Système cardiaque

Anesthésiées, incisées au coin de la troisième côte, puis atteintes par une seringue enfoncée jusqu'au retour de sang pour un prélèvement dans le cœur, 112 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une injection dans l'abdomen, l'autre une injection derrière l'œil sous anesthésie, pour recevoir des vésicules issues du sang de personnes atteintes d'un purpura thrombotique thrombocytopénique. Le porteur résume les perturbations anticipées à la douleur d'une injection intrapéritonéale et à la gêne de la contention, et écrit par ailleurs que les animaux ne subiront que très peu de contraintes. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient coupés et colorés.

Objectifs

Si nous comparons notre sang à une rivière qui coule dans notre corps et pour que cette rivière coule bien, il faut que les cellules du sang circulent librement. Mais chez certaines personnes atteintes d'une maladie rare appelée purpura thrombotique thrombocytopénique, c'est comme si des petits caillots se formaient et bouchaient les ruisseaux de cette rivière, ruisseaux qui représentent les petits vaisseaux des malades. Récemment, les chercheurs ont découvert que dans le sang de ces personnes malades, il y a des petites bulles appelées vésicules qui contiennent une substance qui provoque de l'inflammation et ils veulent savoir si ces petites bulles mettent du feu aux environs. Ces bulles sont un peu comme des petites usines à inflammation qui aggravent la situation. Les chercheurs veulent comprendre dans ce projet ce qui se passe exactement quand ces petites bulles inflammatoires arrivent dans le sang des souris. Ils veulent savoir si ces bulles vont provoquer la maladie ou l’aggraver et si elles jouent un rôle important dans la formation des caillots et dans le feu mis dans les environs. Ils vont aussi tester un médicament qui existe sur le marché et qui est déjà utilisé dans d’autres maladies. En comprenant mieux ce mécanisme, les chercheurs espèrent trouver de nouveaux traitements pour aider les personnes atteintes de cette maladie.

Bénéfices attendus

Si nous constatons que l'effet délétère de nos petites bulles est supprimé par l'utilisation de notre médicament, alors nous pourrons envisager d'utiliser ce médicament dans les services médicaux qui accueillent des patients atteints de la pathologie qui nous intéresse. Nous savons en plus, que l'utilisation de ce médicament est possible, étant donné qu'il est déjà utilisé pour d'autres pathologies.

Procédures

Les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Pour la moitié des animaux, ils seront soumis à de la contention et à des injections intrapéritonéales, c'est à dire dans le ventre des souris, pouvant leur occasionner un stress (une injection) et une douleur minime. Cela concerne donc 56 animaux sur une durée de 2 à 5 minutes maximum une fois. Pour une autre partie des animaux (56 autres), l'anesthésie se déroule de la même manière et des injections rétro-orbitaires sous anesthésie sont réalisées. A la fin du protocole, les animaux sont à nouveau anesthésiés, l'anesthésie vérifiée en pinçant la queue de l'animal et un prélèvement intracardiaque est réalisé afin de récupérer le sang des souris. Pour cela, une incision est réalisée au coin de la troisième côte et une seringue est enfoncée jusqu'à retour de sang. Ces gestes durent 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection intrapéritonéale et de la gêne par la contention.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, quelle qu'elle soit, afin de récupérer les organes des animaux et réalisés de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes.

Remplacement

La réalisation de ce projet est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Le calcul d’effectif est déterminé avant l'étude afin d'être sûrs que nous n'utiliserons pas un trop grand nombre d'animaux mais seulement le nombre nécessaire à démontrer scientifiquement un intérêt à utiliser notre médicament dans notre modèle de maladie. Nous nous appuyons sur des logiciels spécifiques qui nous permettent de calculer ce nombre d'animaux et sur des critères de jugement qui sont bien mesurables et bien quantifiables chez la souris.

Raffinement

Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésique. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles toutes les heures et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonter. Les salles sont spécialement concues dans une animalerie agrée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. D'autre part, le choix de la souris est associé aussi à un coût relativement faible, puisque comparé à d'autres modèles animaux tels que les primates, le coût des souris est moindre. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.

