantes sont essentielles dans ce projet, car elles visent à évaluer le potentiel thérapeutique des vésicules extracellulaires dans l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée, un syndrome systémique complexe. En effet, cette pathologie ne peut être modélisée de façon pertinente sans recourir à un modèle animal, un système cellulaire ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment en ce qui concerne le système immunitaire fonctionnel et la signalisation neurohormonale. Par ailleurs, la visualisation de la biodistribution des vésicules extracellulaires après injection intraveineuse est également cruciale. Ces expériences constituent une étape préclinique indispensable avant toute application clinique.

Réduction

Les données seront analysées à l’aide d’un logiciel statistique afin de comparer les différences entre les groupes expérimentaux. Le nombre de souris a été déterminé en collaboration avec un biostatisticien. Une marge supplémentaire de 30% a été intégrée pour anticiper la mortalité prématurée et les pertes de données attendues, en lien avec la complexité du modèle de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle associe des souris diabétiques, un régime alimentaire riche en graisses et l’administration d’une molécule conçue pour provoquer de l’hypertension, créant ainsi un stress métabolique et cardiovasculaire systémique susceptible d'augmenter la mortalité. Utiliser un nombre insuffisant d’animaux augmenterait le risque de résultats faussement négatifs ou non concluants, en particulier compte tenu de la variabilité biologique du modèle. Cette stratégie permet de garantir le maintien d’une puissance statistique adéquate tout au long de l’étude, même en cas de pertes imprévues

Raffinement

Les examens d’imagerie médicale sont non invasifs. Tout au long du protocole, la consommation d’eau et la glycosurie (présence anormale de sucre dans l’urine) seront étroitement surveillées chez les souris diabétiques. La glycosurie sera mesurée chaque semaine à l’aide de bandelettes urinaires, afin de suivre l’évolution du diabète. Les animaux seront régulièrement observés afin d’évaluer leur comportement, leur état général, ainsi que tout signe de douleur ou de détresse. Les animaux étant diabétiques, une attention particulière sera portée sur la consommation d’eau. En cas de signes persistants de souffrance ou d’inconfort malgré les mesures de soulagement, les procédures seront interrompues et les animaux seront mis à mort conformément aux points limites prédéfinis (cf. 4.2). L’usage de techniques de raffinement est prévu, notamment l’utilisation d’aiguilles fines pour les injections, afin de minimiser la douleur. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse associée à une injection d’un anti-douleur pour l’analgésie. Des groupes sociaux seront formés dans un environnement enrichi afin de favoriser leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire, car cette étude vise à évaluer le potentiel thérapeutique de petites structures libérées par les cellules, connues pour transporter des messages biologiques, et leurs effets sur la fonction cardiaque. Les souris ont été choisies pour cette expérience car elles constituent un modèle bien établi et largement accepté pour étudier la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée, en raison de leurs similarités physiologiques avec les humains en ce qui concerne la fonction cardiovasculaire. Il s'agit d'une étape préclinique nécessaire avant de passer aux applications cliniques. Les animaux arriveront à environ 7 semaines d'âge et resteront dans l’animalerie pendant une semaine pour l'acclimatation. Nous utiliserons des souris jeunes adultes pour nos manipulations entre 8 et 10 semaines, car : 1. À cet âge, les cœurs des souris sont bien formés et peuvent supporter l'induction du modèle. 2. Le cœur possède des capacités de régénération spontanée limitées, ce qui n'est pas le cas pour les cœurs des très jeunes souris.

2 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois à neuf injections intrapéritonéales à l'état vigile, un à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, un prélèvement de lymphe, puis une perfusion intracardiaque terminale. Le projet vise à décrire le rôle d'une voie de signalisation dans le développement du réseau lymphatique, les retombées pour l'humain restant énoncées comme un "potentiel de ciblage" pour corriger des dysfonctionnements. Sur les effectifs, le porteur renvoie à la littérature et à des tests statistiques sans donner de chiffre, et affirme qu'aucune culture cellulaire ni aucun organoïde ne reproduit un réseau lymphatique, ce qui fait de l'expérimentation animale le "seul modèle" possible.

