Système cardiaque
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Modèle de rat pour l’étude préclinique des maladies chroniques rénales
- Recherche fondamentale
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1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.
Bénéfices attendus
Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.
Procédures
1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)
Impact sur les animaux
1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)
Remplacement
L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).
Raffinement
Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.
Choix des espèces
L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.
Etude de l’intravasation des mégacaryocytes lors de thrombopénies induite par chimiothérapies
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Système cardiaque
386 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie induisant une thrombopénie, des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et, pour certaines, une chirurgie du crâne permettant d'imager la moelle osseuse, le tout sous anesthésies répétées. Le porteur classe les procédures en modéré surtout à cause du stress lié aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil. Il affirme que l'étude de la formation des plaquettes exige un animal adulte vivant et que la souris est la seule solution.
Objectifs
La thrombopénie correspond à une baisse de la numération plaquettaire exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est le passage des MKs au travers de la barrière des vaisseaux (intravasation), ces évènements, très rares, permettent la libération des plaquettes dans la circulation sanguine. Avenant : dosage de la TPO plasmatique dans le sang. La thrombopoïétine (TPO) est une hormone produite en grande partie par le foie qui permet la régulation de la production des plaquettes par les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. La concentration en TPO est inversement proportionnelle avec la courbe de la numération plaquettaire avec un décalage dans le cadre d’une thrombopénie. Or, notre modèle de thrombopénie induite par chimiothérapie, nécessite une vision complète des conditions biologiques dont l’évolution de la concentration en TPO endogène au cours des traitements ce qui induit l’utilisation d’animaux vivants. En effet, l’une des perspectives du projet est d’administrer de la Romiplostim, un analogue de la TPO, qui permettrait de limiter/réduire la thrombopénie dans le cadre de la CIT. Cependant, la fenêtre d’administration de cet analogue n’est pas bien définie pour être pleinement efficace. L’objectif de cet avenant et de nous permettre de définir la fenêtre d’administration optimale de la Romiplostim® en fonction de la concentration en TPO endogène. Notre projet concerne la capacité de la moelle et des mégacaryocytes résidents à se remanier et restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT).
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie par un analogue de la TPO, le Romiplostim.
Procédures
Nous avons précisé « Tous les animaux seront anesthésies quelques minutes au masque pendant les injections des traitements pharmaceutiques (une seule injection au début de l'étude) puis pendant les prélèvements d'un faible volume de sang à la queue tous les 2 jours. La durée moyenne de ces injections est 1 minute. Certains animaux seront soumis en plus à une séance d’imagerie de la moelle d’une durée maximale de 3h, tandis que d’autres seront soumis à un prélèvement sanguin terminal (durée 2 minutes) . Ces gestes seront réalisés sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Pour l’ensemble des substances injectées aucune souffrance, aucune perte de poids, aucun saignement n’a été observé. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. En ce qui concerne les expériences par microscopie, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui n’expriment aucun phénotype dommageable. Ces expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées, elles subiront une petite chirurgie cutanée sur le sommet du crâne pour laquelle nous anticipons une légère inflammation et surveillons les saignements potentiels. Tous les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Devenir
A l’issu des procédures tous les 386 animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.
Réduction
Les souris issues de la première série d’expériences seront utilisées pour les études de cytométrie. Afin d’éviter des répétitions inutiles, le point « homéostasie » avant traitement sera réalisé une seule fois par traitement médicamenteux. A la fin des observations intravitales, les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est déterminé de manière à obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
Raffinement
Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmaceutique, qui dans notre cas est le Romiplostim. L’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées à un âge habituel de souris adulte entre 8-18 semaines afin de standardiser au mieux les différents traitements. Les souris C57/Bl6 sont commandées par notre service selon nos besoin, il nous est donc aisé d'ajuster les âges de nos différents groupes.
Identification des neurones du tronc cérébral impliqués dans la régulation de l’activité cardiovasculaire pendant la respiration
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1320
2 472 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les animaux subissent dès l'âge d'une semaine une amputation de phalange sur animal vigile, puis une à deux chirurgies d'une à deux heures et demie, des injections intracérébrales de virus, la pose de cathéters et de sondes et des injections répétées, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie la phalangectomie de "nuisance" et reconnaît le stress des contentions et des chambres de pléthysmographie, tout en affirmant l'absence d'inflammation liée aux virus. Il indique qu'aucune approche autre que l'expérimentation animale n'est envisageable en l'état, espérant que ces données fonderont de futures études in silico.
