Système cardiaque
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Evaluation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin de pathologie rythmique cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées portent une mutation du canal sodique cardiaque qui provoque des arythmies ventriculaires et, après quatre semaines, une forte mortalité. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des expérimentations sur cœur isolé. Chacune passe un électrocardiogramme de cinq minutes sous anesthésie à trois semaines, avec pose d'une bague à l'oreille et prélèvement du bout de la queue pour le génotypage. Le porteur présente la mise à mort à quatre semaines comme une mesure éthique, puisque les souris mutées peuvent au-delà mourir subitement d'arythmie ou développer une insuffisance cardiaque, atteintes qu'il déclare par ailleurs dans des procédures de gravité légère à modérée.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations du gène codant le canal sodique cardiaque. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG), marqueur d'une anomalie de l'activité électrique cardiaque, est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative, chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de 8 molécules sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients (souris SQTL). Ces molécules ont été sélectionnées in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal sodique cardiaque, en inhibant le courant sodique anormal induit par la mutation, et des canaux sodiques neuronaux, faiblement exprimés dans les cardiomyocytes mais contribuant au déclenchement des arythmies. En parallèle, les effets indésirables cardiaques potentiels des 8 molécules, en particulier sur la conduction électrique, seront déterminés sur des coeurs isolés de souris contrôles provenant des mêmes portées.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier un nouveau traitement de prévention des arythmies associées au SQTL de type 3.
Procédures
Au moment du sevrage, à l'âge de 3 semaines, un électrocardiogramme sera enregistré sous anesthésie générale pendant 5 minutes. A la fin de l'enregistrement, toujours sous anesthésie, l'identification des animaux sera réalisée par bagage d'une oreille et le bout de la queue des souris sera prélevé pour réaliser leur génotypage. Ces deux gestes durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
La mutation du canal sodique conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris SQTL qui conduisent, après l'âge de 4 semaines, à une forte mortalité. Les souris SQTL qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) deviennent adultes mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant la protéine déclenchant l'expression de la mutation sur une partie des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Les autres effets indésirables attendus sont le stress induit par la contention et l'anesthésie des souris par isoflurane pour l'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage, puis pour la mise à mort des animaux, ainsi que la douleur associée à la biopsie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour les expérimentations ex vivo.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle ex vivo sur coeur isolé perfusé. Seule cette exploration peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant l'activité électrique cardiaque et en prévenant les arythmies, qui ne peuvent être obtenues sur un modèle cellulaire. Les peptides qui seront testés au cours de ce projet ont été sélectionnés pour leurs effets à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 14 souris STQL par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable, en particulier parce que toutes les souris ne présentent pas d'arythmie spontanée. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 3-4 souris SQTL par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 12 animaux. Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Un maximum de 10 souris contrôles par molécule nous semble suffisant pour tester les effets cardiaques indésirables potentiels, peu probables selon nos études in vitro, des molécules.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage seront réalisés sous anesthésie. La mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, après 4 semaines à une forte mortalité. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant un gène permettant l'expression de la mutation chez environ 25% des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Des points limites ont cependant été définis dans le cas, peu probable, d'une apparition précoce d'insuffisance cardiaque chez les souris SQTL, ainsi que pour les souris contrôles.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent tôt, avant l'âge adulte, ce qui est observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, les souris mutées peuvent mourir subitement par arythmie cardiaque ou développer une insuffisance cardiaque.
Etude de l’origine des malformations cardiaques induites par la perte d’expression du gène Zic3 au cours du développement cardiaque précoce.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées pour le prélèvement de leurs organes, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les atteintes viennent de la lignée elle-même : presque tous les mâles reproducteurs présentent des déformations de la queue, environ 44 % une asymétrie des organes et environ 50 % des malformations cardiaques, que le porteur qualifie de sans impact sur leur physiologie et leur comportement. Aucun acte n'est pratiqué sur l'animal vivant, les embryons et les fœtus étant analysés à des stades successifs pour situer l'origine de ces malformations. Le porteur indique bâtir son projet autour de gastruloïdes cultivés in vitro, et conclut malgré tout que le recours au modèle vivant lui est "indispensable" pour caractériser les défauts anatomiques.
Objectifs
Les anomalies de notre gène d'intérêt sont associées à des anomalies du développement embryonnaire avec une asymétrie des organes. Les souris déficientes pour ce gène présentent des défauts similaires à ceux des patients et dans certains cas des défauts cardiaques particuliers. Le but du projet est de comprendre le role de ce gène au cours du développement cardiaque et particulièrement l’impact de sa perte dans l’apparition des défauts cardiaques. Le premier objectif est d’analyser l’anatomie cardiaque des embryons de souris déficientes dans ce gène afin de caractériser précisément le phénotype clinique. Le second objectif est d’identifier le stade et l’origine de ces malformations au cours du développement cardiaque précoce en analysant (moléculairement, cellulairement et anatomiquement) les embryons de façon temporelle en complément des études qui seront effectuées sur un modèle in vitro.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’améliorer nos connaissances sur l’origine physiopathologique des malformations cardiaques liées à la perte de fonction du gène afin de mieux appréhender l’importance de ce gène au cours du développement cardiaque, notamment lors du déploiement des différentes cellules progénitrices cardiaques. A plus long terme, les résultats issus du projet permettront d’améliorer nos connaisances, le diagnostique et la prise en charge des patients atteints de défauts cardiaques.
Procédures
Aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux en dehors de prélèvements d'organes en post mortem.
Impact sur les animaux
Chez les mâles reproducteurs, certains individus présentant des déformations de la queue (presque 100%), une asymétrie des organes (~44%), des malformations cardiaques (~50%) ainsi que variablement des malformations du cerveau sans impact sur la physiologie et le comportement des animaux. La sévérité et l’impact de ces défauts peuvent être variables. Chez les fœtus, nous nous attendons à des phénotypes proches de ceux rencontrés chez les mâles reproducteurs.
Devenir
A l'issue du projet, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Le point central du projet consiste à utiliser le modèle in vitro appelé « gastruloïde » qui mime les premières étapes du développement embryonnaire, afin de répondre au maximum aux questions biologiques à l’échelle moléculaire et cellulaire pouvant être adressées par un modèle simplifié en culture. Les gastruloïdes sont issus de l’aggrégat de cellules souches murines qui seront dérivées de souris controles ou mutantes. Malheureusement, les défauts physiopathologiques et anatomiques ne peuvent pas être modélisés avec les modèles in vitro. D’autant plus que la morphogénèse du cœur est étroitement liée à celles des autres organes et dépend de facteurs physiologiques. Ainsi, l’utilisation de modèle in vivo nous est indispensable pour la caractérisation des défauts et la validation des données qui seront obtenues in vitro.
Réduction
Pour le maintien de la colonie, un nombre minimal de souris mâles sera généré. Dans un but de réduction, ces mêmes mâles serviront à la deuxième procédure afin de générer des embryons qui seront étudiés par une approche séquentielle aux différents stades du développement embryonnaires, avant la naissance.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La structure en charge du bien-être animal (SBEA)sera sollicitée pour des conseils pour limiter ces situations d’hébergement isolé. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). Les individus mâles que nous allons générer pour le projet peuvent présenter des phénotypes connus et plus ou moins dommageables. Nous allons donc procéder à des observations quotidiennes très méticuleuses des animaux dès leur naissance, en utilisant une méthode de scoring pour évaluer les aspects physiques et comportementaux, de façon à identifier le plus tôt possible l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. Seuls les mâles présentant le moins d’effets indésirables et sans aucuns signes de détresse et de souffrance seront maintenus pour le projet.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques Afin de réaliser une analyse précise des défauts nous utiliserons les stades embryonnaires qui correspondent aux stades précoces du développement cardiaque lorsque les premiers progéniteurs sont déployés et lors de la mise en place des axes de symétrie embryonnaire. Les stades plus tardifs seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la progression des malformations cardiaque lors de l’embryogénèse des 4 chambres et des gros vaisseaux. Enfin le stade fœtal sera utilisé afin de caractériser les défauts morphologiques lorsque le cœur est complétement formé. Les mâles reproducteurs seront utilisés comme reproducteurs entre 8 semaines et 8 mois.
