Système cardiaque

Après sept jours d'acclimatation, certaines souris reçoivent la veille de l'expérience une injection intraveineuse de moins de cinq minutes dans un premier établissement. Dans un second établissement du même campus, sous anesthésie profonde, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose ou l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Au total, 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K, vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces expériences durent "respectivement 4 et 7 heures" selon la description des procédures, et "maximum 6 heures" selon celle des effets attendus. Toutes les souris sont tuées par excès d'anesthésique à la fin de l'expérience, sans reprendre conscience, le porteur indiquant qu'après ces actes invasifs elles "ne pourraient pas survivre".

Objectifs

L’inhibition d’un isoforme de la protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité endothéliale et de la barrière vasculaire dans le contexte thrombo-inflammatoire des accidents cardiovasculaires cérébraux. Alors que les souris exprimant une forme inactive ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’oedème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose. L’impact de cette isoforme sera évalué en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.

Procédures

Dans l'etablissement 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots.l'intervention dure moins de 5 minutes. Dans l'etablissment 2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des experimentations qui durent respectivement 4 et 7 heures.

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'intérêt ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les deux types d’expérimentations sont sans réveil. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique.

Devenir

les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la molécule d'intérêt, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de la protéine d'intérêt ne seront pas réalisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus et le dévelopement d'une inflammation dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans ce contexte. Par ailleurs, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt (pas de phénotype dommageable). Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures

Les souris de certains lots reçoivent une injection intraveineuse dans un premier établissement la veille de l'expérience, menée dans un second établissement du même campus. 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K dans tout le corps ou dans les seuls vaisseaux sanguins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Sous anesthésie profonde, pendant une procédure qui peut durer six heures, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose et l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Le porteur qualifie d'"irremplaçable" le recours à la souris, en invoquant des mécanismes "non modélisable par des approches in vitro" et des inhibiteurs qu'il souhaite "valider in vivo".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisée sur deux établissements utilisateurs, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose Pour ce projet nous utiliserons un modèle murin qui exprime une forme inactive de la protéine d’intérêt dans tout l’organisme ou uniquement au niveau des vaisseaux sanguin. L’impact de cette protéine sera également évalué en utilisant des molécules stoppant la fonction de la molécule d'intérêt. Ces molécules seront générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.

Procédures

Dans EU 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots. Dans EU2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et seront euthanasiés à la fin de l'experience .

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'interet ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort.

Devenir

les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'experimentations supplémentaires. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de molécule d'intêret ne seront pas réalisées.Pour éviter toute influence de l’expérimentateur sur les résultats les expériences sont réalisées en aveugle (anonymisation des échantillons et des animaux par un autre expérimentateur).

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.

Choix des espèces

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum dans un portoir ventillé dans des cages de 482 cm2 de surface. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Pour les deux types d’expérimentation (thrombose et inflammation), les souris sont anesthésiées Les expérimentations d’évaluation anti-inflammatoire pouvant se prolonger jusqu’à 6 heures, nous avons fait le choix de traiter les souris avec un analgésique supplémentaire et différents déjà inclus dans le mélange initial d'anesthesie. L'anesthesie est maintenue par un ajout minuté en intraveineux durant toute la procedure.. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures

Cathétérisées au ventricule gauche après une échocardiographie sous anesthésie, 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux interventions durent quinze et trente minutes par animal, sur des souris transgéniques privées de certaines protéines dans un organe précis. Le projet cherche pourquoi la relaxation du cœur se dégrade davantage chez les femmes après la ménopause, en explorant un axe entre le foie et le cœur. Le porteur justifie la mise à mort par le "bien être à long terme de la souris", au motif que la chirurgie qu'il vient de pratiquer risque de provoquer des complications.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont responsables de 4 millions de décès par an en Europe et représentent la principale cause de décès. Cependant, l'incidence des MCV varie considérablement en fonction du sexe, du statut hormonal et du statut métabolique. En effet, avant la ménopause, les femmes semblent être protégées des MCV par rapport aux hommes du même âge, mais leur incidence et leur gravité rejoignent ensuite celles des hommes après la ménopause, suggérant ainsi un rôle protecteur des œstrogènes. Parmi les MCV, l'insuffisance cardiaque (IC) avec fraction d'éjection préservée (ICFEP), caractérisée par une dysfonction diastolique (relaxation cardiaque) et une function systolique normale ( contraction cardiaque) est désormais considérée comme la forme prédominante d’IC (>50%). L’ICFEP présente un dimorphisme cardiaque puisque les femmes âgées sont davantage touchées par rapport aux hommes. Aujourd’hui, le diagnostic précoce de la maladie est difficile et, contrairement à l’ICFER (IC à fraction d’éjection réduite), il n’existe que peu de médicaments efficaces. Ce constat provient du fait que l‘on connait très mal le fonctionnement de la relaxation cardiaque et ses régulateurs, d’où la nécessité urgente d’étudier ces mécanismes. Dans ce contexte, dans l’équipe, nous avons identifié récemment Ephrine-B1 comme un déterminant moléculaire de la diastole. Plus récemment, des données de microscopie électronique du tissu cardiaque ont révélé des régulateurs potentiels d’Ephrine-B1 avec notamment le rôle des œstrogènes et le rôle du métabolisme hépatique . Aussi, l’OBJECTIF DU PROJET consistera maintenant à explorer, dans différents modèles de souris le rôle de ces différentes pistes moléculaires dans la régulation spécifique de la fonction diastolique cardiaque, mais également de la fonction systolique. Les différences mâles/femelles chez ces animaux nous permettront également d’explorer la dimension dimorphique sexuelle de l’ICFEP.

