Système cardiaque
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Étude du transport cérébrale des hormones thyroïdiennes chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Jusqu'à dix injections intrapéritonéales par animal, une injection intraveineuse sous anesthésie générale, une injection sous-cutanée : le protocole décrit ne va pas plus loin pour 1 488 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour des analyses post-mortem. Il s'agit d'ouvrir la barrière qui protège le cerveau afin de voir si un médicament y diffuse mieux lors d'une maladie cérébrale. Sur le remplacement, le porteur écrit en une phrase que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro et qu'elle est conservée entre humain et souris. Il annonce des phénotypes dommageables, perte de mobilité, baisse de la consommation alimentaire et survie médiane de 250 jours, sans nommer la maladie induite ni préciser combien de souris la subiront.
Objectifs
Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et forme ainsi une véritable barrière. Cependant, cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de cette barrière. Le but de ce projet et d’étudier l’impact d’une ouverture de la barrière du cerveau sur la diffusion et l’efficacité d’un médicament lors d’une maladie cérébrale.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des médicaments dans le cerveau lors de maladie ou la barrière du cerveau limite fortement leurs efficacités.
Procédures
Injection intrapéritonéales (< 1 minute) : Maximum de 10 injections par souris. Injection intraveineuse (1 minute) : Maximum de 1 injection par souris. Les injections intraveineuses seront effectuées sous anesthésie générale. Anesthésie générale (maximum 1 heure) : 1 injection par animal. Injection sous-cutanée (1 minute) : Maximum de 1 injections par souris.
Impact sur les animaux
Douleurs légères et transitoires liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances liées à l’apparition de phénotypes dommageables lors de la progression d’une maladie cérébrale : diminution des propriétés locomotrices (perte de mobilité), diminution de la consommation d’aliment induisant une perte progressive de poids et survie médiane de 250jours (des points limites adaptés ont été mis en place pour les différentes procédures)
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
La complexité de la barrière du cerveau ne peut pas être répliquée mais se retrouve conservé entre humains et souris, faisant de la souris est un modèle nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes ainsi que via l’utilisation d’un logiciel statistique en fonction des critères de taille d'effet et d'écart type propre à chaque procédure. Les résultats seront analysés par tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour éviter le stress et la douleur, les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale. Les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale et antalgie Les procédures se dérouleront sous la surveillance d'expérimentateurs formés. Des points limites adaptés ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière du cerveau qui ne peut pas être répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris transgéniques recapitulant des maladies cérébrales humaine. La barrière du cerveau commence à se mettre en place durant le développement embryonnaire, et mature durant le développement post-natal jusqu’au 33ieme jour de vie chez la souris (J33). Ainsi, l’étude se fera aux stades nouveau-nées et adultes avec le but d’étudier l’impact d’une ouverture de la barrière du cerveau pendant la maturation ou pendant le maintien de cette dernière.
Entretien et génotypage invasif de lignées de souris avec cardiomyopathie dilatée et atteinte musculaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation qui provoque une cardiomyopathie dilatée, ces souris développent une atteinte cardiaque vers neuf mois, avec une mobilité réduite, une douleur et une mort prématurée autour d'un an. 534 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'acte déclaré se limitant à une biopsie de queue prélevée en quelques secondes sur des souriceaux de 7 à 14 jours. Le porteur indique limiter volontairement leur utilisation à six mois, soit avant l'apparition du phénotype pour lequel la lignée est entretenue. La grande majorité des hétérozygotes partira vers d'autres projets d'expérimentation, certains encore en cours d'écriture, et les animaux sans le génotype recherché comme les anciens reproducteurs seront tués.
Objectifs
Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement d'une famille de maladies rares présentant une atteinte cardiaque (cardiomyopathie dilatée) associée ou non à des atteintes musculaires (prévalence estimée à environ 9 sur 100.000). Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche. Chez ces souris, à l'état hétérozygote, la mutation du gène impliqué dans la pathologie entraine une cardiomyopathie dilatée ; tandis qu'à l'état homozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée précoce associée à une atteinte musculaire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du bon génotype indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie (cardiomyopathie associée ou non à une atteinte musculaire) et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques dans les dystrophies musculaires et cardiomyopathies liées aux mutations d'un gène impliqué dans une famille de maladies rares affectant le coeur et les muscles, et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La cardiomyopathie liée à ce gène est la plus agressive des cardiomyopathies pour laquelle il n'existe aucune alternative thérapeutique à l'heure actuelle en dehors de la transplantation cardiaque.
Procédures
Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigil. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourront induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Les souris hétérozygotes développent un phénotype cardique vers l'âge de 9 mois, pouvant induire une mobilité réduite et une douleur conduisant à une mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Dans ce cadre, notre utilisation de ces souris est limitée à 6 mois afin de se placer avant la survenue du phénotype dommageable.
Devenir
La grande majorité des animaux hétérozygotes sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires participant au développement d'une atteinte cardiaque, musculaire et adipeux, organes qui communiquent entre eux. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.
Réduction
534 animaux seront utilisés dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés (si nos besoins sont en baisse, nous pourrions être amené à réduire le nombre d'accouplements, à procéder à de la cryopréservation). Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La technique utilisée pour la réalisation des biopsies est la biopsie caudale, technique recommandée par les différents comités nationaux. Les biopsies sont réalisées avec du matériel propre et désinfecté, une compression avec de l'essuie tout propre est effectué pour stopper le micro-saignement. Les souriceaux sont sur surveillance jusqu'à ce que leur mère les reprenne en charge dans le nid. Un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire et cardiaque est la souris. Des animaux modèles de la maladie sont indispensables pour étudier le muscle/coeur in vivo dans un système pathologique. Les animaux sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 6 mois de vie pour les reproducteurs. Afin de limiter au maximum la manipulation des animaux, le prélèvement pour génotypage est réalisée en même temps que l'identification individuelle, soit sur des souriceaux âgés de 7 à 14 jours de vie. Nous limitons volontairement l'utilisation des animaux jusqu'à 6 mois de vie, nous plaçant ainsi plusieurs mois avant le développement du phénotype dommageable survenant vers 9 mois de vie.