Evaluation par imageries non invasives d’un traitement innovant d’une cardiomyopathie de Takotsubo chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Jusqu'à seize anesthésies générales d'une heure trente par animal sur six mois, et jusqu'à huit injections d'agent de contraste : 576 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever des tissus. Le syndrome de Takotsubo leur est provoqué par une injection d'hormone de stress dans le péritoine, qui déclenche selon le porteur un stress important pendant environ une heure et peut évoluer vers une insuffisance cardiaque, une perte de poids et un affaiblissement. L'imagerie doit servir à évaluer un médicament candidat contre cette atteinte cardiaque, faute de traitement validé chez les patients. Le rat Wistar a été retenu parce que les appareils d'imagerie sont adaptés à sa taille et pour comparer les résultats aux études de scintigraphie déjà publiées.
Objectifs
Le syndrome de Takotsubo est une pathologie cardiaque causée par un stress physique ou émotionnel, qui déforme temporairement le ventricule gauche. Bien que les symptômes ressemblent à ceux des infarctus du myocarde, il n'y a pas d'obstruction des artères du coeur, et les signes cliniques sont réversibles. À long terme, cependant, ce syndrome évolue vers de l'insuffisance cardiaque et présente un taux de mortalité comparable à celui d'un infarctus. Les mécanismes et traitements de cette pathologie sont encore mal connus, et il n'existe pas de consensus sur le traitement thérapeutique. Cette étude vise à évaluer à l'aide de techniques d'imagerie médicale non invasives les effets d'un nouveau médicament pour traiter le Takotsubo dans un modèle de rat.
Bénéfices attendus
À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement spécifique validé pour le syndrome de Takotsubo, mis à part les soins de support, malgré une mortalité non négligeable. La recherche de nouvelles options thérapeutiques pourrait combler cette lacune, offrir des solutions plus ciblées, et améliorer la qualité de vie des patients souffrant des suites de ce syndrome.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale sous anesthésie (
Impact sur les animaux
Tous les rats de cette étude seront soumis à une injection intrapéritonéale d'hormone de stress pour induire le modèle ce qui provoque une douleur faible de courte durée au point d'injection. L'hormone de stress provoque un stress important durant environ une heure. Par la suite, à plus long terme, une insuffisance cardiaque peut être induite et entrainer des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Au cours des injections intraveineuses et intrapéritonéales, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation (nuisance courte et de faible intensité) et une douleur faible et de courte durée lors de l’injection. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie, qui nécessitent manipulation et anesthésie.
Devenir
A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour évaluer des thérapies pour le syndrome de Takotsubo. Cette pathologie cardiaque liée au stress est un processus physiologique global faisant interagir différents organes et différents types cellulaires au sein des organes. De plus, les méthodes de diagnostique et suivi thérapeutique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants pour aboutir à des conclusions statistiquement significatives. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec nos expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance accrue post induction du Takotsubo. La mise en place de points limites adaptés permettra d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques dans la mesure du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. Les méthodes d'imagerie que nous utiliserons dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à deux par cage, dans la limite réglementaire) avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le rat qui est le modèle le plus utilisé pour les études de cardiomyopathies. Les intruments d’imagerie sont adaptées pour la taille des rats. De plus le modèle rat est le modèle le plus répandu pour étudier ce syndrome d’après la littérature. Le rat Wistar a été choisi pour la comparaison avec les études en scintigraphie de la littérature. Adultes de 12 semaines car c’est l’âge adulte auquel les animaux auront atteint la maturité, nous permettant ainsi de s’affranchir des problèmes liés à l’âge. De plus, cet âge est retrouvé dans la littérature, ce qui nous permettra de confronter nos résultats.
Maintien de l’élevage de souris obèses – souche Ob/Ob
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Nées de croisements entre porteurs hétérozygotes organisés pour entretenir la lignée, 1 000 souris ob/ob vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La mutation qu'elles portent dérègle le contrôle de l'appétit et provoque dès quatre semaines une obésité sévère accompagnée de troubles métaboliques, phénotype que le porteur qualifie lui-même de dommageable. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet, dont l'objet se limite à fournir aux autres protocoles un stock d'animaux obèses disponible en continu. L'obésité y est décrite comme n'induisant ni traumatisme ni douleur, quelques lignes avant l'énoncé des aménagements qu'impose la mobilité réduite de ces souris, deux par cage et tétines de biberon rallongées.
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique causée par un excès de graisse dans le corps, entraînant des problèmes de santé, notamment au niveau du métabolisme, du système vasculaire et du cœur, et réduisant l’espérance de vie. Son développement est influencé par plusieurs facteurs, tels que l’alimentation, la génétique et l’environnement. Dans ce contexte, la souris Ob/Ob, porteuse d’une mutation génétique affectant un gène important pour le contrôle de l'appétit, est un modèle essentiel pour étudier les maladies liées à l’obésité. Cette mutation provoque une obésité sévère et des troubles métaboliques similaires à ceux observés chez l'Homme. Maintenir cette lignée de souris permet de mieux comprendre les causes de l’obésité et ses complications, et d’évaluer de nouvelles solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le maintien de cette lignée à mutation spontanée permet de fournir un modèle stable et reproductible pour de nombreux projets de recherche, facilitant ainsi les études comparatives et assurant une disponibilité continue d’animaux adaptés aux besoins expérimentaux.
Procédures
Les souris ob/ob présentent une obésité due à une mutation génétique spontanée qui altère le fonctionnement d'un récepteur à une hormone contrôlant l'appétit, cette mutation induit un phénotype dommageable visible dès l'âge de 4 semaines.
Impact sur les animaux
L’obésité, qu’elle soit induite par un régime riche en graisses ou par une mutation spontanée (Ob) n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. Avec l’installation de l’obésité, les souris pourraient présenter une mobilité réduite.
Devenir
Les animaux seront garder en vie et utilisés dans des projets nécessitant des souris Ob/Ob.
Remplacement
En l’absence de modèles alternatifs permettant de développer une obésité à l’échelle de l’organisme, nous utilisons des modèles murins bien caractérisés comme les souris Ob/Ob. Ces modèles ont l’avantage de reproduire des altérations biologiques similaires à celles observées chez l’Homme..
Réduction
Ce projet vise à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant un maintien efficace de la lignée. Les souris Ob/Ob sont obtenues par croisement d’hétérozygotes (Ob/+ × Ob/+), et toutes les souris issues de ces accouplements seront utilisées pour éviter toute mise à mort inutile. Les souris hétérozygotes excédentaires seront intégrées au programme d’élevage pour assurer la pérennité de la colonie ou utilisées comme contrôles. De plus, une planification rigoureuse des accouplements sera mise en place pour ajuster la production aux besoins réels des projets, évitant ainsi un surnombre d’animaux. L’utilisation de méthodes standardisées pour le suivi et la gestion des lignées contribuera à optimiser les effectifs et à limiter les manipulations superflues.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à leur espèce, avec un enrichissement du milieu comprenant des cabanes, du papier, des tubes en carton et des morceaux de bois. Un suivi quotidien des animaux sera assuré, incluant l’évaluation de critères comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé), ainsi qu’un suivi du poids de façon hebdomadaire. Ces observations permettront d’identifier d’éventuels signes de détresse et de déterminer les points limites de l’expérience pouvant conduire à la mise à mort de l’animal, conformément à la grille d’évaluation des points limites. Les souris obèses, qu’elles soient mâles ou femelles, seront hébergées par deux par cage pour tenir compte de leur poids et de la taille de leur environnement. Leur mobilité réduite nécessitera une attention particulière lors des manipulations et des transferts, des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Elle est utilisée depuis longtemps pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnue pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, elle offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix privilégié pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d’obtenir des données fiables. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines pour les protocoles expérimentaux, un âge couramment choisi dans la plupart des études car il correspond à un stade de développement suffisamment mature. Toutefois, cette fenêtre peut varier en fonction des objectifs spécifiques de chaque projet, certaines études nécessitant des animaux plus jeunes ou plus âgés. En ce qui concerne la reproduction, les femelles seront mises à la reproduction entre 8 et 10 semaines, un stade où elles sont physiquement prêtes et capables de donner des descendants viables.