Vingt et un jours enfermées dans un caisson où l'oxygène est abaissé à 9 %, ou recevant de l'élastase déposée dans les narines sous anesthésie, 288 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang, des poumons, du cœur, du foie, du rein et de la rate. Elles sont génétiquement modifiées pour surexprimer une protéine qui empêche la formation des vaisseaux pulmonaires, afin d'observer l'apparition d'une hypertension artérielle et d'un emphysème. Le porteur indique que les manipulations ont lieu en journée, pendant la phase de sommeil des souris, ce qui ajoute un stress, et affirme dans le même passage que l'hypoxie chronique n'apporte aucune douleur et ne provoque qu'une légère fatigue. Sur la réduction, il annonce des groupes de 8 souris sans exposer le calcul qui mène aux 288 animaux.

Objectifs

Avec l’âge et dans certaines maladies pulmonaires comme l’hypertension et l’emphysème, le réseau vasculaire décline et la structure des tissus se dégrade, ce qui affecte les poumons et provoque des difficultés respiratoires. L’un des mécanismes liés au déclin du réseau vasculaire implique la défaillance d’un facteur essentiel à la formation de nouveaux vaisseaux. L'action de ce facteur serait pertubée par une protéine dont l’expression augmente avec l’âge chez la souris, mais n’a pas encore été étudiée dans le poumon. Notre objectif est d'étudier l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire. Pour cela, nous souhaitons utiliser des souris génétiquement modifiées surexprimant la protéine empêchant la formation des vaisseaux pulmonaires. Nous nous attendons à observer chez ces souris transgéniques l'apparition de maladies pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire dans deux maladies pulmonaires liées à l’âge (hypertension artérielle et emphysème pulmonaires).

Procédures

Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) : un dépôt de gouttes contenant le traitement au niveau des narines de l'animal effectué sous anesthésie générale, lors d’une seule procédure rapide de 5 minutes. A la fin de la procédure d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, inhalation intranasale d’élastase, Flexivent) peuvent générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit également un stress.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

En parallèle des études menées sur la souris, une étude est portée sur des cellules primaires humaines pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. Différents types cellulaires sont isolés. La culture cellulaire permet de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l'élimination de la vascularisation au niveau pulmonaire, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de certaines maladies.

Réduction

Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance. 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris sous hypoxie. Si un animal présente un de ces points limites, il recevra une anesthésie et une analgésie adaptée à la mise à mort.

Choix des espèces

Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées.

Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.

Objectifs

Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.

Bénéfices attendus

Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.

Procédures

Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (

Impact sur les animaux

Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.

Remplacement

Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.

Raffinement

Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.

Anesthésiées pour une échocardiographie de vingt minutes puis pour une imagerie des vaisseaux lymphatiques d'une heure trente, 3 684 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une biopsie d'oreille au sevrage, cinq administrations orales, une injection et des prélèvements de sang, avant la mise à mort de tous les animaux pour analyse des tissus. Le projet cherche à préciser le rôle des vaisseaux lymphatiques dans l'athérosclérose, les nouvelles stratégies thérapeutiques annoncées étant renvoyées au long terme. Les effets déclarés se limitent à des douleurs légères et à un stress de courte durée, sans un mot sur ce que représente pour ces souris le développement de l'athérosclérose elle-même.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont une cause de morbidité et de mortalité importante dans le monde. En particulier, l’athérosclérose est connue pour ses conséquences : principalement l'infarctus du myocarde, mais aussi les accidents vasculaires cérébraux et l’anévrisme aortique. Certains lipides jouent un rôle bénéfique dans l’athérosclérose, tandis que les vaisseaux lymphatiques aident à limiter la progression de la maladie en facilitant le transport du cholestérol vers le foie. L’objectif de ce projet est de mieux caractériser le rôle des vaisseaux lymphatiques dans des modèles expérimentaux d’athérosclérose chez la souris. Cette étude permettra de développer, à terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de prévenir la progression de l’athérosclérose chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre l’impact potentiel de certains lipide sur les vaisseaux lymphatiques dans la physiopathologie de l’athérosclérose. Cette étude estimera le potentiel bénéfice thérapeutique d’un médicament ciblant les vaisseaux lymphatiques afin de prévenir la progression de l’athérosclérose.

