Système cardiaque

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 6 030 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections, subissent une chirurgie sous anesthésie et sont placées jusqu'à cinq fois en cage métabolique pendant six heures pour la collecte d'urine, avec une échographie cardiaque dans un second établissement. L'hypertension artérielle maligne induite peut atteindre le cœur, les reins et la rétine, et les souris hypertendues urinent assez pour imposer un changement de cage fréquent. Le porteur justifie l'effectif de 6 030 par un plan expérimental stéréotypé et conclut que le recours au modèle animal est "nécessaire", la culture cellulaire ne reproduisant pas les interactions entre organes.

Objectifs

L’hypertension artérielle maligne est définie par l’association d’une tension artérielle élevée à des signes objectifs de l’atteinte des organes cibles de l’hypertension artérielle : reins, cerveau, rétine, coeur. Les objectifs du projet seront d'étudier une voie protectrice des vaisseaux sanguins dans l'hypertension artérielle. L’intérêt de ce projet est donc de comprendre deux systèmes modifiant la tolérance des vaisseaux sanguins à l’hypertension artérielle en particulier dans le coeur et les reins. Le projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aboutir à l'identification de paramètres sanguins et de variants génétiques qui pourraient être des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. Si l'hypothèse proposée se confirme, ceci pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'une hypertension artérielle maligne.

Procédures

Etablissement 1: Injections (5 x 30 secondes), chirurgie légère sous anesthésie générale avec analgésie (1 x 5 minutes), prélèvement d'urine en cage métabolique ( jusqu'à 5 fois, 6h à chaque fois), prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois au moment de la mise à mort). Etablissement 2: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (1 fois 20 minutes)

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines). Stress lié au transport des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus

Remplacement

Différentes approches sont utilisées pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'hypertension artérielle comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi le recours au modèle animal est nécessaire, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un maximum d'organes d'intérêt par animal est prélevé afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront élévés en cages enrichies et surveillés quotidiennement pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées dès que nécessaire. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasives, sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, le modèle d'hypertension artérielle utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Nous utilisons des souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux

Un rat qui atteint un point limite est anesthésié puis tué par injection, sans qu'aucun traitement ne soit venu soulager son état auparavant, le porteur écrivant que l'objet même de l'étude lui interdit d'atténuer le mal-être occasionné. 288 rats d'une souche développant spontanément une polykystose rénale vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils passent deux échographies cardiaques et trois IRM sous anesthésie, deux séjours en cage métabolique isolée pour la collecte des urines et des fèces, puis une cathétérisation du ventricule droit par la carotide, geste après lequel ils sont tous mis à mort. Le porteur affirme que le recours aux animaux est obligatoire, aucune approche in silico, in vitro ou ex vivo ne permettant selon lui de faire interagir tous les mécanismes en jeu.

Objectifs

La polykystose rénale autosomique dominante est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente,et généralement liée à des mutations des gènes . Le complexe des polycystines est notamment exprimé dans les cellules épithéliales rénales et les cellules endothéliales, où il joue un rôle essentiel dans la fonction rénale. La maladie se caractérise par une atteinte cardiaque et vasculaire dont les conséquences sont majeures mais les mécanismes mal compris. Notre hypothèse est que l’atteinte endothéliale spécifique de la maladie contribue à la pathologie cardiovasculaire et possiblement rénale présentée par ces patients

Bénéfices attendus

La polykystose rénale autosomique est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente, caractérisé par un déclin lent et progressif de la fonction rénale. Malgré les traitements actuel la polykystose rénale autosomique évolue obligatoirement vers une insuffisance rénale terminale. Cette dernière est associée à une pronostic faible et une mauvaise qualité de vie. Notre hypothèse est que la neutralisation de la vasopressine circulante réduit la progression des dysfonctions rénales et cardiaques et pourrait donc constituer un nouveau traitement dans la polykystose rénale autosomique chez des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à différente interventions : -Echographie cardiaque sous anesthésie gazeuse ( Nombre maximal de passage 2 fois/ rat ) -IRM sous anesthésie générale ( Nombre de passage 3/rat ) - Filtration glomérulaire, injection du traceur sous anesthésie dans la voie caudale et pose du récepteur sur le dos de l'animal grâce a un adhésif ( injection du traceur sous anesthésie gazeuse) - Placement des rats dans des cages métabolique isolé pour récupération fèces et urine ( Nombre maximal de passage 2 fois/ rat )- cathétérisation du ventricule droit par la carotide sous anesthésie pour une prise de pression volume du cœur ( Nombre de passage 1/rat ) puis mise à mort de l'animal après injection d'un euthanasiant en Intrapéritonéal. La polykystose rénale est une maladie génétique caractérisée par l'apparition progressive de kystes sur les reins. Ces kystes peuvent entraîner des douleurs légères au début de la maladie, avant de provoquer, avec le temps, une augmentation du volume rénal et des complications.