Bénéfices attendus

Les mesures de pressions intra-cavitaires et les échocardiographies permettront de connaitre avec précision les fonctions de relaxation et de contraction du cœur et nous permettront ainsi de définir la présence ou non d’une ICFEP chez nos animaux. Ce projet nous permettra pour la 1ère fois, au travers la régulation de la protéine Ephrine-B1, d’apprécier le rôle des œstrogènes et du métabolisme hépatique dans la relaxation cardiaque et donc de présenter l’axe foie/cœur comme un nouvel axe thérapeutique potentiel dans l’ICFEP. En effet, les dysfonctions métaboliques du foie pourraient donc entrainer des dysfonctions de la relaxation cardiaque. En accord avec cette hypothèse, les maladies métaboliques du foie touchent les mêmes catégories de patients que l’ICFEP avec, de la même façon, une incidence plus élevée chez les femmes. A terme, ce projet devrait permettre de mieux appréhender l’ICFEP touchant différemment les hommes et les femmes et une meilleure prise en charge thérapeutique personnalisée.

Procédures

IL y a 2 intervention : l'échocardiographie, non invasive sous anesthésie légère - Durée: 15 min / souris et l'intervention 2: cathétérisme ventricule gauche cardiaque, procédure chirurgicale Durée : 30 min / souris

Impact sur les animaux

Une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Cependant, le manipulateur peut ajuster en temps réel le % d'anesthésique. De plus, le système du cathéter est doté de sonde permettant de mesurer le rythme cardiaque qui est un excellent indicateur de la qualité de l'anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, l'acte chirurgical présente un risque de développer des complications post opératoires. Pour le bien être à long terme de la souris, il est nécessaire d'euthanasier les animaux à la fin de cette intervention.

Remplacement

Pour diagnostiquer l’ICFEP, il est nécessaire d’évaluer la fonction cardiaque diastolique (mesures des flux et vitesses de relaxation en Echocardiographie Doppler-Intervention 1 + mesures de pression intra-cavitaires par cathétérisme ventricule gauche-Intervention 2) mais aussi la fonction systolique (Echocardiographie-Intervention 1) sur animal entier vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’obtenir l’ensemble de ces données fonctionnelles cardiaques nécessaires pour étudier l’ICFEP, à part ces 2 interventions fonctionnelles sur l’animal.

Réduction

Les souris utilisées pour l'échocardiographie sont les mêmes que celles utilisées pour le cathétérisme ventriculaire. Par ailleurs, des études antérieures de notre équipe mais également d’autres équipes ont démontré que 20 souris par groupe est le minimum pour faire une analyse statistiquement correcte pour les mesures de pressions cardiaques intra-cavitaires en tenant compte de la variabilité de mesure dans les cas pathologique d’ICFEP mais également en tenant compte des animaux pour lesquels il est quelquefois impossible d’introduire le cathéter au niveau ventriculaire.