Exploration de l’atteinte rénale après pré-conditionnement ischémique supra-coeliaque et utilisation d’une anti-héparanase chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués à l'issue, sous une nouvelle anesthésie destinée au prélèvement des organes et du sang, 80 rats Wistar de huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de l'aorte de 60 à 72 minutes avec arrêt du flux sanguin vers les reins, puis des douleurs abdominales dès le réveil et une mobilité réduite en postopératoire. Le projet sert à caler un modèle d'atteinte rénale et à tester une molécule anti-héparanase, les retombées annoncées pour les personnes opérées d'un anévrisme de l'aorte étant renvoyées à la suite des travaux. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucun modèle non vivant ne reproduit un corps humain en activité et conclut au "besoin" de refaire la chirurgie sur le rat, "un rongeur qui est proche de l'Homme".
Objectifs
Il existe des patients ayant une maladie de l'aorte (la plus grosse artère du corps humain) qui nécessite d'être opérée. Cette maladie s'appelle les anévrismes de l'aorte. Le risque de cette maladie est le décès brutal si elle n'est pas prise en charge. Le traitement chirurgical de ces anévrysmes de l’aorte peut nécessiter un clampage rénal, c'est à dire un arrêt du flux sanguin vers les reins, induisant une souffrrance de ceux-ci. Cette souffrance rénale, le plus souvent temporaire, peut-être amenée à se chronisicer et à évoluer vers une insuffisance rénale chronique (défaut de fonctionnement du rein sur le long terme). Il existe ainsi un risque de dialyse rénale pour cette chirurgie. Quelques études sur l'animal et l'Homme ont pu mettre au point des molécules responsables de cette souffrance rénale. Notre hypothèse est de cibler ces molécules par l'intermédiaire de médicaments et de techniques chirurgicales afin de réduire cette souffrance rénale. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de mettre en place ce modèle afin de réduire cette souffrance pour pouvoir opérer les malades avec le moins de complications et de séquelles rénales possibles.
Bénéfices attendus
Nous comptons évaluer et caractériser les effets protecteurs de notre médicament et de la technique chirurgicale
Procédures
La procédure expérimentale concerne l'ensemble des 80 rats de l'étude. Pour tous les groupes la procédure chirurgicale va durr 60 à 72 minutes. La mise a mort nécessitera une nouvelle induction anesthésique pour le prelevement des organes et du sang, d'une durée de 10 minutes par rat.
Impact sur les animaux
Pour la Classe légère, la nuisance sera la contention de l'animal qui peut le stresser lors de l'injection des anesthésique et analgésique Pour la classe modérée, les douleurs attendues seront d'ordre abdominal dès le réveil pendant la période de reperfusion et en postopératoire, nous nous attendons également à une réduction de la mobilité du rat.
Devenir
Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la récupération des organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles. Cette démarche vise également à prévenir toute éventuelle souffrance.
Remplacement
La chirurgie de l'aorte se fait chez une personne vivante, avec un coeur battant et du sang circulant dans tout le corps. L'agression engendrée par cette chirurgie va être responsable d'une série de réactions qui ne peuvent se mettre en place que sur un être vivant. Actuellement, il n'existe pas encore de modèle non vivant permettant de mettre en place une copie du corps humain en activité, avec les liens étroits entre le flux sanguin et les différents organes. C'est pour cette raison que pour notre étude de modèle de chirurgie nous avons besoin de la reproduire sur un être vivant : le rat. C'est un rongeur qui est proche de l'Homme. Ce modèle de chirurgie chez le rat permet de reproduire ainsi les conditions réelles chez l'Homme de cette même chirurgie aortique. L’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle non vivant reproduisant pleinement une chirurgie aortique.
Réduction
Nous avons opté pour des études sur des espèces animales élevées à des fins scientifiques, caractérisées par une faible variation génétique entre individus. Cette homogénéité réduit la variabilité des réponses biologiques, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux requis a été estimé à partir des études antérieures au sein de notre unité. De plus, nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses lors de la mise à mort. Ce nombre d’animaux garanti un effectif suffisant pour réaliser les analyses . En l’absence de données existantes sur le traitement dans ce modele nous avons estimé qu’il faudrait 20 rats par groupe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément aux normes réglementaires, avec un enrichissement des cages pour favoriser leur bien-être. Un contrôle rigoureux de l’analgésie et de l’anesthésie sera également assuré. Pour limiter l’angoisse des animaux, les interventions auront lieu 1 à 2 semaines après leur arrivée à l’animalerie, leur laissant ainsi le temps de s’adapter et de se reposer après le transport. Les interventions chirurgicales et les prélèvements se dérouleront dans une pièce isolée et calme, avec un seul expérimentateur présent, afin de limiter les sources de bruit et les mouvements perturbateurs. Durant toute l’expérimentation, les signes cliniques suivants seront surveillés : respiration pénible, bruyante ou faible, poils hérissés, dos arrondi, position recroquevillée, prostration, et réduction importante de l’activité motrice. L’apparition de l’un de ces signes cliniques constituera un point d’arrêt anticipé, et l’animal sera immédiatement exclu de l’étude et euthanasié pour éviter toute souffrance supplémentaire en l’absence de moyens de soulagement efficaces et rapides. Une grille d’évaluation du bien-être animal, basée sur la perte de poids, le comportement et l’état général, sera utilisée pour définir des points limites. Des mesures spécifiques seront mises en place pour réduire les nuisances et les effets indésirables. Par ailleurs, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de favoriser leur habituation. Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés à raison de trois individus maximum par cage, avec un enrichissement. Le réveil post-anesthésique se fera dans des cages individuelles pour garantir leur sécurité.