Objectifs

Le réseau lymphatique joue un rôle important dans la réponse immunitaire par le transport des antigènes et des cellules immunitaires. Un dysfonctionnement du développement et des fonctions de ce réseau peut entraîne une diminution de l'efficacité des défenses de l'hôte contre les agents pathogènes ainsi que la surveillance tumorale. Les mécanismes qui régulent le développement et les fonctions lymphatiques partagent des caractéristiques avec le développement vasculaire sanguin, mais sont moins bien définis. L'objectif de ce projet est d'étudier la contribution d'une voie essentielle de signalisation vasculaire sanguine au développement et à la fonction lymphatiques chez la souris, ainsi que le potentiel de ciblage de cette voie pour la correction des dysfonctionnements lymphatiques.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre l’impact potentiel de certains lipides sur leurs contributions à une voie essentielle de la signalisation vasculaire ainsi que le potentiel de ciblage de cette voie pour la correction des dysfonctionnements lymphatiques chez l’humain.

Procédures

Les animaux subiront : - 3 à 9 injections intrapéritonéales sur souris vigiles d’une durée de 30 secondes. - 1 à 4 prélèvements sang sous anesthésie d’une durée d’environ 60 secondes. - Une récupération de la lymphe sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes. - 1 perfusion intra cardiaque terminale sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections en intra péritonéal peuvent causer une douleur et un stress de courte durée. L'anesthésie peut entrainer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prelévements de sang en intra veineux ainsi que la contention pré anesthésie peuvent occasionner une douleur et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles sur souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement du système vasculaire lymphatique. Il n'existe actuellement aucun modèle permettant d'étudier la structuration vasculaire et la formation des valves dans toute leur complexité en culture cellulaire ou sur organoïdes. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation d’un système vasculaire lymphatique. L’expérimentation animale est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’analgésique ainsi que d’anesthésie adaptées durant la procédure, et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Des grilles de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles de réseau lymphatique vasculaire en culture cellulaire permettant de reproduire sa physiopathologie. Le choix de l'espèce « souris » nous permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Ces animaux nous permettront d’analyser finement le rôle spécifique de certains lipides. Ces animaux seront utilisés à différents stade de vie (jusq'à 1 an) afin de pouvoir mettre en évidence l'évolution des réponses physiologiques en fonction de l'age.

Ovariectomisées, équipées d'une minipompe osmotique implantée sous la peau, injectées deux fois par jour, soumises chaque semaine à une mesure de pression artérielle et mises à courir trente minutes sur un tapis trois fois par semaine : 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet leur induit une insuffisance cardiaque dont le porteur écrit que la dyspnée "peut être sévère", accompagnée d'une incapacité à l'effort et d'un stress psychique en phase terminale. Il qualifie néanmoins les deux opérations de "chirurgie minimale" à la douleur "très limitée", et avance que l'absence d'ovaire n'est pas douloureuse. Toutes sont tuées à l'issue pour récolter leurs tissus et conduire des analyses de biologie moléculaire, de physiologie, de biochimie et d'enzymologie.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une incapacité du coeur à assurer sa fonction de pompe circulatoire et donc à remplir les besoins de l’organisme en perfusion de sang oxygéné. Dans cette étude nous étudierons l’IC dite préservée qui se caractérise plutôt par des défauts de relaxation du muscle cardiaque. Cette forme d’IC touche un peu plus les femmes que les hommes, ; elle est fortement associée à l’âge et touche près de 50% des patients en IC. Ces patients souffrent d’une sévère perte de qualité de vie et d’hospitalisations répétées avec une mortalité importante. Actuellement, aucun traitement efficace contre cette pathologie n’a été identifié. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux principes thérapeutiques sur un modèle murin. Le but de ce projet consiste à développer de nouvelles thérapies avec moins d’effets secondaires l’organisme. Pour cela nous étudierons commaent l’exercice physique combiné à un complément alimentaire peuvent protéger le cœur de souris jeune ou agée contre l’IC. L'exercice physique régulier est connu depuis des années comme une solution préventive pour éviter le développement des maladies cardiovasculaires. Il permet de réduire le nombre de décès ou d'hospitalisations et d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce type d’approche présente un intérêt majeur pour les patients en n’ajoutant pas de médicaments supplémentaires, et présente de plus l’intérêt d’un coût économique raisonnable pour le système de santé publique.