Evaluation de la capacité de l’hespéridine à moduler les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires après un repas
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Cinq prises de sang de six gouttes, une par heure, puis six autres prélèvements et une injection intraveineuse tous les quatre jours pendant deux semaines : 368 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous tués pour prélever leur sang, leur aorte et leur cœur. La question posée porte sur les vésicules extracellulaires libérées après un repas et sur la capacité d'un polyphénol, l'hespéridine, à en modifier la quantité et le contenu. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées de la queue peuvent laisser des bleus et une irritation, et qu'une manipulation excessive de cette queue perturbe la régulation de la température de l'animal. Le choix de rats de 8 à 12 semaines est présenté comme un geste éthique, l'argument étant que des individus physiologiquement stables réduisent la variabilité et donc le nombre d'animaux non-humains à utiliser.
Objectifs
Le stress nutritionnel après le repas est connu pour être à l’origine d’altérations transitoires dans le fonctionnement normal du métabolisme, mais que répétées dans le temps, sont associées au développement des maladies métaboliques et cardiovasculaires. D’autre part, il est connu que des petites vésicules libérées par toutes les cellules de l’organisme peuvent se retrouver dans le sang et sont impliquées dans le bon fonctionnement du corps. De plus, une augmentation du taux circulant de ces vésicules est associée avec l’apparition de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, l’effet des vésicules produites après un repas sur les fonctions cardiovasculaires est peu connu. Des approches nutritionnelles à base d’aliments végétaux riches en composés naturels appelés polyphénols, connus pour leurs bienfaits sur la santé, se sont avérées capables de réduire l’élévation du taux de ces vésicules extracellulaires lors de désordres cardio-métaboliques. Toutefois, l’impact quotidien de notre alimentation et de ces constituants végétaux sur la libération des vésicules extracellulaires après un repas et leurs activités biologiques n’est pas connu. Ce projet fait l’hypothèse selon laquelle les polyphénols apportés par la composante végétale de notre alimentation peuvent impacter favorablement la biologie des vésicules extracellulaires après un repas notamment en réponse à un stress nutritionnel. Pour répondre à cela, le premier objectif est de caractériser de façon fine les vésicules extracellulaires libérées (origine cellulaire et contenu) à la suite d’un stress après un repas et de déterminer les constituants permettant d’identifier spécifiquement les vésicules extracellulaires post-repas. Le projet a également pour but de déterminer le rôle biologique des vésicules extracellulaires post-repas, notamment sur certaines fonctions cardio-métaboliques. À partir des connaissances ainsi générées, nous pourrons évaluer la capacité de certains polyphénols à moduler la libération, le contenu et les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires produites après un repas.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet est un prérequis à la compréhension du rôle des vésicules extracellulaires post-repas dans les effets de notre alimentation, et tout particulièrement de la composante en polyphénols des produits végétaux, sur notre physiologie et notre santé. Dans son ensemble, le projet permettra d’apporter un éclairage nouveau sur la réponse post-repas et son rôle primordial dans la mise en place des désordres cardiométaboliques.
Procédures
- Gavage (1 fois/animal, < 1 minute), - Prélèvement de sang pour doser les vésicules extracellulaires (5 prélèvements de 6 gouttes de sang par animal, 1 prélèvement/heure, durée de chaque prélèvement < 1 minute). - Supplémentation de la nourriture avec de l’hespéridine (durée acte : 4 semaines), - Injection intraveineuse (1 injection tous les 4 jours pendant 2 semaines, durée de chaque injection < 5 minutes), - Prélèvement de sang pour étude métabolique (6 prélèvements d’une goutte de sang par animal, durée de chaque prélèvement < 1 minute).
Impact sur les animaux
1. Gavage : Les animaux peuvent ressentir une gêne passagère lorsqu’un petit tube est introduit dans leur gorge pour administrer une substance. Cette procédure peut être un peu stressante, car elle nécessite de tenir l’animal immobile pendant un court moment. Si elle n’est pas faite correctement, elle pourrait provoquer de petites irritations internes. 2. Injections dans la queue : Les injections dans une veine de la queue peuvent provoquer une légère douleur au moment de la piqûre. Si plusieurs tentatives sont nécessaires, cela peut être un peu plus désagréable pour l’animal et entraîner une légère irritation ou un petit bleu. Dans certains cas, l’animal peut lécher ou mordiller la zone concernée. 3. Prises de sang dans la queue : Comme pour les injections, cette procédure nécessite de maintenir l’animal immobile, ce qui peut être stressant. La piqûre peut provoquer un léger inconfort, et des bleus ou une irritation peuvent apparaître si les prélèvements sont répétés trop souvent. Une manipulation excessive de la queue peut aussi perturber la régulation naturelle de la température chez l’animal.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus (sang, aorte, cœur) seront effectués sur les animaux euthanasiés afin d’analyser les effets cardiovasculaires et métaboliques de l’étude.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement d’autres méthodes permettant d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants. Pour comprendre comment le stress après un repas agit sur l’organisme, et comment certains composés comme les polyphénols peuvent influencer la circulation de petites particules appelées vésicules extracellulaires, il est nécessaire d’observer ces réactions directement dans un organisme vivant. Cela permet d’étudier des phénomènes complexes qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire autrement.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de gavage chez le rat. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique pour déterminer le minimum numéro d’animaux nécessaire pour assurer la validité des résultats obtenues.