Choix des espèces
Les premiers modèles ont été développés chez le rat, en particulier chez le rat Wistar. Les études antérieures menées au laboratoire sur ce type de chirurgie chez le rat ont permis d’identifier et de valider des marqueurs spécifiques de cette pathologie. Par ailleurs, notre animalerie dispose d’une infrastructure adaptée, garantissant des conditions optimales d’hébergement et de bien-être pour les animaux. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 8 semaines et qui pèseront entre 300 et 400 g.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisé dans l’étude de la mécano-biologie
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Nées dans les lignées génétiquement modifiées de l'établissement, 2 000 souris subissent l'amputation de deux millimètres de leur queue ou de leur oreille, à l'âge de deux à quatre semaines, pour que leur génotype soit identifié. La procédure dure cinq secondes et se fait sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale ajouterait une nuisance non justifiée au regard d'un niveau de souffrance qu'il déclare léger. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet. Leur sort se décide au vu du résultat du génotypage : entrée dans l'expérience d'un autre projet, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement d'organes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles d'animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. La gestion de l'élevage de l'ensemble des lignées génétiquement modifiées de notre établissement utilisateur répond à des programmes établis en amont par les responsables des projets dans lesquels elles sont nécessaires. Les programmes de reproduction (effectifs de reproducteurs, rythme de production) sont adaptés aux besoins des équipes de recherche en prenant en compte les caractéristiques propres à chaque modèle pour l’obtention des cohortes nécessaires (taux de fertilité, tailles des portées, résultats des génotypages). Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés en utilisation continue et ceux nécessaires au maintien des lignées lorsqu’elles sont régulièrement utilisées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des biopsies de tissus selon des méthodes non invasives ou couplées à une méthode d’identification des animaux. L’objectif de ce projet est de présenter les méthodes de biopsie utilisées au sein de notre équipe pour le génotypage des lignées d'animaux génétiquement modifiés à phénotype non dommageable, utilisées à des fins scientifiques dans le cadre de nos projets et thématiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles d'animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour des projets autorisés dans le cadre d’une utilsation continue. De plus le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille constitue une méthode de génotypage de gravité légère, fiable et minimisant les risques de contaminations entre échantillons.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue ou de 2mm de tissu à l’oreille x 5 secondes x 1 par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement de tissus.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de ces uniques procédures. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé dans le cadre d’une utilisation continue b/ Utilisés pour le maintien de la lignée c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
Il n’existe aucune alternative à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser in vitro. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation continue dans d’autres projets.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire, à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement en individu de même génotype). - Développer et favoriser le recours à des méthodes de biopsies non invasives chaque fois que cela est compatible avec les impératifs scientifiques des projets.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiée au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements à l’oreille sont réalisés en routine sur des animaux de 2 à 4 semaines. Le développement de l’oreille n’atteint sa forme définitive qu'a l'age de deux semaine, permettant de réaliser des biposies sans risques hémorragiques. Les prélèvements de l’extrêmité de la queue peuvent être réalisés jusqu'a 4 semaines après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
MeCP2_Cortex_KO
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une prostration, une difficulté respiratoire majeure ou une perte de poids supérieure à 20 % déclenchent la mise à mort par dislocation cervicale. 240 souris mâles privées de la protéine MeCP2 dans le cerveau vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cortex à la naissance puis à deux, quatre, six et huit semaines. Le porteur indique que le déficit neurologique apparaît vers la cinquième semaine, avec ataxie, tremblements, nervosité et respiration difficile, et que la moitié de ces souris meurent d'elles-mêmes à six semaines, 90 % à huit semaines. Le projet vise à valider une hypothèse sur l'organisation de l'ADN dans les neurones, un traitement pour les filles atteintes du syndrome de Rett restant, lui, une perspective.
Objectifs
L'ADN, qui contient l’ensemble des informations nécessaires au fonctionnement de nos cellules, est organisé sous une forme compacte appelée chromatine. Cette structure doit être souple et adaptable pour permettre aux cellules de fonctionner correctement. Lorsque cet équilibre est perturbé, cela peut entraîner des maladies, notamment des maladies dites « épigénétiques », qui affectent l’expression des gènes sans modifier directement l’ADN. Le syndrome de Rett est un exemple de maladie épigénétique rare qui touche presque exclusivement les filles. Il se manifeste par des troubles du développement neurologique entraînant un polyhandicap sévère, incluant une déficience intellectuelle, des troubles du spectre autistique et des complications respiratoires et cardiovasculaires pouvant réduire l’espérance de vie. Cette maladie est liée, dans la majorité des cas, à une mutation du gène MeCP2, situé sur le chromosome X. Les recherches sur le syndrome de Rett reposent en grande partie sur des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’étudier la fonction de MeCP2 dans le cerveau. Il a ainsi été démontré que cette protéine joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. Nos travaux récents suggèrent que le syndrome de Rett pourrait être une maladie de la chromatine : la mutation de MeCP2 empêcherait son rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine des neurones, en perturbant son interaction avec certaines séquences répétées d’ADN. Pour mieux comprendre cette hypothèse, nous étudierons la fonction de MeCP2 dans le développement du cortex chez un modèle murin du syndrome de Rett.
Bénéfices attendus
Ce projet associera différentes approches fonctionnelles à l'échelle du génome novatrices et complémentaires. Il permettra une meilleure compréhension de la fonction neuronale de MeCP2, et clarifia l'étiologie moléculaire du syndrome de Rett. Les données obtenues pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie neuro-développementale sévère et incurable. De plus, nos travaux contribuent à la compréhension du rôle des courtes séquences d'ADN répétées sur l'organisation tridimentionnelle du génome et l’expression des gènes au cours du développement du cerveau, et peuvent avoir un impact plus large, notamment sur l'identification des mécanismes moléculaires impliqués dans les troubles du spectre autistique et dans les maladies neurodégénératives.
Procédures
Nous envisageons d'effectuer nos expériences sur des cortex prélévés sur des souris agées de 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. Mais le déficit neurologique des mâles dépourvus en MeCP2 débute entre 4 et 5 semaines, entrainant une létalité de 50% à 6 semaines et de 90% à 8 semaines. Les souris agées de 6 ou 8 semaines seront donc probablement difficile à obtenir. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal pour ces souris, nous avons choisi une application stricte de point limite dès les premiers signes de souffrance (diminution importante de l’activité motrice ou prostration, difficulté respiratoire majeure ou perte de poids supérieure à 20% au poids attendu). Les souris seront observées quotidiennement, l'une de ces observations suffira à mettre en œuvre le point limite et les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les troubles neurologiques décris chez les souris où MeCP2 a été inactivée spécifiquement dans le cerveau à un stade embryonnaire précoce sont bien décris. Ils apparaisent vers la 5ème semaine et associent de l'ataxie, une hypoactivité, des tremblements, de la nervosité, une respiration diffcile et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem du cortex.
Remplacement
En associant des données biochimiques, structurales obtenues in vitro à des données génomiques obtenues à partir de cellules en culture, nous avons accumulé beaucoup de résultats préliminaires qui suggèrent que MeCP2 puisse agir comme un facteur de transcription pionnier dans les neurones, capable d'envahir la chromatine en se liant aux répétitions CA. Le syndrome de Rett pourrait ainsi être considéré comme une "maladie de la chromatine" provenant de l'incapacité qu’a MeCP2, lorsqu’elle est mutée, à moduler l'organisation de la chromatine. Nous souhaitons dans ce projet valider définitivement notre hypothèse de travail par des expériences effectuées sur l'animal, étape indispensable pour le développement d’approches thérapeutiques.
Réduction
Nous ne travaillerons que sur des souris mâles pour lesquelles l'expression de MeCP2 aura été supprimée dans le cerveau, car les femelles équivalentes ne sont pas viables. L’objectif est ensuite de minimiser le nombre d'animaux utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives des données issues des analyses par séquençage haut-débit et atteindre l'objectif scientifique du projet. Nous estimons que de 3 à 5 réplicats biologiques seront nécessaires par expérience et par âge, soit un total de 240 souris en tenant compte de leur mortalité précoce.
Raffinement
Les mâles KO pour MeCP2 présentent une régression neurologique importante conduisant à une mort prématurée typiquement entre 6 et 8 semaines. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal, nous avons choisi une application stricte de point limite. Les souris seront observées quotidiennement et notées selon une grille de scoring de la douleur appliquée à l’animalerie qui repose sur l'aspect général (poids corporel, apparence physique, signes cliniques mesurables) et le comportement (modifications du comportement non provoqué, et après stimulation) : -Un score de niveau zéro n’entrainera aucune intervention particulière. -Un score de niveau 1 entrainera des soins spécifiques comme l’utilisation d’aliments gélifiés à même la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture des animaux présentant une hypoactivité ou de l’ataxie, l’utilisation de tunnels de transfert pour la manipulation des souris présentant un phénotype de nervosité, l’utilisation d’analgésiques complémentaires, un contrôle biquotidien, une pesée régulière, une consultation éventuelle avec la Structure du Bien-Etre Animal et le vétérinaire. -Un score de niveau 2 sera le point limite et nécessitera une décision de mise à mort par la méthode de dislocation cervicale.
Choix des espèces
La lignée de souris crée est le modèle murin idoine puisqu'il développe des symptômes cliniques similaires au syndrome de Rett, avec un déficit neurologique sévère qui apparait vers la 5ème semaine et une létalité de 50% à 6 semaines. Pour ces raisons, nos expériences seront limitées aux 8 premières semaines de vie mais à différentes étapes du développement du cortex : 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. La multiplication des points de cinétique est essentielle à notre étude puisqu'elle permettra de vérifier si la fonction chromatinienne de MeCP2 lors du développement post-natal, est concommitante à l'apparition des troubles neurologiques dans les neurones en maturation dépourvus de MeCP2.