Bénéfices attendus

La capacité fonctionnelle et la qualité de vie chez les sujets souffrant de l’insuffisance cardiaque sont gravement altérées. En effet, le coeur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relaxer suffisamment. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles squelettiques. Les traitements développés depuis plusieurs décennies ne sont pas ou peu efficaces pour les patients. L'IC est une maladie affectant plus d’ 1 million de personnes en France et environ la moitié de ces patients ce qui représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche thérapeutique dans ce domaine. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux principes thérapeutiques sur un modèle murin. Le but de ce projet consiste à développer de nouvelles thérapies avec moins d’effets secondaires sur d’autre fonction physiologique de l’organisme. Pour cela nous combinerons un traitement nutritionnel complémentaire au à ma vitamines B3 avec un exercice physique.

Procédures

Certains lots de souris seront soumis à deux chirurgies sous anesthésie générale d'environ 10 minutes, les injections de vitamines sous anesthésie locale dureront 1 min deux fois par jours. Trois échocardiographie sous anesthésie générale seront réalisées d'une durée de 10 minutes chacune. Une mesure de pression artérielle de 5 minutes sera réalisée une fois par semaine. Enfin les souris coureront trois fois par semaine sur un tapis de course (environ 30 minutes pour une souris contrôle).

Impact sur les animaux

La procédure de chirurgie correspond à une chirurgie minimale, très souvent source d'un niveau de douleur très limitée et relativement bien tolérée par les animaux. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une ouverture de la cicatrice. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement. Une légère douleur peut être associée à l’ovariectomie correspondant à l'incision musculaire et cutanée de plus l’absence d’ovaire n’est pas associée à une douleur. La mesure de la pression artérielle peut engendrer un petit stress lié à la contention. L’insuffisance cardiaque induit une dyspnée qui peut être sévère et une incapacité à l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique et rapide. Les tissus seront récoltés pour réaliser des expériences de biologie moléculaire, physiologie, biochimie et d’enzymologie.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque et une étude du retentissement sur différents organes majeurs impliqués dans l’évolution de l’insuffisance cardiaque tels que les poumons, les reins et les muscles squelettiques notamment. Les modèles cellulaires ne permettent pas d’étudier le fonctionnement physiologique intégré du coeur et l’effet de l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée sur d’autres organes.

Réduction

Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu l’altération de la fonction diastolique (critère principal retenu dans cette étude). Les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux. Les méthodes invasives sont des procédures terminales où un cathéter est inséré dans le ventricule pour mesurer la pression et le volume de la chambre cardiaque. De plus, afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.

Raffinement

Après implantation de la minipompe osmotique, les souris seront observées tous les jours. Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. Les opérations chirurgicales (pose de minipompe et ovariectomie) sont induites en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état de la cicatrice, le comportement de prostration, la courbure de la colonne vertébrale, l’état du poil (manque d’hygiène), et un critère propre à l’étude de l’insuffisance cardiaque qui est la manifestation d’une dyspnée sévère. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Pour l’échographie, le gel échographique utilisé est chauffé au bain marie à 37°C. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre à 28 °C sous lampe chauffante. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage. Pour les opérations chirurgicales, les animaux sont anesthésiés, pour les maintenir immobiles, par anesthésie gazeuse. Une fois anesthésiés et endormis, ils reçoivent une injection en sous-cutanée d'analgésique. Au réveil, chaque souris est isolée dans une cage pendant quelques heures, au calme et au chaud puis stabulé à 4 ou 5 souris /cage. En post opération, la cicatrisation cutanée de la zone opérée est surveillée régulièrement. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protrusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaire. Un traitement antalgique est alors donné en complément. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première mesure de pression artérielle qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Choix des espèces

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. Le fonctionnement physiologique du coeur et l'altération structurelle du coeur rend impossible de faire cette étude sur les cellules en culture. La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études en insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées.