Raffinement
Pour favoriser la socialisation des animaux, nous placerons au maximum trois animaux par cage. Nous avons raffiné nos approches afin de minimiser la détresse imposée aux animaux, qui seront hébergés dans un environnement enrichi répondant à leurs besoins physiques et comportementaux. Dans la cage, les animaux auront à leur disposition des tubes en plastique opaque pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. L’état de santé des animaux sera évalué régulièrement par l’expérimentateur (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée du protocole, en observant leur comportement. Si une douleur est anticipée ou si les animaux présentent des signes pouvant suggérer du stress ou de la douleur après une manipulation, une grille de scoring spécifique avec des seuils prédéfinis sera appliquée. Le cas échéant, des médicaments appropriés (anesthésiques ou analgésiques) seront administrés, conformément aux recommandations vétérinaires et aux bonnes pratiques en expérimentation animale. Le suivi de ces animaux sera alors effectué quotidiennement dès l’apparition de ces signes. Si l’animal se rétablit, le suivi régulier sera repris jusqu’à la fin de la procédure. En revanche, si son état se détériore, le seuil limite sera appliqué et une euthanasie sera réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est basé sur notre connaissance de ce modèle, ainsi que sur la disponibilité de données dans la littérature associées à un stress après un repas de courte durée. Les rats âgés de 8 à 12 semaines sont dans une phase de développement adulte jeune, ce qui les rend physiologiquement plus stables et donc plus fiables pour les expériences. À cet âge, ils ont dépassé les changements hormonaux liés à la puberté et ne sont pas encore affectés par les effets du vieillissement, ce qui permet d'obtenir des résultats plus cohérents et précis. D'un point de vue éthique, cette tranche d'âge respecte les principes de la science responsable. En effet, les rats à ce stade sont plus stables physiologiquement, ce qui permet de réduire les variations entre les individus et de mieux contrôler les expériences. Cela permet aussi de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Choisir des rats à ce stade évite l'utilisation d'animaux trop jeunes, plus vulnérables, ou trop âgés, susceptibles de présenter davantage de risques. En résumé, l'utilisation de rats adultes jeunes garantit des résultats plus fiables tout en assurant leur bien-être et en réduisant le nombre d'animaux utilisés pour l'expérience.
Prélèvement invasif de tissus pour génotypage de lignées de souris pour l’étude du rôle endothélial de CD146 dans les maladies cardiovasculaires
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Maintenues en vie et versées au fil de l'eau à d'autres projets d'expérimentation de l'établissement, 1 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en quelques secondes : au sevrage, à quatre semaines, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur l'animal éveillé, ce qui peut saigner, le saignement étant arrêté par compression au coton. Le porteur écarte toute analgésie, jugeant qu'elle ajouterait un geste invasif et que les animaux biopsiés ne présentent pas une douleur qui la justifie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les plaques d'athérosclérose et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux génétiquement altérés.
Objectifs
Ce projet consiste à effectuer des biopses de queues sur les souris génétiquement modifiées qui ont intégrées dans tous nos projets scientifiques en cours et à venir (ayant déjà des autorisations de projet ou en cours) dans le but de génotyper nos lignées. La nouvelle réglementation exige désormais une autorisation pour ces prélèvements invasifs en vue de génotypage. Nos projets en cours concernant la compréhension du rôle d'une molécule d'adhésion dans les maladies cardiovasculaires. Cette molécule est exprimée par différents types cellulaires et nous souhaitons préciser son rôle lorsqu'elle n'est exprimé que par les cellules endothéliales. Nous utilisersons donc des modèles expérimentaux délétés pour cette molécule uniquement au niveau de l'endothélium.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour nos projets scientifiques ainsi que leur génotypage et le contrôle qualité de nos lignées murines.Les animaux utilisés dans ce projet permettront d'apporter de nouvelles données dans la compréhension du rôle d'une molécule d'adhéson dans les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Cette intervention se fera sur animal vigile et ne durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue au moment du sevrage à 4 semaines, donc éventuellement un saignement. Le fait de manipuler l'animal par contention engendre également un stress chez ce dernier.
Devenir
Animaux maintenus en vie, utilisation continue dans des DAP d'expérimentation.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro mimant les plaques d'athérosclérose et suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur le rôle d'une molécule d'adhésion dans la progression des maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours.
Réduction
Nous appliquerons la stratégie de réduction, à savoir 1/ l'utilisation dès que possible de schémas d'accouplements ne nécessitant pas ou peu de génotypage, 2/ des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques), 4/ le développement en parallèle des méthodes de génotypage sous le seuil telles que la biopsie de poils . Au total, dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux nécessaires aux expérimentations, à savoir un nombre de 1000 souris qui résulte du nombre de souris nécessaire en lien avec nos besoins expérimentaux pour atteindre la puisance statistique nécessaire minimale.
Raffinement
Concernant le prélèvement invasif, il s'agit d'une méthode éprouvée, précise, rapide et standarisée, ce qui limite les effets indésirables liés au stress et à la douleur,cela peut éventuellement entraîner un saignement et une douleur, saignement qui sera arrêté par compression à l'aide d'un coton. Egalement, l'analgésie systématique n'est pas pertinente (elle se ferait par injection, ce qui ajoute un geste invasif alors que les animaux biopsiés ne presentent pas une douleur justifiant cette dernière).
Choix des espèces
Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours. Afin de pouvoir définir le phénotype des souris, un génotypage est nécessaire. Les animaux seront prélevés à l’âges de 20 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.
Rôle d’AhR et de MCP1 dans les processus de sténose et de thrombose de la fistule artério-veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Poils hérissés, dos courbé, posture prostrée : ces signes, attendus plus tôt chez les souris rendues insuffisantes rénales, déclenchent la mise à mort. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour histologie. Chacune subit trois interventions chirurgicales de vingt minutes, deux pour provoquer une maladie rénale chronique et une pour créer une fistule entre une artère et une veine, une partie d'entre elles recevant en plus vingt-quatre gavages sur sept semaines. L'objet est de comprendre pourquoi les fistules de dialyse se bouchent, complication qui cause 30 % des hospitalisations de patients dialysés, et le bénéfice annoncé se limite pour l'instant à "proposer des cibles thérapeutiques".