Création d’un nouveau modèle d’hypertension pulmonaire thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
188 souris vont être utilisées, dont 144 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 44 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. L'artère pulmonaire droite leur est ligaturée, par ouverture du sternum ou par ouverture du thorax entre les côtes, avec un risque d'hémorragie, d'arrêt cardiorespiratoire et de pneumothorax, et une partie d'entre elles se réveille pour vivre quatre semaines avec cette artère fermée. L'objet du projet est de fabriquer chez la souris un modèle de maladie déjà obtenu chez le rat et le cochon, afin de disposer des outils génétiques propres à cette espèce. Le porteur qualifie l'hypertension ainsi provoquée d'asymptomatique et sans effet indésirable, en s'appuyant sur ses résultats chez le rat, et écrit que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) est une maladie cardio-pulmonaire sévère. Elle est caractérisée par une augmentation anormale de la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) au-dessus de 25 mmHg au repos. Cette élévation de la PAP aboutie à une hypertrophie cardiaque droite puis à une insuffisance cardiaque. L’HTP-TEC est due à une obstruction des grosses artères pulmonaires suite à la mauvaise résolution d'un caillot de sang (embolie pulmonaire). L’embolie pulmonaire est une maladie fréquente. En France, au moins 35,000 cas sont traités chaque année. Chez 1 à 3% des survivants, la persistance d’une obstruction artérielle pulmonaire cicatricielle associée à des anomalies des petits vaisseaux pulmonaires peut conduire à une HTP-TEC. La plupart du temps, l'HTP-TEC se soigne bien, avec un acte chirurgical qui vise à retirer le matériel qui obstrue les vaisseaux bouchées (thromboendarectomie). Cependant, dans certain cas, l'augmentation du flux sanguin dans les territoires non obstrués conduit à une altération des petits vaisseaux pulmonaires distaux (inférieurs à 500µm de diamètre) non "débouchables" par la chirurgie. Le modèle le plus pertinent d'HTP-TEC actuel est un modèle d'embolisation pulmonaire par de la colle biologique chez le cochon. Ce modèle de gros animal est difficilement reproductible par des équipes non expertes et ne permet pas de tester à grandes échelles les traitements qui sont excessivement onéreux. Un nouveau modèle chez la souris permettra de mieux comprendre comment se mettent en place les lésions distales d'HTP-TEC et comment soigner cette pathologie. En effet, les patients deviennent symptomatiques (essoufflement à l'effort) et ne sont diagnostiqués que dans les stades terminaux de la maladie. ll n'est donc pas possible de disséquer l'histoire naturelle du développement des lésions pulmonaires chez l'homme. C'est pour cette raison que nous travaillerons avec un modèle animal de cette maladie finalement assez fréquente mais mal comprise et mal traitée en dehors du traitement chirurgical. Développer un modèle d'HTP-TEC chez la souris est donc un enjeu majeur pour augmenter la survie des malades.
Bénéfices attendus
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) représente un défi majeur de santé publique, entraînant un handicap significatif, une insuffisance cardiaque et un risque accru de mortalité en l'absence de traitement. Cette forme grave de maladie vasculaire pulmonaire est souvent méconnue, ce qui entraîne des retards dans le diagnostic et expose les patients à un risque élevé de décès prématuré. À court terme, notre projet vise à établir un modèle expérimental d'HTP-TEC chez une espèce animale pour laquelle une panoplie d'outils génétiques et scientifiques ont déjà été développés et validés. À long terme, l'objectif principal de ce projet est d'améliorer la prise en charge des patients atteints d'HTP-TEC. En développant un modèle animal pertinent de cette maladie, nous espérons mieux comprendre ses mécanismes sous-jacents et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce faisant, nous visons à réduire la morbidité et la mortalité associées à l'HTP-TEC et à améliorer la qualité de vie des patients affectés.
Procédures
Pour une partie des animaux, une hypertension pulmonaire sera induite par ligature de l’artère pulmonaire droite (chirurgie thoracique avec sternotomie, durée de l’acte chirurgical : 40 minutes maximum) sous anesthésie et analgésie. Pour une seconde partie des animaux, une ligature de l’artère pulmonaire droite est réalisée via une thoracotomie (20 minutes), puis les animaux sont réveillés. Ils sont soumis à un examen échocardiographique non invasif 28 jours post-ligature (10-20 minutes sous anesthésie gazeuse) puis sont soumis à une chirurgie terminale via sternotomie sous anesthésie et analgésie (20minutes) sans réveil avec mise à mort subséquente.
Impact sur les animaux
Dans les expériences que nous avons réalisées chez le rat, l’hypertension pulmonaire qui se développe chez nos animaux est cliniquement asymptomatique (hypertension pulmonaire modérée au niveau hémodynamique, sans insuffisance cardiaque), n’entraînant pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (aiguë ou 4 semaines). Les souris sont soumises à une chirurgie (sous anesthésie) qui est un acte douloureux et seront prises en charge par ailleurs. Cette intervention peut engendrer des complications telles qu’hémorragies, arrêt cardiorespiratoire ou pneumothorax. Ces risques restent rares dans notre expérience grâce à l’expertise chirurgicale de l’équipe. L’augmentation du nombre d’animaux demandée dans cet avenant correspond à l’ajout d’un groupe expérimental (ajout de la lignée C57BL/6J), et non à une anticipation de pertes liées à ces complications. Une partie des animaux sera soumise à une échocardiographie sous anesthésie, qui est une procédure non invasive et non douloureuse.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du cœur et des poumons (nécessité de prélever les organes).
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
En fin d’expérimentation, les tissus prélevés (cœur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs de puissance ont permis de déterminer les effectifs minimums nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Le nombre total de souris utilisés sera de [modification du 17/02/2025 : 188] sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. De la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée seront disposés sur la litière de la cage pour permettre un accès facilité à la nourriture et à la boisson.
Choix des espèces
Nous avons développé chez le rat ce modèle qui mime les conditions hémodynamiques et les lésions vasculaires pulmonaires rencontrées dans la pathologie humaine. Pour aller plus loin dans l’étude de la pathologie (mécanistique), les modèles transgéniques constituent un outil puissant, car ils peuvent être utilisés efficacement pour tester des interventions conçues contre des voies et des processus moléculaires particuliers impliqués dans la maladie. Or la majorité de ces outils ne sont disponibles que chez la souris. C’est pourquoi, nous voulons transposer ce nouveau modèle chez cette espèce. Nous utiliserons des souris adultes (8-20 semaines) pour reproduire les caractéristiques démographiques de la pathologie étudiée et faciliter l’approche chirurgicale (en comparaison aux souris juvéniles).
Étude des modifications post-traductionnelles de la tubuline et leur implication dans les pathologies cardiaques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une échocardiographie par mois sous anesthésie gazeuse, pendant douze mois, attend 120 souris génétiquement modifiées, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que l'anesthésie peut faire chuter leur thermorégulation et, plus rarement, provoquer une détresse cardio-respiratoire, et que certaines développeront une maladie cardiaque qui écourtera leur vie. L'objet reste fondamental : comprendre comment les modifications d'une protéine du squelette cellulaire pèsent sur la fonction du cœur. Le remplacement tient en deux phrases, des expériences sur lignées cellulaires étant annoncées "autant que possible", et les points limites évoqués ne sont pas précisés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du cytosquelette cellulaire : d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Cette étude a pour ambition d’analyser les relations entre ces différents aspects et d’établir comment ils coopèrent dans la régulation de fonctions du scytosquelette. Le cytosquelette étant impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies cardiaques. Ce projet a pour but l’évaluation des modifications de la tubuline sur la fonction cardiaque chez des souris genetiquement modifiées dans des gènes codant des proteines importantes pour les modifications post-tranductionnelles de la tubuline.