Impact sur les animaux

Le phénotype de la polykystose entraîne des douleurs légères dues à l'apparition progressive de kystes sur les reins, au fur et à mesure que la maladie se développe. Les injections Intra péritonéales pour induire d'anesthésique / Analgésie entraînent une légère douleur d'une courte durée qui va induire une sédation chez l'animal. L'injection du produit à tester entraîne une légère douleur d'une courte durée et le produit ne vas pas entraîner de complication. La piqûre lors de l'injection du traceur dans la veine caudale peut entraîner une douleur légère de courte durée.

Devenir

Pour les deux procédures tous les animaux seront mis à mort suite à l'évaluation invasive par cathétérisme cardiaque.

Remplacement

L’utilisation des animaux est obligatoire, car le développement de la dysfonction rénale et de la dysfonction cardiaque lors de la polykystose rénale autosomique est multifactoriel et aucune approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet l'implication/interaction de tous les mécanismes impliques. Cependant dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules) pour étudier les mécanismes impliqués dans les effets observés.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaires comme recommandé car le comité éthique. . Nous prenons donc en compte ce que nous a calculé le logiciel. Le nombre d’animaux nécessaire est de 288 animaux. On a pris en compte comme paramètre principale les dimensions ventriculaire gauche en diastole. Ce qui donne nombre total d’animaux 288 .Cela à démontré que des groupes de n=18 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. Notamment, l’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif.

Raffinement

Depuis le dépôt de la DAP l’infrastructure de l’animalerie a changé et nous permet un raffinement plus adapté pour nos animaux. Leurs hébergement se fait sur portoir ventilé hébergé deux par deux avec abreuvage automatique de l’eau avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et mise à mort en fonction de son score . Le but de l’étude est d'évaluer le traitement sur les fonctions cardiovasculaires et rénal cela nous empêche de mettre des traitements en route pour atténuer le mal-être occasionné mais nous faisons une surveillance accrue sur les points limites à ne pas dépasser durant l’étude. Les animaux seront observés 1 à 2 fois par jour pendant l'étude. Dès qu'un point limite est atteint l'animal sera anesthésie et mis à mort par injection d'euthanasiant .

Choix des espèces

Les effets de l’anticorps neutralisant la vasopressine seront déterminés en utilisant la souche de rats. Cette souche a la particularité de développer spontanément un polykystose rénale comparable aux polykystose rénale humain. De plus seul l'utilisation des animaux vivants permette de comprendre les interactions entre les différents organes (rein, coeur, foie...) et les altérations neurohumorales, immunitaires, métaboliques . Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles jeunes seront randomisés dès l'âge de 4 semaines et suivie pendant 6 semaines puisque le developpement rapide de la dysfonction rénale est associé à une mortalité très élévée après l'âge de 10-12 semaines. Nous effectuerons nous même au sein de notre animalerie les reproductions nécessaires pour obtenir les 288 animaux demandé au sein de l’étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc porteuse d'un phénotype dommageable dès le départ. 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre comment les cellules immunitaires participent à la maladie de l'oreillette qui accompagne l'obésité. Certaines subissent l'ablation de la rate, puis quatre mois de régime gras, une prise de sang hebdomadaire sur animal vigile, deux tests métaboliques de deux heures avec huit prélèvements chacun, des échocardiographies et des électrocardiogrammes sous anesthésie, d'autres l'implantation sous-cutanée d'une pompe. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tissus, une mise à mort que le porteur présente comme "la seule solution éthique permettant d'obtenir des résultats fiables".