Objectifs
Au stade terminal de maladie rénale chronique (MRC) les patients bénéficient d’un traitement par dialyse qui consiste à épurer le sang en remplacement des reins qui ne fonctionnent plus. La fistule artério-veineuse (FAV) qui consiste à relier chirurgicalement une veine superficielle du bras à une artère, est indispensable pour épurer le sang par dialyse. Cependant, il arrive fréquemment que la FAV rétrécisse ou se bouche amenant à son dysfonctionnement. C’est une complication majeure qui est responsable de 30% des hospitalisations des patients en dialyse et les mécanismes liés à cette dysfonction ne sont pas décrits à ce jour. Notre hypothèse est que des toxines, dont la concentration est élevée dans la circulation sanguine de ces patients, provoquent ce dysfonctionnement amenant à l’échec de fistule artério-veineuse. Notre objectif est d'étudier in vivo, dans un modèle animal de maladie rénale chronique et de FAV, le rôle des toxines et de leur récepteur dans l’échec de création de fistule artério-veineuse (FAV). Nous testerons : 1) Si la maladie rénale chronique augmente le taux d’échec de FAV, et 2) si l’inhibition du récepteur aux toxines permet d’augmenter le taux de réussite de création de FAV.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes liés à l'échec de création de fistule artério-veineuse (FAV) et de proposer des cibles thérapeutiques afin d'améliorer la qualité des séances de dialyse et par conséquent la qualité de vie des patients atteints de maladie rénale chronique.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux seront soumis à des 2 interventions chirurgicales pour reproduire une maladie rénale chronique, sous anesthésie générale, espacées d'une semaine et chaque interventionchirurgicale durera 20 minutes. Deux semaines après, ces mêmes animaux seront soumis à une 3ème intervention chirurgicale pour la création de la fistule artério-veineuse (FAV) qui durera 20 minutes également. Les animaux de la procédure n°2 seront soumis aux mêmes interventions chirurgicales que ceux de la première procédure à savoir 3 chirurgies de 20 min (à 8, 9 et 11 semaines de vie). Ces mêmes animaux seront également soumis à un gavage oral toutes les 48h pendant 7 semaines et chaque gavage durera quelques secondes, soit 24 gavages sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées aux différentes procédures chirugicales (douleur et/ou risque infectueux), aux gavages par voie orale (stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale des souris qui aurons une maladie rénale chronique (MRC). Chez ces souris MRC, nous nous attendons à observer une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prèlèvements de tissus à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes liés aux échecs de fonctionnement des fistules artério-veineuses.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur les mécanismes de dysfonctionnement des fistules artério-veineuses (FAV) qui sont fréquentes chez les patients traités par dialyse. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux sauvages et génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons tous les animaux, à savoir 192 souris. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du centre de recherche et d'autres équipes s'intéressant à la maladie rénale chronique.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, et angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal sera évaluée sur les paramètres suivants : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Des mesures seront prises en fonction de ces scores pour éviter tout inconfort de l’animal. Nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale et aux suivis postopératoires. Le contrôle quotidien des animaux sera réalisé par un technicien animalier et la mesure du poids sera réalisée au moyen d'une petite balance de paillasse deux fois par semaine. Les animaux seront hébergés par groupes de 5 individus au maximum par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de dômes ou de matériaux de nidification de type « Nestlets ». Les quantités de nourriture et d'eau de boisson seront aussi vérifiées quotidiennement. Concernant la chirurgie, l’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant les chirurgies en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant pendant et après chirurgie et une analgésie avant et après les chirurgies sera mis en place pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie est prévue. Pour l'administration d'un composé par gavage, des canules en plastique seront utilisées afin de réduire le risque de blessure et cette procédure d'administration sera réalisée par une personne expérimentée à cette technique.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique (MRC) sont essentiels pour l’étude des évènements physiopathologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une MRC. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour générer des animaux génétiquement altérés. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté soit révolue (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle). Toutes les expérimentations seront réalisées avec des souris au stade adulte. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes. Il faut donc utiliser un modèle murin adulte pour ce projet. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les procédures chirurgicales sur des souris de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie également d'utiliser les souris au stade adulte.
Biomarqueurs et mécanismes de la fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature de l'uretère sous anesthésie, une opération d'environ dix minutes qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque en dix jours une fibrose du rein, avec un risque de saignement, de cicatrice mal refermée ou infectée. Une partie des souris est ensuite transportée entre deux établissements utilisateurs, dans des sacs isothermes, pour un trajet de cinq à huit minutes, avant les prélèvements terminaux de reins, de plasma et d'urine. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"indispensable" pour comprendre l'insuffisance rénale chronique et indique tenir une veille bibliographique sur d'éventuelles méthodes alternatives.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.
Procédures
- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.
Impact sur les animaux
Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Identification de facteurs du tissu adipeux impliqués dans l’émergence de l’insulino-résistance programmée par un retard de croissance intra-utérin dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Les souriceaux étudiés naissent avec un retard de croissance provoqué, leur mère ayant reçu un régime pauvre en protéines pendant une semaine de gestation. 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec pour une partie d'entre elles huit semaines de régime gras et sucré, des jeûnes de cinq à quinze heures et six prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur indique que le transfert des nouveau-nés vers des femelles adoptantes peut provoquer un rejet, ou dans de rares cas un cannibalisme maternel. Les femelles qui ont produit ces portées sont tuées à la fin de leur période de reproduction, sans qu'aucun prélèvement soit effectué sur elles.