Bénéfices attendus
Ce projet peut aboutir à la première description du role des modifications de la tubuline dans le developement de pathologies cardiaques. Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de pathologies cardiaques. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette dans le developpment d'insufficnace cardiaque. L’insuffisance cardiaque correspond à un état dans lequel le cœur n’est plus capable d’assurer son rôle de pompe, et donc d’alimenter correctement l’organisme en sang. Le cœur ne peut alors plus répondre aux besoins énergétiques du corps, et lui apporter oxygène et nutriments. Cette pathologie chronique est irréversible. L'insuffisance cardiaque est liée à une perte de contractilité du muscle cardiaque. Dans un premier temps, le rythme du cœur s’accélère pour pallier la perte de contractilité. Ensuite, sa paroi s’épaissit et ses cavités se dilatent : c’est l’hypertrophie cardiaque. Cette dernière induit une fatigue du cœur menant à l’insuffisance cardiaque. La prévalence de l’insuffisance cardiaque est très élevée et elle concernerait 1,5 million de personnes en France.
Procédures
Nous allons procéder aux échocardiographie tous les mois sous anesthésie, sur 12 mois. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris. Les souris seront euthanasiées en fin de protocole par méthode réglementaire en vue des prélèvements tissulaires pour analyse.
Impact sur les animaux
La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie gazeuse. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Certains animaux peuvent développer une pathologie cardiaque qui peut réduire l'espérance de vie des animaux.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin de protocole par méthode réglementaire en vue des prélèvements tissulaires pour analyse.
Remplacement
Le projet a pour but de comprendre la fonction d'enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
120 animaux seront utilisés pour ce projet. Les processus expérimentaux seront conçus par un test de puissance de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs : nous allons analyser 10 mâles et 10 femelles d’au moins deux portées différentes. Les groupes de souris seront analysés avec des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont définis dans l’agrément de l’établissement utilisateur. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier des cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement). Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. Le milieu est enrichi. Enfin, si nécessaire, la nourriture hydratée pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage pour faciliter la prise. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent et des points limites ont été définis. Nous réalisons un examen d’imagerie non invasive effectuée sous anesthésie avec tapis chauffant/gel hydratant oculaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges à partir du sevrage des animaux et jusqu'à 12 mois. En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme et cela peut avoir des consequences sur la structure et la fonction cardiaque.
Effet d’un nouveau médicament de l’hypertension pulmonaire selon la sévérité et le sexe chez le rat
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection unique de monocrotaline provoque une hypertension pulmonaire, un nouveau médicament est administré au quatorzième jour, une échocardiographie sous anesthésie suit aux jours 21 et 28, puis un cathétérisme du cœur droit d'environ trente minutes est pratiqué sans réveil. 426 rats vont être utilisés ainsi, dix d'entre eux dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 416 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que la maladie induite reste cliniquement asymptomatique sur les quatre semaines étudiées et qu'il arrête le modèle avant l'apparition de l'insuffisance cardiaque droite. Tous les rats sont tués en fin d'expérimentation pour l'analyse radiologique et histologique de leurs poumons.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare et grave qui affecte les petits vaisseaux sanguins des poumons. Dans cette maladie, les parois des petites artères pulmonaires s'épaississent et se rétrécissent, ce qui rend la circulation du sang plus difficile. Cette obstruction augmente la pression dans les poumons et force le côté droit du cœur à travailler plus dur pour pomper le sang. Avec le temps, cela peut mener à une insuffisance cardiaque droite et, sans traitement adéquat, au décès. Actuellement, les traitements disponibles pour l'HTAP ne parviennent pas à inverser ces altérations des vaisseaux pulmonaires. Un nouveau médicament, le Sotatercept, a récemment été approuvé et a montré des résultats prometteurs en améliorant l'état de certains patients atteints d'HTAP. Cependant, il ne fonctionne pas aussi bien chez tous les patients, et nous ne comprenons pas encore pourquoi. Ce projet a pour but de mieux comprendre comment le Sotatercept agit et pourquoi son efficacité varie selon les patients. Pour cela, nous allons utiliser un modèle préclinique chez le rat pour reproduire les conditions de l'HTAP humaine. Nous étudierons comment le Sotatercept affecte les vaisseaux pulmonaires en fonction de la gravité de la maladie et du sexe des animaux. Les objectifs spécifiques du projet sont : 1. Observer comment les vaisseaux pulmonaires changent au fil du temps : Nous utiliserons des techniques d'imagerie avancées pour visualiser en trois dimensions les petits vaisseaux sanguins des poumons. Cela nous permettra de suivre l'évolution de leur structure, de mesurer leur taille et de voir si certains vaisseaux disparaissent au cours de la maladie. 2. Évaluer l'efficacité du Sotatercept selon la gravité de la maladie et le sexe : Nous administrerons le Sotatercept à certains rats et comparerons les résultats avec ceux qui ne reçoivent pas le traitement. En mesurant des paramètres comme la pression artérielle dans les poumons et la fonction cardiaque, nous pourrons déterminer si le médicament est plus efficace chez certains animaux en fonction de la gravité de leur maladie ou de leur sexe. 3. Former un ingénieur de recherche en poste au sein de l'équipe à la réalisation du cathétérisme cardiaque droit chez le rat, afin de renforcer les compétences techniques nécessaires au développement d'une thématique axée sur l’HTAP.
Bénéfices attendus
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare et grave qui provoque une augmentation anormale de la pression sanguine dans les vaisseaux des poumons. Cette pression élevée oblige le cœur à pomper plus fort, ce qui peut entraîner une insuffisance cardiaque du côté droit du cœur et, sans traitement efficace, conduire au décès. Malgré les avancées médicales, les traitements actuels ne parviennent pas à inverser les dommages causés aux petits vaisseaux pulmonaires. À court terme, ce projet vise à évaluer précisément l'efficacité d'un nouveau médicament prometteur appelé Sotatercept. Récemment approuvé, le Sotatercept a montré des résultats encourageants chez certains patients atteints d'HTAP. En utilisant un modèle de la maladie chez le rat, nous allons étudier comment ce médicament agit en fonction de la gravité de la maladie et du sexe des animaux. L'objectif est de mieux comprendre pourquoi certains patients répondent mieux au traitement que d'autres. Un autre bénéfice immédiat de ce projet est la formation spécialisée d’un ingénieur de recherche à la technique de cathétérisme cardiaque droit. Cette compétence clé, essentielle pour évaluer les anomalies hémodynamiques dans les modèles d’HTAP, renforcera la capacité de l’équipe à mener des recherches précliniques avancées et contribuera durablement à l’amélioration des compétences techniques disponibles au sein du laboratoire. À moyen terme, ces recherches permettront de combler une lacune importante dans notre compréhension des raisons pour lesquelles la réponse au Sotatercept varie d'une personne à l'autre. En utilisant des techniques d'imagerie avancées pour visualiser en trois dimensions les vaisseaux pulmonaires et en surveillant les changements au fil du temps, nous obtiendrons des données cruciales sur l'impact du médicament. Ces informations pourraient guider les médecins pour adapter le traitement en fonction de la gravité de la maladie et du sexe des patients, rendant ainsi le Sotatercept plus efficace pour chacun. À long terme, ce projet pourrait transformer la façon dont nous traitons l'HTAP. En développant des traitements capables de cibler efficacement les dommages spécifiques aux vaisseaux pulmonaires, nous espérons réduire les complications associées à la maladie, diminuer le risque de décès et améliorer durablement la qualité de vie des patients. Cela pourrait représenter une avancée majeure pour une maladie qui, jusqu'à présent, reste incurable.
