Système cardiaque

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour accepter des cellules humaines, elles reçoivent une chimiothérapie puis une greffe de cellules souches sanguines humaines corrigées, avec des prélèvements sanguins mensuels, avant d'être tuées pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. Le porteur indique que la modification génétique affaiblit leur système immunitaire et que la greffe et les prélèvements sont sources de stress. Il affirme que la capacité de greffe et la reconstitution du système sanguin ne peuvent être reproduites en laboratoire, rendant selon lui l'usage d'un modèle murin "requis".

Objectifs

La drépanocytose, maladie génétique du sang la plus répandue, altère la structure des globules rouges, posant un problème de santé mondial avec près de 300 000 nouveaux cas diagnostiqués annuellement. Une mutation génétique affectant la production d'hémoglobine, composant essentiel des globules rouges, provoque leur déformation, entraînant coagulation, obstruction vasculaire et dommages multi-organiques, réduisant sévèrement l'espérance de vie. Les traitements actuels, tels que les transfusions sanguines ou les greffes de cellules souches hématopoïétiques, ne sont accessibles que pour une fraction des patients et présentent des résultats insatisfaisants, se concentrant sur la gestion des symptômes. Ce projet permettrait d'apporter aux patients un traitement curatif afin de supprimer leurs symptômes tout en réduisant le coût de la prise en charge de leur maladie. En effet, grâce à une greffe unique de cellules souches hématopoïétiques modifiées, prélevées directement chez la personne atteinte de la maladie pour éviter les risques de rejet associés aux greffes issues de donneurs, les globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet. Notre laboratoire travaille sur une nouvelle approche thérapeutique axée sur la récupération et la correction des cellules affectées chez les patients souffrant de drépanocytose. Cette méthode vise à corriger de manière permanente le défaut génétique dans les cellules souches sanguines afin d'obtenir une hémoglobine fonctionnelle. Ces dernières se trouvent dans la moelle osseuse et sont capables de générer toutes les cellules nécessaires aux fonctions sanguines. En utilisant une technique basée sur des outils et des ciseaux moléculaires, nous avons réussi à corriger l’erreur génétique responsable de la drépanocytose. Notre stratégie a été développée, en laboratoire, sur des cellules souches hématopoïétiques humaines. Ce projet a donc pour but d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules modifiées après transplantation. Ainsi, une fois les cellules souches hématopoïétiques corrigées par notre traitement, il sera nécessaire de vérifier leur capacité à se greffer dans la moelle osseuse dans un organisme entier et à re-fabriquer ensuite différents types de cellules. Pour ces raisons, le recours à un modèle murin permettant la greffe de cellules souches humaines est désormais nécessaire pour valider ces protocoles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre aux cellules humaines de retrouver une hémoglobine fonctionnelle, tout en s’assurant que notre traitement permet une greffe stable et efficace au cours du temps. Le projet s’effectuant directement sur des cellules humaines (et non murines), l’efficacité de notre traitement reflètera directement l’applicabilité aux patients. Seules la dose de chimiothérapie et le nombre total de cellules à transplanter seront à adapter. Ce projet permettrait d'apporter aux patients drépanocytaires un traitement curatif permettant de supprimer définitivement leurs symptômes tout en réduisant significativement le coût total de la prise en charge de leur maladie tout au long de leur vie. En effet, grâce à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées (permettant d’éviter les rejets observés lors des greffes issues de donneurs), leurs globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet.

Procédures

Les souris recevront une injection de traitement chimiothérapeutique pour les préparer à recevoir des cellules souches sanguines humaines. Après la transplantation de ces cellules, un prélèvement sanguin sera réalisé chaque mois pour surveiller la réussite de la greffe. Enfin, une injection d'un médicament favorisant la production de globules rouges sera administrée.

Impact sur les animaux

Les animaux possèdent une modification génétique, afin de faciliter la transplantation de cellules souches humaines, ce qui affaiblit leur système immunitaire. Pour prévenir les infections, les souris seront logées dans des cages dotées d'une ventilation, contribuant ainsi à réduire la présence de pathogènes dans leur environnement. Pendant ces procédures, deux actes peuvent causer du stress: l'injection de cellules modifiées et le prélèvement de sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. En effet, il sera nécessaire de récolter notamment les informations suivantes dans les organes suivants : - Le sang des souris sera récupéré, afin d’analyser la quantité et la qualité de ces globules rouges humains. - La moelle osseuse et la rate seront récupérées. Ces organes, cruciaux pour le fonctionnement du système sanguin, seront analysés afin d'évaluer la prise de greffe et leur capacité à produire toutes les cellules présentes dans le système sanguin.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer notre stratégie thérapeutique sur un organisme entier car il n’est pas réalisable de reproduire en laboratoire, la complexité d’un organe comme la moelle osseuse, ainsi que la complexité du système sanguin, notamment en termes de prolifération et de différenciation en différents types de cellules sanguines.