Objectifs

La fibrillation atriale est l’arythmie cardiaque la plus fréquente en pratique clinique. Elle est la principale cause d’accidents vasculaires cérébrales et de l’insuffisance cardiaque. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population. Les thérapies actuelles sont limitées, ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. De nombreux facteurs de risques y sont associés tels que le vieillissement, l’hypertension et les syndromes métaboliques comme l’obésité. Chez les patients obèses, son incidence augmente avec l’indice de masse corporel. A l’échelle du tissu, l’oreillette est dilatée et accumule du tissu gras. Ce remodelage tissulaire est une cardiomyopathie atriale qui évolue par une disparition du tissu gras et un remplacement par une matrice, la fibrose. Comme les autres tissus affectés par l’obésité, une réponse systémique active l’inflammation et le système immunitaire contribuant ainsi à l’activation de précurseurs qui sont à l'origine du tissu gras et de la fibrose. L’hypothèse est que les cellules immunes sont impliquées dans le développement de la maladie. Les objectifs sont 1-d’identifier la nature et la source des cellules immunes, et 2-de moduler leur rôle dans la maladie. Pour développer ces objectifs, des modèles murins soumis à une alimentation enrichie en régime gras sera utilisée pour induire l’obésité et le développement de la cardiomyopathie. L’étude du rôle des cellules immunes sera aussi effectuée dans des modèles de souris génétiquement modifiés.

Bénéfices attendus

Le projet porte sur la compréhension du remodelage atrial dans le contexte de l'obésité et sur la modulation de molécule cible. Cette étude permettra de développer une thérapie ciblée en vue d'une meilleure prise en charge des patients. En effet, le but de se projet est de pouvoir cibler des biomarqueurs précoce afin de ralentir le dévelopement de la maladie et de prévenir la fibrillation atriale.

Procédures

Une partie des animaux subiront une chirurgie d’ablation de la rate (1 fois, 10-15 minutes par animal) effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Les animaux seront ensuite placés sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Après 1 semaine de régime, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin chaque semaine sur animal vigile (1 fois par semaine, quelques secondes par animal). Après 2 mois (8 semaines) et 4 mois (16 semaines) de régime, 2 tests métaboliques seront réalisés afin d’évaluer les syndromes métaboliques (2 tests, 2 fois à 2 mois et 4 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (2 fois à 2 mois d’intervalle, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (2 fois à 2 mois d’intervalle, moins de 5 minutes par animal). Une seconde partie des animaux seront préalablement placés sous régime riche enrichie en graisse pendant 2 mois. Après 4 semaines de régime, ils subiront une chirurgie d'insertion sous-cutanée d'une pompe osmotique à délivrance contrôlée de molécules (1 fois, 5 minutes par animal). La réalisation est effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Après 1 mois (4 semaines) de régime, 2 tests seront réalisés afin d’évaluer syndromes métaboliques (2 tests, 1 fois à 1 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (1 fois après 2 mois de régime, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (1 fois après 2 mois de régime, 3 mintues par animal). A la fin de chaque période de maintien, les animaux subiront un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements sanguins pourront induire une douleur aux animaux. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entrainer une prise de poids ou une perte de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les tests métaboliques sont une nuisance associée à la sensation de faim liée à la mise à jeun, le stress et la douleur de courte durée lors des administrations de molécule puis celles associés aux prélèvements sanguins de faible volume et un risque de saignement. Le régime gras peut engendrer des démangeaisons cutanées. Le gavage par canule apporte un stress à l'animal notamment par la contention au niveau de la nuque et peut également irrité la cavité buccale/œsophage de l’animal. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). Elle engendre aussi des difficultés de déplacements et une fragiltié à s'alimenter et peut engendrer une douleur post opératoire. Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Des animaux à phénotype dommageable (immunodéficience) seront utilisés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée, afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.

Remplacement

Des lignées de cellules de macrophages sont étudiées in vitro. Néanmoins le statut métabolique et le phénotype des macrophages sont un biais dans la véracité des résultats. D'autre part, l'étude porte essentiellement sur un dialogue inter-organe influencant le phénotype des cellules et l'environnement du tissu. Ainsi, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cardiomyopathie atriale (CMA) et est indispensable dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité du système immunitaire et son impact dans l'organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement cardiaque.

Réduction

1000 animaux seront utilisés. Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé statistiquement afin d'obtenir des résultats fiables. Le nombre d'animaux est aussi calculé suite à des études antérieures. Les paramètres échocardiographie et d'obésité seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les anesthésies utilisés sont adaptés selon la procédure. Lors de la procédure de chirurgie, les animaux sont placés sus un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Les analgésiques sont utilisés par injection. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 animaux maximum par cage) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les animaux sont mis en présense de jouet de raffinement (tunel, maisonnette). Leur cage est enrichi avec des objects réglementaires d'enrichissements, des batonnets. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement sur les critères de prise de poids et de l'état de la cicatrice post-chirurgie. Les points limites seront définis pour ce projet.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus approprié pour nos études car elles sont vulnérables à la fibrillation atriale (FA) et susceptibles de développer la cardiomyopathie atriale (CMA). C’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des gènes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Souris adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.