Procédures

Le prélèvement pour identification de la modification génétique sera fait au moment du sevrage de l’animal, elle pourra occasionner une douleur légère et ne prendra que quelques secondes. Le prélèvement de sang (1 à 2 prélèvements/souris) sera fait sur animal anesthésié. Le prélèvement prend moins de 30 secondes par animal. Les administrations par voie orale (5/souris) seront faites sur animaux vigiles et prennent moins de 15 secondes par animal. Les injections seront faites sur animaux vigiles (1 injection/souris). Une injection prend moins de 10 secondes. L’échocardiographie (2/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra environ de 20 minutes par animal. L'imagerie des vaisseaux et des ganglions lymphatiques (1/souris) sera faite sur animal anesthésié et prendra 1 heure et 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Le prélèvement pour identification peut occasionner une douleur légère et un stress de courte durée. Les injections peuvent causer un stress et une douleur légère de courte durée. Les administrations orales peuvent causer une douleur légère et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyses des tissus.

Remplacement

Les modèles de souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'athérosclérose. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment par l'utilisation d'analgésique lors de certaines étapes ainsi que l'utilisation d’anesthésie adaptée durant les procédures. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles d’athérosclérose en culture cellulaire permettant de reproduire la physiopathologie de la maladie. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre la souris et l’humain, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation des résultats. Ces animaux permettront d’analyser finement le rôle spécifique de certains lipides. Seules des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées pour ces études pour rester cohérents avec les conditions cliniques, l’athérosclérose étant une maladie touchant les adultes chez l’humain.

Gavées chaque jour pendant 75 jours, soumises à quatorze prélèvements de fèces de vingt minutes chacun, puis à un test de tolérance au glucose de trois heures, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses et en sucres qui leur est imposé doit provoquer l'obésité, avec une mobilité réduite et un risque de dermatites et d'ulcérations cutanées. Le porteur signale aussi un risque de lésion de l'œsophage lié au gavage quotidien, et annonce deux tests d'évaluation de l'anxiété de vingt minutes sans préciser lesquels. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever l'intestin, le foie et le cerveau, afin de mesurer l'effet de probiotiques et de prébiotiques sur le microbiote intestinal.

Objectifs

L'épidémie d'obésité qui sévit à travers le monde (15,7 % des Français sont considérés obèses) est liée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Au cours des dernières décennies, la recherche s’est tournée vers l’analyse du microbiote intestinal et de nombreuses publications ont démontré un rôle important de la dysbiose microbienne dans le développement des maladies métaboliques et inflammatoires. 38 000 milliards de bactéries vivent dans le microbiote et interagissent avec l'hôte, ce qui équivaut à plus de 100 fois le nombre de cellules de l'organisme humain. D'après l'ISAPP, l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics : " Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte". "Les prébiotiques sont des substrats qui sont utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte, conférant un bénéfice pour la santé." Les prébiotiques et les probiotiques jouent des rôles complémentaires importants pour la santé intestinale. Il a été prouvé par plusieurs études que les probiotiques et les prébiotiques ont un rôle essentiel dans la gestion de l'obésité. Les probiotiques et les prébiotiques ont amélioré les niveaux de leptine et d'enzymes hépatiques liés à l'obésité. Les probiotiques et prébiotiques agissent en supprimant l'inflammation, en renforçant la barrière intestinale, en régulant l'activité des enzymes intestinales et la fonction neuroendocrine, affectant ainsi le stockage et la dépense énergétique. L'impact des modifications au niveau du microbiote peut agir directement sur l'axe intestin-cerveau. L'objectif de notre projet est de mettre en lumière l'importance de nouveaux probiotiques et des prébiotiques en tant que stratégie complémentaire pour traiter l'obésité, en agissant sur le microbiote intestinal, l'homéostasie intestinale ainsi que l'axe intestin-cerveau.