Pour valider un dispositif d'ultrasons focalisés destiné à traiter les varices humaines, 5 cochons et 10 brebis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs veines saphènes. Chaque animal est traité sur ses deux veines saphènes sous anesthésie générale, jusqu'à quatre heures, puis suivi par trois à six échographies d'une demi-heure. Le porteur présente la technique comme "plus rapide et indolore" pour les patients, et signale que des brûlures cutanées ont été observées sur les sites traités lors d'essais précédents. La brebis est retenue parce qu'une norme ISO la recommande, le cochon parce que sa peau ressemble davantage à celle de l'être humain, les essais antérieurs ayant montré que celle des brebis était trop fine.

Objectifs

L'insuffisance veineuse superficielle est l'une des maladies majeures dans le monde, actuellement traitée par ablation thermique ou sclérothérapie. La technologie d'ultrasons focalisés de haute intensité utilisant une modalité thermique peut être utilisée pour obtenir l'oblitération des varices, avec certaines limitations : un temps de traitement long et douloureux. La méthode utilisant des ultrasons de haute intensité traite les varices de manière plus rapide et indolore. Jusqu'à présent, les études montrent que pour le traitement, il est nécessaire d'injecter un agent de contraste. Cette étude préclinique sur des animaux vise à démontrer la sécurité et la faisabilité de cette nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les varices sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront traités sous anesthésie générale, pour une durée maximale de 4 heures. Chaque animal recevra un traitement par veine, soit deux traitements au total. Un suivi échographique et post-traitement de la zone traitée sera réalisé à plusieurs points (entre 3 et 6), chaque session durant environ 30 minutes. Les porcs seront placés sous anesthésie générale, tandis que les brebis seront, si nécessaire, simplement sédatées pour cet examen.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux. De plus, dans les essais précédents, des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde. Ce risque est donc très faible, mais nous devons mentionner qu'un léger échauffement peut être observé.

Devenir

Les animaux du projet seront mises à mort à la fin de chaque étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. Cependant, le porc a également été retenu en raison de la similarité structurelle et fonctionnelle de sa peau avec celle de l’homme, ce qui en fait un modèle plus adapté que l’ovin pour l’évaluation de traitements vasculaires transcutanés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été volontairement réduit grâce à une preuve de concept sur lapin et une étude de faisabilité sur brebis, permettant d’optimiser les paramètres de dispositif. Seuls 10 animaux sont nécessaires pour les deux études (validation de dose et étude réglementaire). De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. L’utilisation de 5 porcs, dont la peau est proche de celle de l’homme, permet une validation pertinente tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.Les données seront analysées statistiquement via une statistique, afin d’optimiser l’interprétation des résultats sans avoir recours à un plus grand nombre d’individus.

Raffinement

Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les ovins disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon) permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des brebis. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. De plus, les points limites généraux suffisamment prédictifs sont définis dans ce projet.

Choix des espèces

La brebis est recommandée dans la norme ISO 10993-6 comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. En outre, la faisabilité a été évaluée lors d'une étude précédente, au cours de laquelle les mesures des veines saphènes des animaux ont été réalisées. Le porc a été ajouté à ce projet. Cet essai permettra d’évaluer le dispositif dans des conditions plus proches de l’humain, les essais réalisés sur les brebis ayant montré que leur peau était trop fine en comparaison. Brebis : Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. Porc : les animaux autour de 60 kg seront utilisés, afin d'avoir un poids comparables à ceux de l'homme et des brebis adultes.

4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.