Objectifs
L’environnement nutritionnel fœtal peut programmer des maladies cardio-métaboliques à l’âge adulte comme la résistance à l’insuline, notamment suite à une exposition à un régime faible en protéines. Des données de la littérature suggèrent que cette programmation passerait en majorité par les hormones du stress, les glucocorticoïdes. En outre, des données récentes suggèrent que les cellules du tissu adipeux pourraient avoir un rôle important dans l’initiation et le développement de la résistance à l’insuline, aboutissant au final à l’émergence d’un diabète. Ce projet a pour objectif de i) valider cette hypothèse et ii) d’étudier les mécanismes et les molécules impliqués.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de révéler de nouveaux mécanismes associés au développement de maladies métaboliques suite à une malnutrition fœtale. De plus, cette étude pourrait mettre en évidence de nouveaux marqueurs qui pourraient être utilisés à terme pour diagnostiquer précocement des personnes fragiles ou comme des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrer la survenue de maladies métaboliques chez l’Homme.
Procédures
Les souris femelles servant à générer les souriceaux nés avec un retard de croissance intra-utérin (qui sont l’objet de l’étude) seront exposées à un régime hypo-protéique/iso-calorique durant une semaine au cours de la gestation. Une partie des animaux sera ensuite soumise à un régime riche en graisse et en fructose pendant 8 semaines. Les animaux seront impliqués dans deux mesures de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises soit à un test pour évaluer la tolérance au glucose soit un test pour évaluer la tolérance à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon le test), les souris seront injectées en intrapéritonéal ou gavés et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 fois par animal). Enfin, une partie des animaux subira une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux sera anesthésiée et analgésiée pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.
Impact sur les animaux
Le retard de croissance intra-utérin est induit par un régime faible en protéines chez la femelle en gestation. Le changement de régime pourrait induire une néophobie et une malnutrition. Afin de garantir un accès au lait similaire pour tous les souriceaux, les femelles seront hébergées de manière individualisée 5 jours avant la mise bas. Cela pourrait induire un léger stress social. Enfin, la manipulation des nouveau-nés pourrait induire un stress chez les petits ainsi que chez les femelles adoptantes pouvant induire un rejet ou dans de rares cas un cannibalisme maternel. A l’âge adulte, une partie des souris sera exposée à un régime riche en graisse et en sucre afin d’induire une altération du métabolisme lipidique et une insulino-résistance. Les animaux seront soumis à des mesures de la composition corporelle qui pourrait induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure. Les animaux seront inclus dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces tests impliquent une mise à jeun comprise entre 5h et 15h selon les actes. Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Les challenges métaboliques pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée liée à la contention, l’administration par gavage et/ou injection, et les prélèvements sanguin de faible volume, ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Enfin, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin ou une chirurgie immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproduction sans prélèvement. Les souris produites dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des analyses in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet est focalisé sur l’initiation de l’insulino-résistance par l’alimentation périnatale au niveau du tissu adipeux et sa propagation vers les autres tissus. Un organisme vivant est donc nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeux. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu (adipocytes, macrophages résidents, hépatocytes, cellules musculaires) avec les différentes fenêtres temporelles impliquées (périodes périnatale et adulte).
Réduction
Le projet impliquera un total de 660 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un effectif de 12 souris par groupe sera nécessaire pour les approches in vivo dynamiques telles que les tests sensibilité insuline et de tolérance orale au glucose. Les approches associées à des mesures moléculaires, et d’histologie nécessiteront un effectif plus faible du fait de la réduction de la variabilité attendue. Pour ces approches, un effectif de 8-6 souris par groupe sera nécessaire, respectivement. Concernant les approches nécessitant un tri de cellules, et vue le développement du tissu adipeux sous régime riche en graisse, un effectif de 8 souris par groupe sera nécessaire pour celui-ci et un effectif de 16 souris par groupe sera nécessaire pour celles sous régime standard. En effet, un pool de deux tissus sera obligatoire pour obtenir le nombre de cellules requises pour les analyses ultérieurs. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. La principale contrainte concerne les modifications de régime durant la période de gestation et la manipulation des nouveau-nés lors des adoptions requises dans le cadre de ce projet. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible : les petits seront roulés dans la litière souillée et mouillée de la femelle adoptante, puis séchés dans du coton issu du nid afin de faciliter la prise en charge par la femelle adoptante. Le régime riche en graisse sera placé en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques mise en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduite au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques. De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Le projet a pour but d’identifier le rôle du tissu adipeux dans l’initiation de l’insulino-résistance et les mécanismes impliqués dans sa propagation aux autres organes. Cette résistance à l’insuline, qui conduit au diabète, peut être programmée durant la période fœtale si la mère est exposée à une malnutrition pendant sa grossesse. Ceci pourrait impliquer les hormones du stress. De plus, la propagation de la résistance à l’insuline pourrait nécessiter une communication entre divers cellules et organes. Ainsi, nous avons besoin pour atteindre les objectifs de ce projet, d’un organisme mammifère qui présente des régulations physiologiques avec une communication inter-organes à long terme, répondant à une modification nutritionnelle durant la période fœtale et pas trop éloigner de l’Humain. La souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. Justification des stades de développement : Au stade jeune adulte (8 semaines), une fois que la croissance terminée et que la maturité des divers organes est atteinte, la sensibilité des souris à développer une résistance à l’insuline et une obésité en réponse à un régime riche en graisse et en sucre sera étudiée.
Biomarqueurs et mécanismes de la fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature chirurgicale de l'uretère qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque une fibrose du rein, puis une prise de sang et une injection de colorant sous contention. Le projet cherche des marqueurs précoces de cette fibrose dans l'urine et le plasma, prélevés après la mort avec les reins. Le porteur justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est l'espèce "la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse" dans les conditions de la procédure.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.
Procédures
- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.
Impact sur les animaux
Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement.