Objectifs
La respiration et l'activité du cœur et des vaisseaux sanguins sont contrôlées par des réseaux de neurones situés dans une partie du cerveau nommée tronc cérébral. Ces deux fonctions vitales participent ensemble au renouvellement de l’oxygène (O2) et du dioxyde de carbone (CO2) dans l’organisme. Cependant, nous ne savons toujours pas précisément quels sont les mécanismes nerveux qui permettent à l’activité cardiovasculaire de varier pendant la respiration. L’objectif général du projet est d’identifier les neurones impliqués dans ce processus et d’en expliquer les mécanismes. A l’aide de techniques innovantes basées sur l’utilisation de virus modifiés, nous localiserons d’abord ces neurones avec une grande précision dans le tronc cérébral. Ensuite, il s’agira de stimuler les neurones que nous aurons identifiés afin de mesurer les effets physiologiques provoqués. Dans d’autres expériences basées sur des techniques récentes d’imagerie, l’activité électrique de ces neurones sera enregistrée. Enfin, nous chercherons à savoir comment les paramètres cardiovasculaires et respiratoires contrôlés par ces neurones varient dans le cadre de comportements spécifiques. Les expériences proposées devraient permettre de démontrer que les neurones identifiés participent bien au contrôle cardiovasculaire pendant la respiration, notamment grâce à notre capacité de les activer ou les inactiver. Chez l’homme, ce contrôle nerveux cardiovasculaire que nous étudions est présent chez les individus en bonne santé, tandis qu’il est altéré dans de nombreuses pathologies. Notre projet a donc pour ambition de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces processus physiopathologiques dans l’espoir de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche proposé vise a améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de deux fonctions vitales que sont la respiration et le système cardiovasculaire. Les résultats obtenus devraient permettre d'élucider les mécanismes neuronaux à l'origine de la genèse du rythme respiratoire et du couplage cardiorespiratoire. Plus précisément, il s'agit d'itentifier les populations de neurones qui contrôlent l’activité respiratoire et qui régulent l’activité cardiovasculaire et ainsi de mieux comprendre l’origine de la synergie entre les activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces mécanismes sont d’une importance cruciale tant d’un point de vue fondamental que clinique. En effet, le fonctionnement normal de ces systèmes garantit l'oxygénation optimale de toutes les cellules de l'organisme, tandis que l’altération de ces mécanismes conduit à des pathologies mortelles telles que l’hypertension artérielle ou encore l’insuffisance cardiaque chronique. Les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et le fonctionnement en synergie des activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces découvertes pourraient donc permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre ces maladies. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Procédures
Une biopsie de la phalange distale sera effectuée sur tous les animaux (rats et souris) âgés d'une semaine. En effet, le jour postnatal 7 (P7) semble être l'âge le plus adéquat pour réaliser cette biopsie. Une seule intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 sera réalisée dans deux procédures chez le rat et/ou la souris. Dans les deux autres procédures, deux interventions chirurgicales d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 seront effectuées chez la souris et/ou le rat. Ces deux interventions seront séparées d'une vingtaine ou d'une quarantaine de jours. Selon les procédures, les animaux seront soumis à différents types d’interventions. Tous les animaux recevront une ou plusieurs micro-injections cérébrales de virus modifiés (une seule fois, durée de l’intervention : 20-30 minutes). Chez certains animaux, une ou deux canules optiques intracérébrales seront fixées à la surface du crâne (une seule fois, durée : 45 minutes environ) et un cathéter sera également inséré dans une artère pour mesurer la pression artérielle (une seule implantation fixe, durée : environ 35 minutes). Dans d’autres cas, une sonde de télémétrie sera implantée en sous-cutané chez les animaux pour mesurer l’activité électrique cardiaque (une seule implantation fixe, durée : environ 40 minutes). Chez d’autres animaux, plusieurs injections de composés pharmacologiques seront réalisées par voie intrapéritonéale (fréquence : 2 injections par jour espacées de 12h, pendant 15 jours ; durée d’une injection sous anesthésie légère: 5 minutes). Enfin, pour mesurer les paramètres respiratoires sur le long terme, certains animaux seront d’abord acclimatés dans un pléthysmographe (1h par jour pendant 10 jours), avant de les placer de nouveau dans cet appareil pour les enregistrements chroniques (1h par jour, pendant 2 semaines environ).