Bénéfices attendus

Pour évaluer l'efficacité des probiotiques ou des prébiotiques contre l'obésité en analysant les modulations du microbiote intestinal, il est impératif d'utiliser un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro ne peut remplacer la richesse du microbiote intestinal. A travers ce modèle, on peut tirer plusieurs bénéfices tels que : 1-Trouver des prébiotiques et probiotiques capables de réduire l'obésité chez la souris. 2-Observer une diminution des biomarqueurs liés à l'obésité. 3-Mettre en évidence des changements bénéfiques dans la composition du microbiote intestinal, avec une augmentation de l'abondance relative des bactéries bénéfiques. 4- Etudier l'impact des traitements sur l'axe intestin-cerveau. Nous espérons ainsi démontrer l'efficacité des prébiotiques et ainsi que des probiotiques pour la perte de poids et la normalisation de certains paramètres métaboliques tout en décryptant les mécanismes potentiels par lesquels les probiotiques et prébiotiques peuvent influencer la composition corporelle et le métabolisme.

Procédures

Gavages quotidien pendant 75 jours, qui dure moins de 30 seconde par souris. Prises de feces 14 fois pendant le protocole qui dure 20 min par prise. Test de tolérance au glucose, réalisé une seule fois et qui dure 3h avec une seule injection d'insuline. Test de tolérance à réalisé une seule fois pendant le protocole, avec une seule injection d'insuline. Deux tests d'évalution de l'anxiété chaque test dure 20 minutes par souris.

Impact sur les animaux

1 Le stress causé par le gavage quotidien, ainsi que le risque d'endommager l'œsophage. 2 Lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline , les injections peuvent entraîner de la douleur et de l'inconfort. Il est possible que ces procédures provoquent de l'irritation péritonéale. 3 L'obésité est le résultat d'une prise de poids excessive causée par un régime riche en graisses et en sucres. Cela va provoquer : • Une diminution de la mobilité due à un excès de poids. L'excès de sébum accroît le risque de lésions cutanées telles que les dermatites et les ulcérations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser les différentes analyses sur les organes tels que l'intestin, foie et cerveaux.

Remplacement

On a effectué une phase in vitro. L'impact des prébiotiques ainsi que de nouvelles souches potentiellement probiotiques a été testé in vitro. En analysant le spectre antimicrobien, la résistance aux enzymes, le pH et l'impact sur des cellules in vitro, on peut évaluer leurs effets anti-inflammatoires. En effectuant cette étape, on peut réduire le nombre de prébiotiques et de probiotiques utilisés pour la partie in vivo. Seuls les candidats ayant un impact sur la flore, une diminution de l'inflammation et une réduction de l'oxydation seront utilisés pour la partie in vivo. D’autre part, l'étude du microbiote intestinal nécessite obligatoirement l'utilisation d'un modèle animal puisqu'il est impossible de reproduire, in vivo , la structure écologique, constituée par des milliards de bactéries représentant 1000 espèces bactériennes majoritairement incultivables.

Réduction

Pour optimiser le nombre d'animaux nécessaires, on utilise les analyses statistiques standards. Il y aura que 8 animaux dans chaque groupe expérimental. Le nombre d’animaux a été optimisé via des méthodes statistiques standards. Dans le contexte de l'expérimentation animale, l'utilisation de tests statistiques appropriés peut contribuer à réduire le nombre d'animaux requis, tout en maintenant la validité scientifique de l'étude.