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Etude des mécanismes de la résolution d’inflammation associée à l’athérosclérose- Avenant
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une piqûre au bout de la queue leur injecte la protéine qui déclenche l'athérosclérose, puis elles reçoivent un millilitre de produit dans l'abdomen trois fois par semaine pendant cinq à dix semaines, sous un régime riche en graisse, et passent cinq échocardiographies sous anesthésie. Le projet vise à savoir si l'absence d'un récepteur d'acide gras oméga-3 aggrave l'inflammation et les plaques d'athérome, et à tester une molécule censée résoudre cette inflammation. Le porteur note que l'athérosclérose ainsi provoquée ne tue pas les souris dans le temps imparti, et conclut que le remplacement "n'est pas possible".
Objectifs
L’athérosclérose (accumulation des plaques riches en lipides au niveau des artères) et l’inflammation chronique accélérent le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité en France. Des dérivés d'acides gras polyinsaturés oméga-3 considérés comme bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, peuvent réduire l’inflammation. Ces dérivés agissent via des récepteurs spécialisés encore très peu étudiés dans le domaine de la résolution de l’inflammation et des conséquences sur les maladies cardiovasculaires. Notre hypothèse est qu'un dérivé d'acide gras oméga-3 et son récepteur pourraient contribuer à limiter l’inflammation, l’athérosclérose, et le vieillissement cardiovasculaire. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si l’absence du récepteur produit l’effet inverse à savoir prolonge et/ou accentue ces phénomènes et d’identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’athérosclérose et d’inflammation vasculaires induit par la surexpression d’une protéine couplé à un régime riche en graisse, chez la souris portant ou non de le récepteur étudié. Une exploration des fonctions cardiovasculaires sera faite dans les deux groupes et nous testerons aussi l’effet d’une molécule thérapeutique qui aide à la résolution d’inflammation.
Bénéfices attendus
La réussite de cette étude permettra 1) de déterminer si le récepteur d'un acide gras oméga-3 est important pour limiter le processus d'inflammation et le développement de l’athérosclérose et 2) d’évaluer l’efficacité d’un thérapeutique potentiel à restaurer la résolution de l’inflammation et réduire la sévérité de l’athérosclérose.
Procédures
-piqûre de 5 secondes au bout de la queue pour injecter la protéine induisant l’athérosclérose. - injection intra-péritonéale de 10 secondes d’un millilitre d’un thérapeutique ou d’un contrôle 3 fois par semaines pendant minimum 5 et maximum 10 semaines. - 5 échocardiographies (imagerie non-invasive de 30 min maximum) sous anesthésie (1 échographie toutes les 5 semaines).
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisse conduira à une prise de poids importante, mais pas à un niveau comparable à l’obésité. Il y aura peut-être une diminution de la prise alimentaire due au régime gras. Les administrations intrapéritonéales sur l’animal vigile induiront une douleur comme une piqûre d’aiguille. Une petite inflammation au site d’injection peut survenir. Les anesthésies pratiquées pour réaliser les échocardiographie peuvent induire une hypothermie, une modification de la fréquence cardiaque. L’athérosclérose qui se développera dans le temps donné ne conduit pas à une mortalité chez la souris.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude puisque les artères seront prélevées pour étudier les plaques d'athérome. L'animal est inconscient lors de sa mise à mort.
Remplacement
L'étude des mécanismes d'action d'un dérivé d'acide gras polyinsaturé oméga-3 et son récepteur se font déjà au laboratoire sur les modèles cellulaires. Nous avons également mis au point l'étude de la contraction et dilatation des artères isolées par une méthode ex-vivo. Cependant, pour étudier l'effet de l’induction d’athérosclérose sur le système cardiovasculaire, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Nous faisons toutes les mesures (echocardiographie , prise de poids ) sur un même animal. Des calculs statistiques permettent de prédire le nombre minimal d'animaux à utiliser pour avoir des résultats significatifs et limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées de 2 à 5 par cages ventilées. L’enrichissement du milieu se fera avec du papier plissé, des tunnels et bâtonnets de bois. Les souris sont surveillées très régulièrement (3 fois par semaines : prise de poids, observation de la zones de piqûre). Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pendant l’exploration fonctionnelle cardiovasculaire et du gel ophtalmique est déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure (régime, echocardiographie sous anesthésie, injections intrapéritonéales répétées, anti-douleur local).
Choix des espèces
Les souris qui surexpriment la protéine et sous régime hyperlipidique développent l’athérosclérose. Des souris adultes mâles et femelles de 10 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Suivi IRM de modèles de souris atteintes de la maladie des petits vaisseaux sanguins cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Une pompe diffusant un agent hypertenseur est implantée sous la peau et des constricteurs sont posés pour réduire le flux sanguin cérébral. 45 souris vont être utilisées de cette façon dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des examens IRM sous anesthésie répétés toutes les deux semaines pendant trois mois, puis une ponction de liquide céphalorachidien avant leur mise à mort. Parmi les complications possibles, le porteur énumère des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus, un globe oculaire percé, une hémorragie non contrôlée et des lésions du cerveau ou de la moelle épinière. Il rappelle par ailleurs que l'IRM "ne génère aucun signe de souffrance visible".
Objectifs
La maladie des petits vaisseaux (SVD en anglais) est particulièrement fréquente chez les personnes âgées, même sans accident vasculaire cérébral ni démence, et peut représenter les stades précoces de ces affections. L’objectif du projet est de mettre au point un protocole d’imagerie non-invasive, par Imagerie par Résonance Magnétique, similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales induites par la SVD chez le petit animal, et ainsi pouvoir évaluer l’efficacité de traitements.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. L’utilisation de modèles murins pathologiques permet de valider le protocole IRM similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales. Ce projet permettra d’évaluer la sensibilité de détection de ces anomalies pour tester ensuite des traitements innovants contre les troubles neurologiques associés à la SVD.