Procédures
Pour une partie des animaux, une HTAP sera induite par une injection unique de monocrotaline (durée de l'intervention : 5 minutes), réalisée sous anesthésie et analgésie appropriées. Par la suite, une échocardiographie (environ 15 minutes sous anesthésie gazeuse) sera réalisée pour évaluer de manière non invasive la fonction cardiaque, puis un cathétérisme cardiaque droit impliquant une chirurgie (durée de l'acte : environ 1 heure, sous anesthésie générale) sera effectué, sans réveil, suivi de l’euthanasie de l’animal, nécessaire au prélèvement d'organes. Le cathétérisme cardiaque droit est la procédure standard réalisée chez l'homme pour diagnostiquer l’HTAP. Elle consiste à introduire un petit cathéter dans une veine pour atteindre le cœur droit et mesurer directement les pressions à l'intérieur du cœur et des vaisseaux pulmonaires. La procédure est exactement la même chez le rat, ce qui permet de recueillir des données comparables aux mesures cliniques humaines. Pour une autre partie des animaux, après induction de l'hypertension pulmonaire par injection sous-cutanée unique de monocrotaline (5 minutes), une injection d’un nouveau médicament de l'hypertension pulmonaire sera administrée au jour 14 (5 minutes), sous anesthésie et analgésie. À J21 et J28, une échocardiographie (environ 15 minutes sous anesthésie gazeuse) sera réalisée afin d'évaluer la fonction cardiaque. À J28 l’échocardiographie est suivie d’un cathétérisme cardiaque droit pour mesures hémodynamiques (environ 30 minutes sous anesthésie générale), sans réveil, suivi de l’euthanasie de l’animal, nécessaire au prélèvement d'organes. Comme précédemment, le cathétérisme cardiaque droit permet de mesurer directement les pressions dans le cœur et les poumons, en utilisant la même procédure que celle pratiquée chez l'homme pour diagnostiquer l'HTAP. Pour une autre partie des animaux, les animaux subiront seulement un cathétérisme cardiaque droit impliquant une chirurgie (durée de l'acte : environ 1 heure, sous anesthésie générale) sera effectué, sans réveil, suivi de l’euthanasie de l’animal, nécessaire au prélèvement d'organes.
Impact sur les animaux
L’HTAP qui se développe chez nos animaux est cliniquement asymptomatique sur la période étudiée de 4 semaines, sans insuffisance cardiaque droite ni surmortalité. Dans ce modèle, une insuffisance cardiaque droite commence à apparaître au-delà de 4 semaines, mais nous ne poussons pas le modèle jusqu’à ce point pour éviter les nuisances associées. Une réduction de la capacité à l’effort est possible, mais elle n’est pas observable dans les conditions standard de stabulation en dehors de tests spécifiques d’effort. Ainsi, sur la période étudiée, la pathologie reste silencieuse pour les animaux dans leur environnement normal, sans symptômes cliniques notables. Bien que les examens échographiques soient non invasifs, l’anesthésie générale nécessaire à leur réalisation peut induire un certain stress, notamment au moment de l’induction. Cet impact est toutefois minimisé grâce à un protocole anesthésique soigneusement adapté pour réduire le stress et garantir le confort de l’animal. L’évaluation hémodynamique, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, nécessite un cathétérisme de l’oreillette droite et gauche, du ventricule droit, de l’artère pulmonaire et de la carotide. Bien que cet acte soit invasif, les nuisances sont strictement limitées grâce à une gestion rigoureuse de la douleur et à une euthanasie immédiate après l’intervention. Chaque étape est conduite avec soin afin de réduire autant que possible les impacts sur le bien-être animal tout en respectant les objectifs scientifiques
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (radiologique et histologique) des poumons (nécessité de prélever les organes).
Remplacement
Dans notre projet de recherche, l'utilisation d'animaux est essentielle en raison de la complexité de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Cette maladie affecte plusieurs aspects du corps en même temps : les petits vaisseaux sanguins des poumons, la résistance au flux sanguin dans ces vaisseaux, et le fonctionnement du côté droit du cœur. Ces interactions dynamiques sont très complexes et, pour le moment, nous ne pouvons pas les reproduire fidèlement en laboratoire sur des cellules isolées ou avec des simulations informatiques. Bien que les expériences en laboratoire sur des cellules ou des tissus soient utiles pour étudier des mécanismes spécifiques, elles ne peuvent pas recréer l'ensemble des interactions entre les poumons et le cœur dans un organisme vivant. De même, les modèles informatiques actuels ne sont pas assez avancés pour simuler tous les processus biologiques, mécaniques et inflammatoires qui conduisent à l'HTAP et à ses complications. Il n'existe pas non plus de système artificiel ou de culture cellulaire capable de reproduire des éléments essentiels de notre étude, comme les changements structurels des vaisseaux pulmonaires (par exemple, la diminution du nombre de petits vaisseaux ou l'épaississement des parois), les variations de pression sanguine dans les poumons, ou l'évolution des problèmes cardiaques et pulmonaires au fil du temps en réponse à un traitement. Pour bien comprendre ces phénomènes, il est nécessaire de les étudier dans un organisme entier. En conclusion, l'absence d'alternatives sans animaux adaptées justifie le recours à des modèles animaux dans notre projet. Cependant, nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à l'avenir, nous permettre de remplacer totalement ou partiellement les expérimentations animales dans ce domaine.
Réduction
Lorsque les animaux arrivent à la fin de l'expérimentation, après avoir évalué leur fonction cardiaque et pulmonaire à l'aide de méthodes spécifiques, nous prélevons leurs cœurs et poumons pour des analyses immédiates. Nous conservons également des échantillons supplémentaires de tissus pour des études futures. Cela signifie que chaque animal nous fournit le maximum d'informations possibles, ce qui évite d'en utiliser davantage à l'avenir. Avant de commencer l'étude, nous avons soigneusement calculé le nombre minimum d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats valables. Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour nous assurer que nous n'utilisions pas plus d'animaux que nécessaire, tout en garantissant que les données recueillies seraient suffisamment solides pour tirer des conclusions fiables. De plus, nous réalisons plusieurs types d'analyses sur les mêmes animaux. Par exemple, nous étudions à la fois le fonctionnement de leur cœur et de leurs poumons, puis nous examinons ces organes au microscope pour en comprendre les détails. Cela nous permet de limiter le nombre total d'animaux requis pour l'ensemble de l'étude. Nous estimons avoir besoin de 426 rats pour ce projet. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques valides qui pourraient contribuer à améliorer la compréhension et le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire.
Raffinement
Anesthésie et gestion de la douleur : Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale adaptée à chaque procédure. Cela signifie que les animaux sont profondément endormis et ne ressentent aucune douleur pendant les manipulations. De plus, nous administrons des médicaments contre la douleur pour nous assurer qu'ils ne souffrent pas après les interventions. Ces protocoles sont conçus pour minimiser l'impact sur les animaux et permettre une récupération rapide. Suivi des animaux : Des observations régulières et la mise en place de point limites nous permettent de réagir rapidement en cas de dégradation inattendue du bien-être animal. Confort et accès facilité à la nourriture : Pour aider les animaux en réveil (suite à l’anesthésie), nous mettons de la nourriture et de l'eau sous forme de gel directement sur la litière de leur cage. Cela leur permet de manger et de boire facilement, même s’ils n’ont pas encore récupéré toutes leurs capacités motrices.