Raffinement

Les mesures de raffinement mises en place pour minimiser le stress et améliorer la qualité de vie au quotidien de nos animaux est une alimentation et une source d'eau ad libitum. Un enrichissement du mileu est fait grâce à l'utilisation de morceaux de papier et de cartons permettant au souris de fabriquer un nid. De plus, des tunnel en cartons sont également utilisés pour occuper au quotidien nos souris. Concernant l’intervention 1 (imagerie cardiaque), nous utilisons une anesthésie légère par inhalation car c’est une intervention non invasive. Nous utilisons également une table thermorégulée pour le bon maintien de la température de la souris. Le point limite de cette intervention est une mauvaise adaptation de l'animal à l'anesthésie (respiration haletante ou trop diminuée), qui est compensée par une régulation immédiate de la concentration de produit délivré. Pour l’intervention 2 (chirurgie), l’anesthésie se fait comme pour l’intervention 1 (imagerie cardiaque) mais nous utilisons en plus à la fois une analgésie globale et une analgésie locale. Ceci nous permet d’avoir une couverture maximale de la douleur lors de la procédure chirurgicale. Cette intervention 2 est une chirurgie donc elle peut entrainer une diminution de la température corporelle de la souris, et pour palier à cela nous utilisons un tapis chauffant. Pour éviter un dessèchement des yeux, un gel occuloprotecteur est également utilisé. Les points limites concernant cette intervention 2 sont l’hémorragie, une mauvaise réaction aux analgésiques et ou anesthésiques. L'expertise chirurgicale de l'expérimentateur permet de gérer toute complication et le cathéter, capable de détecter la fréquence cardiaque de l’animal, permet de réagir au plus vite si l’un de ces points limites est atteint. Cela est couplé à une surveillance visuelle constante de l’animal et de la zone chirurgicale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce différents modèles transgéniques présentant une délétion (= absence d'expression) de différentes protéines d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier la régulation de la fonction diastolique cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (P60) quand le coeur a fini définitivement sa maturation.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans la veine caudale sous anesthésie, puis subit neuf prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire, avant que son cœur, son foie, ses poumons et sa thyroïde ne soient prélevés pour y doser le produit. Il s'agit de mesurer où se répartit dans le corps une amiodarone encapsulée dans des nanocapsules lipidiques, première étape du développement d'un médicament contre la fibrillation atriale. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ni aucune modélisation ne permettent ces mesures, et juge "indispensable" de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Objectifs

La fibrillation atriale est le plus fréquent des troubles du rythme cardiaque et touche environ 300 000 personnes en France. Le médicament antiarythmique amiodarone est le seul médicament autorisé pour le traitement de cette pathologie en cas d’insuffisance cardiaque malgré ses effets indésirables cardiaques et extracardiaques associés. En effet, l'amiodarone se distribue dans le coeur mais également dans de nombreux organes tels que la thyroïde, le foie, le poumon ou l'oeil. Améliorer les formulations médicamenteuses permettrait donc de mieux traiter les patients. Ce projet vise à utiliser les nanomédecines pour cibler le coeur et diminuer la distribution d'amiodarone aux autres organes afin de limiter ses effets secondaires. L'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille, appelée encapsulation, représente une stratégie prometteuse pour diminuer sa toxicité et améliorer son efficacité. L’objectif de ce projet est d’évaluer la biodistribution , c'est-à-dire la répartition dans les différents organes , la pharmacocinétique, c'est-à-dire le devenir dans l’organisme et la toxicité de l’amiodarone encapsulée par rapport à la molécule seule in vivo chez le rat. Les études de la pharmacocinétique et de la distribution tissulaire des différentes formulations d'amiodarone représentent une étape essentielle dans le développement d’un potentiel nanomédicament. Ce projet permettra d’analyser le devenir des formulations dans l’organisme, d'évaluer une potentielle accumulation dans les organes et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables propres à la nanoparticule. L'objectif est de valider la première étape de développement d'un nouveau médicament qui entraîne moins d'effets secondaires que le médicament actuel.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si l'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille est capable de cibler le coeur. La fibrillation atriale est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce des patients, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer un accident vasculaire cérébral. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée. A ce jour, la fibrillation atriale constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients et rendre l'amiodarone accessible à un plus grand nombre de patients. Le but du présent projet est de démontrer que l'encapsulation d'AMD pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de la fibrillation atriale.

Procédures

Les animaux anesthésiés (isoflurane) seront soumis à une procédure d'injection dans la veine caudale. La durée totale de l’intervention est d'environ 3 min. 9 prélèvements de sang seront réalisés en sous-mandibulaire.

Impact sur les animaux

Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Une douleur modérée au site de ponction veineuse pourrait être induite par les prélèvements sanguins multiples.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale en vue du prélèvement des organes post-mortem (coeur, foie, poumon, tyroïde) pour les dosages tissulaires d'amiodarone.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible des études de biodistribution et pharmacocinétique qui doivent être réalisées in vivo.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 6 rats par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience et a aussi été estimé à l'aide d'un logiciel de biostatistiques. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux la biodistribution tissulaire et la pharmacocinétique de l'amiodarone encapsulée , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée à l’aide de tests non paramétriques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: prélèvements sanguin et tissulaires.