Procédures
Pour créer une hypertension, une pompe diffusant un agent hypertenseur sera posé en sous-cutané des souris (durée 10 min). Pour créer une hypoperfusion cérébrale, les animaux auront une implan-tation de constricteurs sous anesthésie générale gazeuse (durée 10 min). Trois semaines après, tous les animaux subiront des examens IRM sous anesthésie générale. Ces examens seront répétés 2 semaines plus tard, jusqu’à 3 mois d’observation. Après le dernier examen IRM, un traceur fluorescent sera injecté dans la circulation sanguine (geste réalisé en 1 min), puis du liquide céphalo rachidien sera prélevé (5 minutes) avant leur euthanasie. Toutes les actes seront effectués sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L'hypertension artérielle générée et la baisse de flux sanguin (hypoperfusion ) sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigues seront des accidents cérébro-vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent un déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les injections peuvent entrainer les événements suivants: globe oculaire percé, hémorragie importante non contrôlée. Le prélèvement du liquide céphalorachidien peut provoquer des saignements au niveau du site de ponction, en particulier si les vaisseaux sanguins sont endommagés pendant l'intervention. Un prélèvement excessif peut perturber l'équilibre du liquide, pouvant affecter la fonction cérébrale ou induire une pression intracrânienne anormale. Le prélèvement peut potentiellement provoquer des dommages aux structures cérébrales sous-jacentes ou à la moelle épinière, pouvant entraîner des troubles neurologiques transitoires.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, pour vérifier que les anomalies détectées par IRM sont réellement présentes sur les coupes histologiques.
Remplacement
Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neurologiques du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que des signes cliniques associés à ces maladies. Il est nécessaire de visualiser par imagerie non-invasive les altérations du cerveau de l’animal vivant, afin de limiter les analyses post-mortem qui nécessitent l’emploi de nombreux animaux. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles pathologioques.
Réduction
Il y aura 2 groupes de souris : hypertendues ou avec une perfusion sanguine cérébrale diminuée. Nous pensons que les anomalies crérébrales induites vont être détectées facilement sur les images IRM. L’avantage de l’IRM est son caractère non-invasif, permettant de suivre les animaux de façon longitudinale. Ainsi, chaque animal est son propre contrôle, ce qui réduit le nombre d’animaux à utiliser. Ceci devrait permettre d’avoir un nombre suffisant par groupe pour déterminer la sensibilité de détection des différentes anomalies par IRM et obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe dans des cages avec libre accès à l’eau et à la nourriture. De l’enrichissement sera placé dans la cage : maisonnette, coton, batônnets de bois à ronger. Tous les actes sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. L’administration de l’hypertenseur sera réalisée grâce à l’implantation de pompes en sous-cutané, permettant de limiter au maximum les injections répétées. L'utilisation d'anesthésies gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux, et un ballonnet pour le contrôle de la respiration lors des examens IRM permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. De plus, une réhydratation des animaux après les sessions d’imagerie sera réalisée. Du gel ophtalmologique sera appliqué à chaque anesthésie pour compenser la sécheresse oculaire. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible et est classée légère en degré de gravité. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps et de signes cliniques généraux.
Choix des espèces
La souris est est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les modèles d'hypertension artérielle et de modification de flux sanguin cérébral ont été développés et validés pour cet espèce. Nous utiliserons des souris adultes (10 semaines minimum) c'est à dire, lorsque la maturation du réseau vasculaire cérébral est atteinte.
Étude du potentiel thérapeutique de l’inhibition pharmacologique d’Orai1 dans le développement de l’insuffisance ventriculaire droite induite par banding de l’artère pulmonaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumis à un rétrécissement chirurgical de l'artère pulmonaire destiné à provoquer une insuffisance cardiaque droite, 400 rats vont tous être tués pour analyse du cœur et des poumons. 320 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 80 autres un niveau modéré. Chaque animal passe une échocardiographie sous anesthésie par semaine pendant quatre ou huit semaines, puis un prélèvement sanguin à la queue et un cathétérisme cardiaque. Le porteur annonce que le projet permettra "à court terme" de lancer des essais cliniques chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire, quand l'essoufflement et la fatigue infligés aux rats sont donnés pour la conséquence attendue du protocole.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque droite est la principale cause décès de patients atteints d'hypertension pulmonaire (représentant 1 % de la population globale). Cependant, aucun traitement n'existe pour réduire l'apparition de l'insuffisance cardiaque droite. Nos résultats suggèrent qu'une protéine d'un canal calcique serait impliquée dans le développement de la dysfonction ventriculaire droite aussi bien chez l'homme que chez le rat. L'objectif de cette étude est donc de déterminer si l’inhibition de ce canal calcique par un inhibiteur spécifique, in vivo chez le rat, est bénéfique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettrait de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet représenterait une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades. A court, terme ce projet permettra l'initiation d'essais cliniques ciblant Orai1 chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire.
Procédures
Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole. Ces échocardiographies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse(20 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvements sanguins à la veine caudale ainsi qu'un cathétérisme cardiaque sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).
Impact sur les animaux
Comme décris précédemment, la chirurgie de Banding de l'artère pulmonaire conduira au développement d'une insuffisance cardiaque droite. Les effets secondaires importants et les atteintes cardiaques (essoufflement à l'effort, fatigue) conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque est réalisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 400 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de déterminer le plus précisément possible le nombre nécessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique adéquat.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. Les animaux seront au nombre de 2 par cages. De l'enrichissement, comme du coton, un morceau de bois ou encore un tunel en carton seront ajoutés dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites, notamment la perte de poids. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. À la fin des expérimentations, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de l'hypertension pulmonaire. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler sur ce modèle. De plus, dans un but d'étude préclinique il est crucial de pouvoir tester nos molécules pharmacologiques sur l'animal entier afin de déterminer la présence d'effets secondaires non désirés. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (8 semaines, 200g à 250g). En effet, à ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme, l'hypertension pulmonaire se développe chez les jeunes adultes.