Choix des espèces
Pour notre projet de recherche, nous avons choisi d'utiliser des rats pour plusieurs raisons importantes liées à la pertinence scientifique et au respect des principes éthiques. Pourquoi les rats ? Les rats sont largement reconnus comme un modèle pertinent pour étudier les maladies cardiovasculaires, en particulier l’HTAP. Les poumons des rats présentent des similitudes significatives avec ceux des humains, notamment dans la structure des petites artères pulmonaires. De plus, leur circulation sanguine et leur réponse aux médicaments affectant les vaisseaux sanguins sont comparables à celles observées chez les patients humains. Ces similitudes nous permettent de reproduire de manière fiable les changements vasculaires et cardiaques caractéristiques de l'HTAP chez l'homme. Pourquoi des rats adultes de 10 semaines ? Nous utiliserons des rats mâles et femelles âgés de 10 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce. Ce choix est justifié pour deux raisons : 1. Pertinence pour la maladie humaine : L'HTAP affecte principalement les adultes chez l'humain. En utilisant des rats adultes, nous pouvons mieux reproduire les caractéristiques de la maladie telles qu'elles se manifestent chez les patients. Cela assure que nos résultats seront plus pertinents et applicables pour comprendre et traiter l'HTAP chez l'homme. 2. Conformité avec les normes scientifiques : L'utilisation de rats adultes est conforme aux protocoles établis et aux recommandations de la communauté scientifique pour la recherche sur l'HTAP. Cela nous permet de comparer nos résultats avec ceux d'autres études et de contribuer efficacement à l'avancement des connaissances dans ce domaine.
Augmenter la diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Jusqu'à vingt et une injections par animal et une opération de quinze minutes : 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des analyses post-mortem. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique pour faire entrer davantage de médicaments dans les glioblastomes, décrits comme les tumeurs cérébrales les plus agressives. Sur ce que subissent les souris, le porteur s'en tient à des "douleurs légères et de courte durée" liées aux injections et à des "nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales". Ni le mode d'implantation des tumeurs ni la répartition des 880 souris entre les procédures ne sont précisés.
Objectifs
Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus agressives. La faible diffusion des médicaments au travers de la barrière hémato-encéphalique limite fortement leurs efficacités. Ainsi, le développement de stratégies thérapeutiques sur-mesure conçues pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique constitue un besoin clinique majeur. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Une molécule ciblant ces protéines a été développée et induit une ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule peut être utilisée pour augmenter la diffusion et l’efficacité des médicaments contre les tumeurs cérébrales.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales, ainsi que d’augmenter leurs efficacités
Procédures
Maximum de 21 injections (< 1 minute par injection) par souris, avec un intervalle entre deux injections allant de 24h à 72h en fonction des traitements. Maximum de 1 procédure chirurgicale par souris (15minutes).
Impact sur les animaux
Douleurs légères et de courte durées liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro de perméabilité sur cellules endothéliales cérébrales ont été réalisées. Cependant, la complexité de la barrière hémato-encéphalique ne peut pas être entièrement répliquée in vitro. Cette complexité se retrouve conservée entre humains et souris, faisant de la souris un modèle nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour éviter le stress et la douleur, les injections seront réalisées sous anesthésie générale associée en amont à une analgésie. Nous avons mis en place des points limites adaptés à chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière hémato-encéphalique qui ne peut pas être entièrement répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris génétiquement modifiées avec une barrière hémato-encéphalique perméable ou imperméable. Des souris adultes entre 2 et 8 mois seront utilisées pour l’étude des effets de la barrière hémato-encéphalique sur la diffusion et l’efficacité́ des molécules thérapeutiques visant les tumeurs cérébrales.
Interêt de molécules mimétiques de Wnt dans la prise en charge des maladies cardiovasculaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Soumises pendant deux à cinq mois à un régime riche en cholestérol, puis à huit ou vingt injections pratiquées sur animal conscient, 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'elles développent en fin de régime un œdème du visage et des membres, et qu'elles perdent du poids. Leur queue est amputée d'un demi-millimètre pour le génotypage, sur animal vigile jusqu'au dixième jour de vie. L'objet immédiat est de tester des mimétiques d'une protéine régulant le cholestérol, la meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose étant renvoyée au long terme et à des résultats "concluants".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires affectent beaucoup d’organes comme le cœur, le cerveau ou le foie. Une part importante de ces affections est due à l’accumulation de cholestérol dans la paroi des artères ou dans les organes. Ainsi, certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Niemann-Pick sont liées directement ou indirectement à l’accumulation de cholestérol dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol dans la paroi vasculaire peut également être responsable des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et infarctus du myocarde (IF). Comme pour l’IF et les AVC, le cholestérol peut également former des agrégats dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutissent à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification de mimétiques chimiques d’une protéine spécifique qui permettra de réguler l’homéostasie du cholestérol dans les cellules. Nous étudierons comment ces mimétiques de la protéine en question permettent d’éviter l’apparition des complications neurodégénératives de l’accumulation du cholestérol dans les vaisseaux sanguins cérébraux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des atteintes cardiovasculaires liées aux dépôts de cholestérol dans la paroi des vaisseaux et des dépôts de cholestérol au niveau des cellules du système nerveuses central et de déterminer si l’injection d'un mimétique d'une protéine spécifique est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cardiaques et cognitives. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 ou 5 mois. Certains animaux (au maximum 760) seront soumis à 8 injections , soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 2 mois de régime) ou 20 injections, soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 5 mois de régime). Les animaux seront vigiles et le temps de la contention à la fin de l'injection sera d'environ 1 minute par animal. Les animaux subiront une biopsie de queue pour génotypage sous anesthésie (environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris lors des expérimentations sous régime pro-athérogène avec ou sans Intrapéritonéal, sont le développement d'oedème facial et des membres en toute fin de la période de régime pro athérogène. Un stress engendré par les injections lors des différents traitements et l'anesthésie finale en IP. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids. Le génotype de ces souris est vérifié par PCR sur un prélèvement d’environ 0.5 mm de l’extrémité de la queue lors du processus d’identification par tatouage, ce qui est une source de stress, de nuisance et de douleur transitoire légère. Ce prélèvement est fait sur animal vigile jusqu'au 10ème jour après la naissance et sur animaux anesthésié du 10ème au 21ème jour après la naissance.
Devenir
Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traités par les mimétiques seront mis à mort pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
L'accumulation de cholestérol de l'alimentation dans la paroi des artères aboutit à une maladie appelée athérosclérose qui peut entraîner des infarctus, des accidents vasculaires cérébraux et également une démence vasculaire et des maladies neurodégénératives. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser in vitro ou in silico les processus liés à l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux, ni au niveau des cellules du système nerveux central. Etant donné qu'une partie des apports en cholestérol est alimentaire et que nous mettons en place un régime spécifique qui mime ces apports, nous ne pouvons pas utiliser un modèle cellulaire pour cette étude, mais un modèle animal qui reproduit toutes les conditions physiopathologiques des effets d'un tel régime. L'efficacité et la toxicité de ces molécules ont été testées sur un modèle de cellules avant l'utilisation sur la souris.
Réduction
Si nous arrivons à mettre rapidement en évidence un effet positif d'un des mimétique sur l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux ou dans les cellules du système nerveux central, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (760 animaux sur 5 ans pour la procédure ). Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. La taille des groupes a été déterminée mathématiquement et est au minimum de 15 animaux en tenant compte de la mortalité due à la longueur de l'expérimentation pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que possible la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol que nous leur donnerons : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime. Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude. Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. Le stress engendré par les différentes pratiques expérimentales sera limité au maximum. Les animaux seront entre 3 et 5 par cagée, leur environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid (changement toutes les semaines). Des tunnels de change sont également ajoutés dans les cages pour diminuer le stress engendré par la préhension lors du change des cages et des buchettes de bois sont ajoutées pour que les animaux puissent user leurs dents.
Choix des espèces
La souris peut être génétiquement modifiée et permet ainsi d'étudier l'implication de gènes spécifiques dans la survenue des pathologies humaines. Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet une accumulation intracellulaire de cholestérol accélérée lorsqu'elles sont soumises à un régime riche en cholestérol, ce qui est difficile avec une autre espèce de rongeur. Pour ce projet, nous utilisons des souris de 3 mois qui ont atteint l'âge adulte. Après la période de régime riche en cholestérol, leur âge correspondra à l'âge d'apparition de la patholgie chez l'homme. De plus, chez la souris, la physiopathologie de la démence vasculaire est proche de celle que nous retrouvons chez l'homme.