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. C’est notamment le cas de la phalangectomie sur animal vigile qui représente une nuisance et de l’anesthésie qui en soi génère du stress. Le test de contention utilisé afin de mesurer le niveau de stress des animaux génère également du stress. Le fait de placer les animaux dans une chambre de pléthysmographie de manière répétée ou encore d’effectuer plusieurs fois des injections de composé 21 sous anesthésie induit un stress. Dans tous les protocoles, la douleur, la souffrance et le stress liés aux procédures chirurgicales seront réduits à un niveau minimum grâce à l'emploi d'une anesthésie, d'une antalgie et de soins médicamenteux appropriés. Les responsables de projet ont une grande expérience dans la mise en œuvre des techniques de chirurgie et de la prise en charge ainsi que du suivi post-opératoire des animaux. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. Enfin, il n'y aura pas de nuisances ou effets indésirables suite à l'injection intracérébrale des virus utilisés dans ce projet. En effet, il s’agit de virus non-réplicatifs dont le génome a été altéré dans le but de ne produire que certaines protéines essentielles à la fonction virale souhaitée (ciblage et manipulation des neurones d’intérêt). Les données de la littérature et notre propre expérience indiquent que les conditions dans lesquelles ces virus sont injectés (niveau de titre, volumes injectés etc.) n'induisent pas d'inflammation notoire au niveau du site d'injection ou ailleurs dans le cerveau (tissu nerveux sain dans la zone d'injection, cellules aux aspects normaux etc).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, dans la plupart des cas le cerveau des animaux devra être prélevé dans le but de localiser les neurones d’intérêt. Dans d’autres cas, le modèle expérimental mis en œuvre nécessitera une euthanasie préalable.
Remplacement
Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de genèse du rythme respiratoire et de couplage entre neurones respiratoires et cardiovasculaires. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiopathologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux cardiorespiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Réduction
Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour étudier le contrôle central cardiorespiratoire. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. En particulier, la technique d’enregistrement des activités cellulaires par imagerie du voltage sur la préparation perfusée in situ nous permettra de répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, la variabilité interindividuelle sera réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Enfin, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils, approches techniques et modèles murins les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez la souris et le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre limite d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici des approches chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, notamment pour ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire rigoureux en utilisant notamment une fiche individuelle de suivi. Les responsables du projet possèdent une grande expérience dans ce domaine.
Choix des espèces
Dans ce projet, deux espèces d’animaux seront utilisées, souris et rats. L’intérêt général de ces deux modèles repose essentiellement dans leur proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, il existe aujourd’hui une banque importante de souris transgéniques qui nous permettra d'identifier précisément les mécanismes en jeu grâce à la variété de recombinaisons génétiques possibles. Le modèle rat présente l’avantage d’être plus robuste physiologiquement que le modèle souris, notamment en ce qui concerne l’approche in situ (voir procédure 3), permettant d’utiliser moins d’animaux (car moins de perte expérimentale) pour chaque objectif expérimental. Les animaux adultes provenant des établissements éleveurs seront maintenus dans l'établissement utilisateur et les expériences seront effectuées sur la descendance. Une biopsie de phalange distale (phalangectomie) sera d'abord effectuée à l'âge d'une semaine (P7), ce qui permettra de réaliser le génotypage et d’identifier ainsi chaque animal. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus dans l'ensemble du projet de recherche, toutes les expérimentations reposeront sur des injections virales effectuées à l'âge de trois semaines (P21). A cet âge, le génotype des animaux sera donc connu. Les expérimentations finales des procédures 1, 2 et 4 seront réalisées chez le rat et/ou la souris à l’âge adulte (2-5 mois), et celles de la procédure 3 sera réalisée chez le rat à un stade juvénile (P30-35). Nous cherchons à déterminer les mécanismes générant le rythme respiratoire et le couplage central cardiorespiratoire dans les conditions les plus physiologiques possibles, chez des organismes pleinement développés et non-sénescents. Ces mécanismes sont pour l’instant mieux connus pour les stades développementaux précoces, notamment grâce aux approches in vitro qui ne fonctionnent qu’à ces âges. La préparation in situ, utilisée en procédure 3, est optimale chez le rat juvénile à condition d'être réalisée à P30-35 maximum. C'est donc cette contrainte temporelle qui justifie d'effectuer les injections virales à P21 (sevrage) pour permettre un temps d’expression suffisant des transgènes.