Raffinement

Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation systématique d’anesthésique avant la procédure et d’analgésique si l'animal montre des signes de douleurs. Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la procédure et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix pour les études de biodistribution et de pharmacocinétique. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques pour la biodistribution et la pharmacocinétique. Rats jeunes adultes de 3 mois pour s'affranchir de l'effet du vieilissement.

110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.

Procédures

Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.

Remplacement

Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).

Réduction

Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).

Après cinq jours d'injections quotidiennes, des souris, en grande majorité des femelles, subissent sous anesthésie une chirurgie qui provoque un lymphœdème dans une patte, une injection de cellules tumorales, ou les deux. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un récepteur aux œstrogènes, ERα, dans les vaisseaux lymphatiques. Le porteur décrit le lymphœdème humain comme une "accumulation massive" de liquide et de graisse dans un membre, puis écrit que la chirurgie qui le provoque chez la souris "ne génère pas d'effet indésirable majeur", tout en annonçant "des douleurs modérées" liées aux chirurgies et aux tumeurs. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs tissus, et celles qui passent par une lymphographie, injection fluorescente dans les pattes sous anesthésie, sont tuées sans réveil.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Enfin les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux chirurgies de trente minutes à une semaine d'intervalle créent un anévrisme intracrânien, suivies de quatre mois d'eau salée pour provoquer une hypertension, avec mesures de pression artérielle et injections répétées de tamoxifène pour inactiver un gène dans les cellules endothéliales. Le porteur signale un risque d'infection des sutures, un risque de nécrose intestinale après remise en place de l'intestin, une irritation aux points d'injection et une perte de poids de deux à trois jours après chaque opération. Les 36 000 hémorragies intracrâniennes annuelles citées pour l'Union européenne justifient un projet dont le résultat attendu est d'identifier le rôle d'une seule protéine, le porteur écrivant qu'aucune approche alternative n'apporte le degré d'information voulu.

Objectifs

Les cellules endothéliales qui tapissent les artères sont en contact direct avec le sang qui exerce des forces de frottement sur ces cellules. Une mauvaise perception ou une mauvaise réponse des cellules endothéliales à ces forces contribue à la survenue de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’anévrisme intracrânien (AIC). L’AIC est une anomalie vasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. La complication dévastatrice de l'AIC est sa rupture et surtout l'hémorragie intracrânienne qui en résulte, mortelle dans 30% des cas, ou laissant des séquelles neurologiques majeures. L’anévrisme se forme spécifiquement là où les forces de frottement générées par le flux sont particulièrement perturbées. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces (faibles ou élevées) permettra l’identification de nouvelles cibles pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce à un travail réalisé in vitro, nous avons pu identifier une protéine , ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions des cellules endothéliales. Nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Un premier modèle (haut flux/bas Flux_HF/BF) nous permettra de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans les cellules endothéliales en conditions pathologiques (forces de frottement perturbées). Le second modèle chirurgical d’anévrisme intracrânien nous permettra alors de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans la formation des anévrismes intracrâniens. Les résultats obtenus conjointement pour ces deux modèles permettront à terme de découvrir des cibles pharmacologiques potentielles pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie intracrânienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle de notre protéine dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.