Réduction

Dans le but de limiter l'utilisation d'animaux dans ce projet, nous avons évalué diverses stratégies visant à corriger ce défaut génétique sur des cellules souches sanguines humaines en laboratoire. Les quatre meilleures stratégies ont été retenues pour leur efficacité et seront testées sur modèle animal. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, nous avons estimé le nombre minimal d'animaux permettant de tester et de conclure sur l'efficacité de nos stratégies. Cette démarche s'appuie sur les taux de réussite de la prise de greffe issus d'une référence établie. Notre objectif est d'atteindre une prise de greffe similaire à ce modèle mentionné. Afin de viser ces résultats, les calculs statistiques conduisent à estimer que 8 souris par groupe sont nécessaires. Ainsi, notre plan prévoit l'utilisation de 8 souris par groupe, totalisant 400 souris sur 5 ans, tout en visant des résultats scientifiquement robustes.

Raffinement

Les souris, présentant un système immunitaire affaibli, seront placées dans un environnement exempt de pathogènes. Après le traitement chimiothérapeutique et la greffe des cellules, l'état général des souris (apparence, posture, comportement...) ainsi que leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours. Les procédures expérimentales potentiellement inconfortables (greffe des cellules corrigées et prélèvement sanguin pour suivre la prise de greffe) seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress et l'inconfort des animaux. En cas d’inconfort trop important, les procédures seront interrompues.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité de nos stratégies, nous sommes obligés de réaliser des études sur l’animal, car la capacité de greffe ainsi que la reconstitution et la différenciation complète du système sanguin en différentes cellules sanguines ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires en laboratoire. De plus, seule l’utilisation d’animaux peut nous permettre d’observer les éventuels effets secondaires sur le long terme de notre traitement au niveau de l’ensemble des organes. Pour ce faire, l’utilisation d’un modèle murin permettant la greffe de cellules humaines est requis. Les animaux seront greffés à l’âge adulte, de plus de 8 semaines. L'âge des animaux receveurs pour obtenir et conclure sur une efficacité optimale de la greffe des cellules souches sanguines dans la moelle osseuse se situe à 16 semaines.

90 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ablation des ovaires pour reproduire la ménopause et la pose d'une pompe délivrant une substance provoquant une hypertension, avec un suivi par échographie et IRM, pour étudier l'insuffisance cardiaque de la femme âgée. Le porteur estime que moins de 10 % des souris risquent une souffrance en fin de protocole, avec perte de poids rapide ou congestion pulmonaire liée à l'insuffisance cardiaque. Il décrit des études in vitro prévues en parallèle mais affirme le recours aux animaux "nécessaire" faute de modèle in vitro d'insuffisance cardiaque.

Objectifs

L'objectif est d'analyser les mécanismes qui contribuent au dysfonctionnement cardiaque développant chez des femmes âgées. Nous allons évaluer le rôle de l'inflammation et du réseau lymphatique dans le développement de la dysfonction cardiaque dites 'diastolique', caractérisé par une rigidification des parois cardiaques induit par le vieillissement et l'hypertension artérielle et la ménopause, modélisé par ovariectomie chez la souris. Des traitements anti-inflammatoires, ciblant des cytokines proinflammatoires, seront administrés afin d'atténuer la dysfonction cardiaque. Nous espérons identifier des nouveaux traitements permettant de prévenir ou traiter l'insuffisance cardiaque, notamment chez des femmes âgées.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les mécanismes immunitaires altérés dans le vieillissement, accentué par l'hypertension et la ménopause chez la femelle. Dans un deuxième temps, notre étude permettra d'identifier des nouvelles traitement antiinflammatoires (bloquant des cytokines proinflammatoires) qui permet de limiter la dysfonction cardiaque et ainsi améliorer la qualité de vie des patients atteints d'insuffisance cardiaque. Ce protocole expérimental permettra, nous l'espérons, de guider des essais cliniques chez des sous-groupes de patients avec insuffisance cardiaque avec des traitement immunomodulateurs ciblant des cytokines.

Procédures

Des procédures chirurgicales minimalement invasif (ovariectomie, implantation d'un mini pompe osmotique en sous-cutanée). Chaque intervention chirurgicale à une durée de moins de 10 minutes par animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur des animaux anesthésiés. Les interventions d'imagerie (echocardiographie ou IRM) à une durée de 10-20 minutes par animale. Tandis que l'echocardiographie sera réalisé 3 fois pendant l'etude (a 3, 6 et 8 semaines apres l'inclusion), l'IRM n'est realisé qu'un seul fois en fin d'etude.