Raffinement

Amelioration de l'enrichissement par:. 1. Cylindres en plastiques : Ces cylindres offriront aux souris des possibilités supplémentaires d'exploration et de cachette, stimulant ainsi leur comportement naturel. 2. Bâtonnets à ronger : Ces bâtonnets permettront aux souris de satisfaire leur besoin naturel de ronger, contribuant à leur bien-être dentaire et comportemental. 3. Matériel de nidification supplémentaire : Nous fournirons des morceaux de coton supplémentaires pour permettre aux souris de construire des nids plus élaborés. Pour réduire le stress des animaux lors des manipulations, nous mettrons en place un protocole de pré-entraînement qui comprendra les étapes suivantes : 1. Habituation à la manipulation : Nous manipulerons doucement les souris pendant de courtes périodes (30 secondes à 1 minute) pendant la semaine précédant le début des procédures expérimentales. Cela permettra aux animaux de s'habituer au contact humain. 2. Simulation de procédures : Nous simulerons certaines procédures non invasives, comme le pesage ou le placement dans la cage de gavage, sans effectuer réellement ces procédures. Cela aidera les souris à se familiariser avec ces situations. 3. Exposition progressive aux équipements : Nous introduirons progressivement les équipements utilisés lors des procédures (comme les sondes de gavage) dans l'environnement des souris, sans les utiliser, pour réduire leur caractère anxiogène. Pour améliorer les conditions de vie des animaux en captivité et réduire les sources de stress, nous mettrons en place les mesures suivantes : 1. Surveillance documentée pendant les procédures expérimentales : • Mise en place de fiches de suivi individuelles pour chaque animal • Observation et enregistrement des signes spécifiques : • Poids • Présence de lésions cutanées • Comportement (isolement, posture inhabituelle, piloérection) • Consommation d'eau et de nourriture • Qualité du pelage • Mobilité 2. Protocole d'action en cas de détection de signes de détresse ou de malaise : • Consultation immédiate du vétérinaire responsable • Administration d'analgésiques si nécessaire • Ajustement des conditions d'hébergement (ex : isolation temporaire, enrichissement supplémentaire)

Choix des espèces

Les études sont réalisées sur des souris car il s’agit du modèle expérimental chez l’animal le plus utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des effets induits par l'obésité en modèle riche en gras et sucres. La souris est un modèle remarquable pour étudier l'obésité, les animaux qui développent une inflammation et une résistance à l'insuline. En outre, nous avons mis au point tous les outils et techniques nécessaires pour mener à bien cette étude lors de nos travaux antérieurs sur ce modèle Le début des traitements à 6 semaines coincide avec le début de maturation de la flore intestinale.

1 298 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leur moelle osseuse. Trois injections sous-cutanées hebdomadaires d'un médicament dont un effet secondaire connu est la fibrose médullaire, ou une injection unique d'un anticancéreux qui détruit la moelle, servent à abîmer le tissu avant l'expérience proprement dite : une injection rétro-orbitale de colorant ou de cellules à greffer, sous anesthésie maintenue jusqu'à la mise à mort, quarante-cinq minutes plus tard au maximum. La question posée porte sur la perméabilité des vaisseaux de la moelle osseuse, avec l'espoir à terme de mieux réussir les greffes ou de freiner les métastases osseuses. Le porteur écrit que ces expériences sur animal vivant sont "irremplaçables", faute de modèle in vitro reproduisant la complexité de la moelle.