Procédures

Modèle de variations de flux (HF/BF) : Réalisation du modèle sous anesthésie générale à l'âge de 8 semaines. Durée de l'intervention: 30 minutes maximum Modèle d'anévrisme intracrânien réalisé à l'âge de 8 semaines: 2 chirurgies de 30 minutes chacune sont faites à 1 semaine d'intervalle, suivi d’un traitement au sel (0.9%) dans l’eau de boisson pendant 4 mois pour induire une hypertension modérée. La pression artérielle systolique est mesurée avant la chirurgie, puis 1.5 mois après la chirurgie puis avant le sacrifice de l'animal. Chaque série de mesures dure en moyenne 20 minutes. Enfin, pour invalider spécifiquement nos souris dans les cellules endothéliales, des injections sont réalisées soit à la naissance (P1/P2/P3), soit à l'âge adulte (1f/j/5j sur 2 semaines). L'injection ne prend qu'une minute par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Les animaux récupèrent très bien des chirurgies, grâce à la mise en place d’un protocole péri-opératoire adapté. Certains points de vigilance restent à surveiller : -les injections intrapéritonéales répétées chez l'adulte de tamoxifène (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. Pour palier à ce risque, nous réaliserons les injections côté droit de la souris, en évitant de réaliser les injections aux mêmes endroits (carré d’injection). -modèle HF/BF : risque d’infection au niveau des zones de suture, les souris pouvant elle-même essayer de retirer leur fils. Un risque de nécrose des intestins est également possible si ce dernier subit des torsions quand il est remis dans la cavité abdominale. Il est à noter que, dans nos mains, ce risque n’est jamais survenu. -modèle AIC : La présence d’un anévrisme intracrânien est, la plupart du temps, asymptomatique, ce qui en rend difficile sa détection, de surcroît chez la souris. La rupture d’un anévrisme, quant à elle, est imprévisible et brutale, suivie dans 50% des cas par un coma voire une mort subite. Les symptômes de la rupture sont consécutifs à l’hémorragie intracrânienne qu’elle occasionne. Leur intensité dépend de l’ampleur et de la localisation de l’hémorragie. Notre modèle d’AIC n’est pas un modèle de rupture. Par conséquent, nous n’avons jamais constaté de nuisances ou de souffrance en lien avec la survenue d’une hémorragie intracrânienne. Une perte de poids est observée dans les 2 jours suivant les chirurgies mais grâce à l’ajout de nourriture hydratée dans la cage, les souris peuvent se nourrir facilement. Le retour au poids initial se fait en 2 à 3jours. Comme pour le premier modèle, une infection aux zones de suture pourrait survenir. C’est pourquoi, les souris sont surveillées 2 à 3 fois/jour/3jours en post-opératoire.

Devenir

Modèle de variations de flux: Animaux mis à mort après 4 ou 14 jours en fonction des lots pour analyser le remodelage et la réactivité vasculaire des artères. Modèle anévrisme: Animaux mis à mort après 4 mois de traitement pour étudier la structure et la morphologie du réseau artériel cérébral.

Remplacement

Dans ce projet, le recours au modèle animal nous permettra de comprendre le rôle de notre protéine d’intérêt dans un système intégré, le système vasculaire, dépendant de nombreux facteurs extérieurs, non reproductible in vitro. Malheureusement, il n’existe pas d’approche expérimentale alternative apportant le degré et la qualité d’informations scientifiques nécessaires pour répondre à cette question. Toute approche in vitro nous permettant d’orienter notre travail et de réduire le nombre d’expériences menées in vivo sera réalisé en amont du travail sur l’animal (remplacement).

Réduction

Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure, nous nous sommes basés sur notre expérience et sur nos résultats antérieurs, en tenant compte de la variabilité expérimentale. L’effet de la mutation entre les deux groupes sera étudié en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, nous prévoyons d’analyser également l’effet sexe sur les différents paramètres étudiés. Nous réaliserons donc des groupes mixtes. Si nous n’observons pas de différence significative entre les 2 sexes sur les paramètres étudiés, alors les effectifs seront réduits de moitié par rapport à nos prévisions. De même, nous prévoyons de réaliser différentes expérimentations sur des animaux invalidés à la naissance mais aussi à l’âge adulte. Nous commencerons par les groupes invalidés à la naissance. En fonction des résultats obtenus, l’analyse des groupes invalidés à l’âge adulte ne sera peut-être pas nécessaire, réduisant également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront groupées de 3 à 5 par cage avec des petits morceaux de papiers leur permettant de faire un nid. Les animaux seront observés quotidiennement, week-end compris, pour détecter tout signe précoce de douleur, à minima par les animaliers mais également par le personnel en charge de nos animaux. Une surveillance accrue est réalisée en période péri-opératoire, les animaux étant alors observés 2 à 3f/jour. Une grille de score et de points limites sera mise en place et permettra de déterminer le palier de douleur (4 paliers : 0 pour une absence de douleur, et 3 pour une douleur sévère).Toute évolution anormale (perte de poids supérieure à 15%, prostration de l’animal, changement de comportement, isolement, blessure…) pourra ainsi être détectée. Le traitement analgésique sera alors mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Si la douleur ne peut être traitée, l’animal sera alors mis à mort

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire Notre modèle animal est un modèle permettant une délétion, dans le temps et dans l’espace, de notre protéine spécifiquement dans les cellules endothéliales à 2 stades : 1) en post-natal (3 jours après la naissance) ou à l’âge adulte (8 semaines). Toutes nos chirurgies sont ensuite réalisées à l’âge adulte, le réseau vasculaire étant mature. Le modèle d’anévrisme intracrânien est un modèle assez long car il comprend un traitement hypertenseur de 4 mois. Les animaux sont donc utilisés à l’âge adulte, autour de 8 semaines.