Impact sur les animaux

Vers la fin du protocole, les animaux seront à risque de souffrance legere-moderé (potentiellement atteints des points limites) associé au développement aigue de l'insuffisance cardiaque, tel que perte de poids rapide ou congestion pulmonaire. Nous estimons que ce risque concerne moins que 10% des animaux, et que notre suivi individuel des animaux nous permettra d’identifier ces individus bien en amont de souffrance importante. Nous espérons que les traitements avec des anticorps ciblant des cytokines proinflammatoires permettra de limiter la dysfonction cardiaque et de prévenir le développement de l'insuffisance cardiaque, améliorant l'état de santé des animaux insuffisant cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin d'étudier les organes (cœur, poumon, rein) par des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas, à ce jour de modèles d'insuffisance cardiaque in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de détecter une différence de 15%. Nos expériences préalables dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie. Un bon suivi post-opératoire permet également de limiter le nombre d'animaux par groupe. Nous nous appuierons sur nos données historiques dès que cela sera possible pour tendre, là encore, à limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour raffiner, nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles ovariectomisés, afin de modéliser la ménopause. Ceci diminuera les variations dans les réponses immunitaires chez des sujets âgés, et permettra une meilleure comparaison entre nos groupes expérimentales. L’ajout d’angiotensine II couplé à 1% NaCl dans l’eau de boisson permet de déclencher l’hypertension artérielle chronique de facon homogène. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et nous appliqueront une grille d’évaluation du bien-être animal séparément pour chaque individu. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergé dans des portoirs ventilés au nombre maximum de 5 animaux par cages avec de l’enrichissement. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Une couverture analgésique sera proposée avant, pendant et après l’induction avec une évaluation quotidienne la première semaine post-chirurgicale de la douleur basée sur la 'grimace scale de Langford'. Couplé à un suivi de poids, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite en période post-opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons utiliser des souris jeunes adultes (3 mois) mais principalement des souris âgés (18 mois) afin d’étudier les effets de vieillissement sur le cœur. L’ovariectomie (ovx) est rendue nécessaire car des souris âgées n’entrent pas la ménopause. De même façon, les souris âgés ne sont pas spontanément hypertensives, nécessitant une implantation d’un mini pompe délivrant de l’angiotensine II couplé a 1% NaCl dans l'eau de boisson. Nos comparaisons seront : 1) souris jeunes versus souris ‘contrôles’ vielles ovx mais sans hypertension afin d’identifier les différences liés au vieillissement ; 2) souris contrôles vielles versus souris avec insuffisance cardiaque fraction d’éjection préservé (ICFEp) (induit par vieillissement et ovx accompagné d’hypertension) afin d’identifier les effets délétères sur la fonction cardiaque ; et 3) souris ICFEp traités avec des anticorps contrôles versus des anticorps anti-IL1beta et/ou anti-IL6.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère cérébrale, reçoit des injections puis est tuée pour prélever son sang et ses tissus, afin d'étudier le rôle des cellules sanguines dans le défaut de recirculation. Le porteur indique que le modèle induit une douleur et une perte sensorimotrice, avec perte de poids et déshydratation possibles. Il justifie le recours aux souris par la durée de vie très courte des cellules sanguines et affirme que le projet ne peut s'envisager que dans un "organisme entier".