Explorer le rôle inflammatoire plaquettaire dans la Maladie ThromboEmbolique Veineuse (MTEV) chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection intraveineuse de siRNA déclenche une thrombose que le porteur qualifie lui-même de "douleur sévère", pouvant provoquer perte de poids, léthargie, hypothermie et hémorragies oculaires et sous-cutanées. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou atteignent un score limite sont mises à mort, les autres étant tuées pour prélever sang et tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune méthode alternative" et revendique le modèle murin comme référence, tout en reconnaissant des différences entre immunité murine et humaine.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre quels sont les conséquences du rôle inflammatoire plaquettaire et le thrombin dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV).
Bénéfices attendus
Les plaquettes et le thrombin semblent pouvoir jouer un rôle clé dans cette situation : plaquettes sont connues comme impliquées à la fois dans la survenue d’un épisode thrombotique, et aussi comme facteurs intervenant dans la réponse inflammatoire. Les plaquettes régulent directement la réponse immunitaire par l’expression et la sécrétion de molécules inflammatoires. De plus, elles sont capables de fixer des micro-organismes. Enfin, les plaquettes interagissent avec les cellules immunitaires, notamment les neutrophiles et les macrophages. On pense maintenant que les plaquettes pourraient agir comme des cellules sentinelles du système immunitaire. La thrombine est un acteur clé de la coagulation et un activateur plaquettaire, et une meilleure compréhension du rôle de cette molécule est cruciale pour améliorer nos connaissances sur la MTEV
Procédures
Les souris vont subir de 1 à 2 injections intrvaveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
La thrombose induite pas ces approches expérimentales ne met pas la vie des souris en danger. La thrombose spontanée, induite par injection intraveineuse des siRNA, est considérées comme "douleur sévère" infligée aux animaux. Suite à l’induction de la thrombose après l’injection des siRNA contre les protéines (antithrombine/protéine C), on peut observer une perte de poids, une léthargie, une absence de réponse aux stimuli et une hypothermie. Des lésions unilatérales impliquant l'œil (exophtalmie) ainsi que des hémorragies intraoculaires et périoculaires peuvent être observées, tout comme des gonflements des régions maxillaires, mandibulaires et submandibulaires ; hémorragies sous-cutanées et intramusculaires. Aucune anomalie visible, aucun effet secondaire connu sont reportés pour les déplétions plaquettaires, des neutrophiles et des macrophages. Concernant les infections bactériennes, les souris peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une perte de poids. Les souris peuvent apparaître léthargiques et insensibles aux stimuli. Les souris seront observées quotidiennement notamment pour la recherche des possibles phénotypes ci-dessus inclus dans les calculs des points limites. Les effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Le traitement des souris avec des inhibiteurs de la thrombine (dabigatran, ACD-10, hirudine) ne coïncide avec aucune forme d'anomalie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupération de sang et de tissus biologiques
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’exploration du rôle inflammatoire plaquettaire dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV) nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme et dans le but de cibler des thérapeutiques modulant la physiologie des plaquettes sanguines.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons évalué in vitro le rôle inflammatoire des plaquettes sanguines en lien avec l’immunothrombose que ce soit dans des contextes infectieux ou non. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche. Afin de réduire le protocole, une étude pilote de 10 animaux permettra la mise au point et la maîtrise des gestes opérationnels. Un groupe « mise au point de la procédure » ainsi que 2 groupes « expérimentaux » de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail.