Objectifs

Nous nous intéressons à la barrière sang-moelle osseuse formée par les microvaisseaux de la moelle osseuse, le site unique d’entrée dans la circulation de toutes les cellules sanguines et le site d’entrée des cellules souches lors de greffes de moelle osseuse. Il n'existe à l'heure actuelle aucun médicament pour contrôler la perméabilité et les mécanismes de sa régulation n'ont pas été étudiés. Il est particulièrement important d’entreprendre ces études car différentes pathologies sont susceptibles de modifier la fonction de barrière des vaisseaux sinusoïdes. C'est le cas lors de cancers de la moelle osseuse, et également généralement lors des traitements chimiothérapeutiques des cancers solides. Les objectifs globaux du projet sont de comprendre comment est régulée la perméabilité de cette barrière vis-à-vis des molécules et des cellules. Nous étudierons cet aspect chez la souris saine et après avoir induit des modifications du tissu médullaire à l'aide de traitements actuellement utilisés chez l'homme. La perméabilité aux molécules sera évaluée par la mise en place de modèles d’injection de colorant puis observation après mise à mort des souris et analyse des tissus. La perméabilité aux cellules sera évaluée après greffe de cellules souches (prise de greffe). Nous avons déjà objectivé des acteurs potentiellement importants et pour les étudier nous disposons de souris génétiquement modifiées pour ces protéines et chercherons à évaluer la perméabilité de leurs vaisseaux sinusoïdes, en comparaison avec les souris contrôles appropriées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à terme visent d’une part les patients développant une fibrose de la moelle ou traités par chimiothérapie, avec la possibilité, une fois la connaissance acquise sur les mécanismes, de pouvoir favoriser ou freiner le passage des cellules sanguines à travers la barrière. Un autre bénéfice important vise cette fois l'entrée de cellules dans la moelle. En comprenant le comportement de cette barrière, on pourra envisager de la moduler pour par ex. accélérer/améliorer la prise de greffe de moelle, ou à l’inverse freiner l’entrée de cellules tumorales pour diminuer les métastases osseuses.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de substances induisant des modifications du tissu médullaire. La fibrose est induite par injection sous-cutanée (SC) (durée 3 secondes), 1 fois par semaine, pendant 3 semaines (3 interventions), d'un médicament autorisé pour relever la numération plaquettaire chez des patients thrombopéniques et qui a pour effet secondaire d'entrainer des myélofibroses. La chimiothérapie est mimée par injection unique (une intervention) en intra-péritonéale (IP) (durée 3 secondes) sur souris vigile, d'un médicament utilisé dans le traitement des cancers et ayant pour effet secondaire d'entrainer une myélosuppression transitoire. Puis les souris seront soumises à une intervention unique consistant en une anesthésie générale (injection unique d'anesthésiant, 3 secondes). Ensuite, une seule injection, soit de colorant, soit de cellules à greffer, sera effectuée sur les souris toujours sous anesthésie générale, en RO (durée 3 secondes) et l'anesthésie est prolongée jusqu'à la mise à mort des souris (au maximum 45 minutes après l'injection des colorants ou cellules).

Impact sur les animaux

D’après notre expérience, les traitements sont susceptible d'entrainer une modification modérée et transitoire de la numération sanguine. Les souris sont susceptibles d’être stressées du fait de l’induction de l’anesthésie générale ou de la contention. L'injection IP entrainera une probable douleur passagère au point d’injection.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélever les tissus d'intérêt et pouvoir analyser la capacité de perméabilité vasculaire des vaisseaux, selon les conditions

Remplacement

La moelle est l'un des tissus les plus complexe de l'organisme de par la grande diversité de cellules qui le compose, du réseau microvasculaire extrêmement dense, ainsi que toutes les interrelations biochimiques entre cellules dont nous ne connaissons encore pas grand chose. De ce fait, des expériences sur animal vivant sont irremplaçables car il n'existe pas actuellement de modèles in vitro mimant cette complexité. En outre, nous utilisons des modèles de souris inactivées pour des protéines ou mimant une mutation humaine.

Réduction

Les méthodes pour visualiser la perméabilité vasculaire sont bien décrites dans la littérature et nous nous y réfèrerons concernant les doses à injecter. Néanmoins, pour l'un des colorant qui n’a pas été testé dans la moelle, nous prévoyons des études pilotes pour définir les doses à utiliser et ainsi éviter de multiplier les expériences pour pouvoir réduire au final le nombre d'animaux. Pour toutes nos expériences, nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de votre projet. Lorsque c’est possible, une série de traitement sera utilisée pour différents types d’analyses, afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 3 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. - Par l'habituation à la contention pour les procédure qui sont répétées, et la distribution de nourriture en gel apétente après chaque geste comme récompense.- Par une anesthésie générale de l’animal avant l’injection des colorants ou cellules, et l’application de collyre avant injection rétro-orbitale, lorsque la souris est anesthésiée, et maintien de l’anesthésie après injection durant le temps de circulation du colorant ou des cellules greffées, au maximum 45 min. - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les anesthésies, et l'application de gel hydratant sur les yeux. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes ou reproduisant des mutations humaines. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, ceci afin d'éviter des modifications de la moelle liées au vieillissement qui pourraient augmenter les variabilités. Mâles et femelles seront évalués.