Objectifs

Chaque année, les accidents vasculaires cérébraux touchent plus de 13,7 millions de personnes, ce qui représente la deuxième cause de décès et la première cause d'invalidité dans le monde. Ceux-ci sont dans 80% des cas liés à l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La recirculation sanguine peut être réalisée par le retrait du caillot lors d’une intervention chirurgicale ou par sa dégradation grâce à l’injection intraveineuse d’un traitement médicamenteux. Cependant, même après la dégradation du caillot par ce traitement, la circulation sanguine reste insuffisante chez plus de 50 % des patients ce qui est à l’origine d’une évolution défavorable voire de leur décès. De nombreuses études cliniques et précliniques semblent indiquer que la principale cause de l'absence de flux sanguin est l’obstruction des capillaires par des cellules sanguines. L’objectif de la présente étude est de déterminer les mécanismes par lesquels les cellules sanguines bloquent les capillaires cérébraux. Notre hypothèse est que leur propriété de déformation et d’élasticité est diminuée après un accident vasculaire cérébral. Il a été récemment démontré qu’une enzyme modifie la forme des cellules sanguines et que l’inhibition de celle-ci améliore la circulation de ces cellules. L’inhibiteur n’a pas été testé dans un contexte d’accident vasculaire cérébral, mais pourrait être un outil intéressant pour réduire l’obstruction des vaisseaux cérébraux. Pour étudier cela, nous souhaitons réaliser des mesures d’élasticité des cellules sanguines de souris ayant subi un accident vasculaire cérébral traitées ou non par l’inhibiteur, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’obstruction des capillaires. Cette étude pourrait permettrait d’améliorer la recirculation sanguine chez les patients victimes d’un accident vasculaire cérébral. La demande de ce projet d’expérimentation animale est justifiée par le fait que le modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris ne peut pas être remplacé par une approche in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’obstruction des capillaires cérébraux par les cellules sanguines à la suite d’un accident vasculaire cérébral est due à une modification de leur élasticité ; à terme cela pourrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques afin de rétablir cette élasticité et d’augmenter la recirculation sanguine après un accident vasculaire cérébral et ainsi d’améliorer le pronostic des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : Les quatre traitements analgésiques seront réalisés par injection en sous cutanée. Chaque injection sera réalisée sur les souris vigiles et aura une durée d’environ 30 secondes. Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générales (avec une analgésie préalable) avec une durée d’anesthésie / chirurgie d’environ 45 minutes. Deux traitements par voie intraveineuse seront réalisés 30 minutes après le début de l’ischémie sur souris anesthésiées et seront d’environ 1 minute pour l’injection de l’inhibiteur ou de son solvant et de 30 minutes pour l’injection de l'activateur tissulaire recombinant du plasminogène; en effet, dans ce cas, 10% de la dose sont injectés en environ une minute, le reste (90%) est injecté pendant les 29 minutes suivantes à l’aide d’un pousse seringue. Une anesthésie générale profonde, avec aussi une analgésie préalable, d’environ 10 minutes sera réalisée lors de la fin de l’étude pour le prélèvement sanguin. Deux injections de solution physiologique pour la réhydratation post opératoire seront réalisées sur souris vigile en sous cutanée. Chaque injection sera d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le modèle d’accident vasculaire cérébrale induit une douleur peropératoire et une perte sensorimotrice. Une perte de poids et une déshydratation peuvent également être attendues. Un stress lié à l’anesthésie et des douleurs associées aux injections peuvent être présents lors des manipulations.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer le sang et des tissus

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier le rôle des cellules sanguines dans la mauvaise recirculation sanguine survenant après un accident vasculaire cérébral. Les cellules sanguines ont une durée de vie très courtes (quelques heures) et il est nécessaire d’utiliser des cellules fraichement isolées de souris pour étudier leur comportement et maintenir leurs propriétés afin de mieux comprendre leur implication dans les vaisseaux sanguins après l’accident vasculaire cérébral. Ce projet ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. De plus, le nombre de cellules sanguines isolées à partir d’une souris est élevé, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- et post-opératoire. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée sur la zone de chirurgie. La chirurgie est par ailleurs réalisée au cours d’une anesthésie générale. En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Après leur réveil, quelques croquettes pulvérisées au pilon humidifiées seront placée dans la cage, pour faciliter l’alimentation. De l’eau sous forme d’hydrogel sera également proposée. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score. En cas de réouverture de la plaie chirurgicale lors du suivi post opératoire, elle sera nettoyée et un point de suture sera réalisé sous anesthésie générale ; pour permettre à l’animal de récupérer dans un environnement calme, il sera isolé dans une autre cage pendant le reste de l’expérience (inférieur à 24h). Les souris seront gardées 24 heures après l’accident vasculaire cérébral et le prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde et traitement analgésique.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence de la souris pour étudier les maladies cardiovasculaires. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne réalisé chez la souris est lui-même reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral, et permettre de mieux comprendre le phénomène chez l’humain. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte, le modèle sera réalisé sur des souris adultes d’au moins 2 mois.

140 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie provoquant un infarctus du myocarde par fermeture transitoire d'une coronaire, suivie d'une injection d'un produit censé protéger le cœur. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde (crise cardiaque) est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il faut savoir qu’il y a environ 120000 infarctus du myocarde en France tous les ans avec un taux de mortalité autour de 25%. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer ce taux en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis d’administrer le traitement (ou le placebo) consistant en une injection de produit à visée cardio-protectrice (angiopoïetine-like-4). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie/analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 1h30 permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Le traitement envisagé a déjà été testé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

154 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie qui provoque un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une artère coronaire, suivie d'un traitement par une fraise vibrante placée dans la coronaire. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde, appelé couramment crise cardiaque, est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer cela en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis de réaliser un traitement cardio-protecteur basé sur des vibrations à très haute fréquence produites par une micro-fraise vibrante au bout d’une tige métallique très fine placée dans la coronaire (système Rotablator). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie et l’analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 2h permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. De plus, nous ne pouvons aussi exclure une des rares complications mortelles de l’utilisation du Rotablator, principalement la perforation de la coronaire, entrainant un décès non souhaité. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Il ne parait pas justifié d’effectuer le traitement envisagé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme, alors qu’il a donné des résultats sur notre modèle animal utilisé. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", ce volet étant la seconde partie d'une étude sur une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25µL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200µL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) pour les analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", pour étudier une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25μL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200μL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, thymus) pour l'analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.