La thérapie génique pour la dystrophie musculaire congénitale dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance cardiaque vers neuf mois chez les hétérozygotes et tue les homozygotes vers dix-neuf jours, les souris de cette lignée servent à tester trois approches de thérapie génique. 309 animaux au maximum sont concernés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 237 d'entre eux et modéré pour 72. Les souriceaux sont anesthésiés sur la glace à deux jours de vie, ce qui peut abaisser leur température corporelle, puis reçoivent une injection intraveineuse unique, la veine n'étant plus visible dès le troisième jour. Les souris reproductrices sont tuées à six mois avant l'apparition des symptômes cardiaques, et les souriceaux injectés à seize jours pour prélever leur cœur, leur foie et trois muscles des pattes.
Objectifs
Le projet a pour but d'évaluer et de comparer l'efficacité de 3 approches de thérapie génique dans des souris porteuses d'une mutation conduisant à une cardiomyopathie dilatée chez les souris hétérozygotes, et à une dystrophie congénitale associée à des problèmes cardiaques chez les souris homozygotes. Chez l'homme, les mutations de ce gène entrainent différentes pathologies, les plus nombreuses conduisant à une cardiomyopathie dilatée, associée ou non à une dystrophie musculaire (prévalence estimée à environ 9 individus sur 100.000). Le présent projet vient compléter un autre projet dans lequel les mêmes approches de thérapie génique ont été évaluées dans ces mêmes souris pour leur capacité à prolonger la survie des animaux et à corriger le phénotype. Suite aux résultats obtenus, de nouveaux prélèvements sont nécessaires afin de réaliser des études moléculaires et permettre de finaliser notre étude.
Bénéfices attendus
Les résultats de cet essai de thérapie génique permettront de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques dans cette maladie grave. D'autre part, si les résultats sont positifs, ils permettront d'avancer vers le développement d'une thérapie pour les patients pour lequels aucun traitement n'existe à l'heure actuelle.
Procédures
Des accouplements seront réalisés afin de générer les lots expérimentaux. En tout 8 accouplements en trio (1 mâle hétérozygote et 2 femelles hétérozygotes) seront réalisés. Afin de limiter l'appartition du phénotype cardiaque, les accouplements seront réalisés avec des animaux qui ont entre 2 et 6 mois (4 portées maximum par femelle). L'anesthésie des souriceaux (réalisée 1 fois à 2 jours de vie, avec une durée de 1 min) est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. Suite à l'anesthésie, les souriceaux seront soumis à une injection intraveineuse (1 seule injection par souris, durée inférieiur à 1 min) est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.
Impact sur les animaux
A l'état hétérozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée autour de 9 mois, entrainant une insuffisance cardiaque et à leur mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Les souris homozygotes développent un retard de croissance généralisé, associée à une atteinte sévère des muscles squelettiques et cardiaque, conduisant à la mort prématurée des souriceaux autour de 19 jours. L'anesthésie des souriceaux sur la glace est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. L'injection est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris hétérozygotes en croisement seront euthanasiées à 6 mois, avant l'appartition des symptômes cardiaques afin d'éviter la survenue de souffrances non nécessaires. Les souriceaux injectés seront euthanasiées à l'âge de 16 jours afin de récupérer les différents organes nécessaire à tester l'efficacité des différentes approches thérapeutiques (coeur, foie, tibialis anterior, gastrocnemius, quadriceps).
Remplacement
Les outils thérapeutiques ont déjà été validés par des approches in vitro. Le recours à un organisme vivant est nécessaire pour étudier la bonne diffusion des virus thérapeutiques dans l'organisme entier et vérifier si l'expression des molécules thérapeutiques atteint le niveau nécessaire dans les différents organes d'intérêt afin d'empêcher le développement de la maladie. D'autre part, le recours à un organisme vivant est également nécessaire afin d'identifier d'éventuels effets indésirables tels qu'une réponse immunitaire.
Réduction
Ce projet nécessite l'utilisation de 309 animaux maximum. 1) Une partie du projet inclus des croisements afin de générer les souris nouveau-nées modèles de la maladie génétique chez lesquelles les approches thérapeutiques seront évaluées. Les accouplements contrôlés comprendront 21 souris. A l'issue de ces croisements, nous obtenons environ un quart de souris modèles de la maladie génétique. 2) Les 4 groupes de souris seront générés afin d'obtenir au moins 15 souris modèle de la maladie par groupe. Il nous faudra donc environ 60 souris par groupe, soit 240 souriceaux en tout. Etant donné que le nombre de souriceaux par portée et le nombre de souriceaux modèle de la maladie dans ces portées peuvent légèrement dévier des chiffres théroriques (obtenus pour un grand nombre de portée), nous demandons une autorisation pour un plus grand nombre d'animaux que le chiffre théorique, soit 288 souriceaux (au lieu de 240). Les croisements seront arrêtés dès que le nombre de 15 souris modèles de la maladie par groupe aura été atteint.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements de nidification et un bâton à ronger. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La procédure est réalisée précocement afin d'éviter le développement du phénotype dommageable des animaux, de plus les injections sont réalisées sous anesthésie. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, croquette humidifiée et hydrogel etc.).
Choix des espèces
D'un point de vue génétique, les souris sont extrêmement proches de l'homme, permettant de reproduire les mutations du gène dans ce modèle animal, conduisant à des sympômes très similaires. Le modèle murin utilisé ici, généré par recombinaison homologue, a prouvé sa validité pour étudier le développement de la pathologie par de multiples publications. Les injections sont réalisées à 2 jours de vie car la veine n'est plus visible à 3 jours de vie (pigmentation) et l'injection n'est pas possible à un stade adulte due à la sévérité du phénotype conduisant au décès des souris homozygotes à 19 jours de vie. La procédure sera arrêtée à 16 jours de vie. Les souris hétérozygotes utilisées pour les accouplements permettent de générer les souris homozygotes nécessaire à ce projet. Ces accouplements sont limités dans le temps (entre 2 et 6 mois de vie), afin de limiter l'apparition du phénotype dommageable de ces souris (développement d'une insuffisance cardiaque autour de l'âge de 9 mois).