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permette d'avoir un enrichissement (avec paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Afin de réduire la souffrance occasionnée par l’expérience, les souris seront observées quotidiennement et seront mises à mort lorsqu’une perte de poids de plus de 20% sera constatée ou lorsque qu’un pointage limite de 5 sera atteint dans la grille de suivi du bien-être animal. Ce seuil correspond à un niveau de souffrance ne pouvant être prolongé chez l’animal. Les souris vont subir de 1 à 2 injections intraveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Une ponction cardiaque lors du prélèvement sanguin sera réalisée sur les animaux sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de la physiopathologie des phénomènes thrombotiques. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations immunologiques humaines. Nous étudions les séquelles de la thrombose veineuse chez la souris. Pour notre étude, nous utiliserons des souris consanguines de plus de 20 grammes, âgées de 6 à 10 semaines. Les mâles et les femelles seront inclus dans nos expériences, sauf si la formation de thrombus s'avère absente/moins reproductible chez l'un des deux sexes lors de la mise en place du modèle animal, ce qui à ce jour n’est pas démontré dans les études de prévalences homme/femme dans cette pathologie.
Création et recanalisation d’une thrombose veineuse par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le dispositif à ultrasons testé ici est un prototype conçu par le laboratoire pour rouvrir les veines bouchées par un caillot, avant de futures études chez l'humain. 28 porcs charcutiers de 40 à 50 kg vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chacun subit une procédure endovasculaire de trois heures, par ponction de la veine jugulaire et de la veine fémorale, pour créer une thrombose veineuse profonde, puis une heure de traitement par ultrasons. La mise à mort permet de prélever les poumons, la veine et l'artère fémorales, et le porteur la présente aussi comme "motivée par le souci du bien-être animal" et destinée à "assurer une conclusion éthique" à leur participation, pour des porcs qui ne sortent pas de l'anesthésie.
Objectifs
L'objectif principal de notre projet est l'évaluation de l'efficacité de notre dispositif en termes de recanalisation de la thrombose veineuse aigue. Nous évaluerons l'efficacité de ce dispositif grâce à la mise en évidence d'un chenal et la présence d'un flux sur l'écho-doppler veineux réalisé en fin de procédure. Les objectifs secondaires du projet sont l'évaluation de la sécurité du dispositif, à la lumière d'un examen clinique de la jambe de l'animal pour constater l'absence de lésion cutanée, d'une échographie doppler afin de constater l'absence de lésion artérielle ou veineuse, et d'un examen histologique de la veine de l'artère et des poumons du porc permettant de conclure à l'absence de lésion artérielle ou veineuse ainsi qu'à l'absence d'embolie pulmonaire.
Bénéfices attendus
Nous avons obtenu des résultats très encourageants avec le dispositif préliminaire. Nous souhaitons évaluer le nouveau dispositif de thérapie développé au sein du laboratoire qui sera le prototype utilisé chez l'homme afin de valider la sécurité et l'efficacité pour pouvoir ensuite envisager des études chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure endovasculaire sous anesthésie générale sans reveil avec une ponction jugulaire et fémorale pour la création de la thrombose veineuse profonde : 1 fois par procédure pour une durée de 3h et une procédure sous anesthésie générale de thérapie par ultrasons non invasive : 1 fois par procédure pour une durée d'1h
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'a eu lieu lors des premières expérimentations. Nous surveillerons les points limites pouvant entrainer une prescription d'antalgique ou une mise à mort de l'animal. - Hémorragie - Ischémie du membre - Hypotension - Tachycardie - Hypothermie - Mouvement anormaux de l'animal - Plaie avec écoulement - Oedeme du membre inférieur
Devenir
La décision de mettre à mort les animaux à l'issue de la procédure est prise après une réflexion approfondie et dans le strict respect des principes éthiques qui guident notre recherche. Les raisons sous-jacentes à cette mesure sont les suivantes : - Nécessité scientifique : La mise à mort des animaux est considérée comme essentielle pour obtenir des données cruciales à la compréhension des mécanismes biologiques ou des effets de la procédure étudiée. Il est impératif d'analyser les tissus ou organes spécifiques post-mortem afin d'obtenir des informations détaillées et pertinentes pour les objectifs de recherche.Cette mise à mort est nécessaire ici car le projet requiert un prélèvement des poumons, de la veine et de l'artère fémorales pour analyse histologique après mise à mort de l’animal afin d'évaluer la sécurité de notre dispositif. - Minimisation des souffrances : La mise à mort des animaux à l'issue de la procédure est également motivée par le souci du bien-être animal. Cette approche permet d'éviter toute détresse inutile ou prolongée qui pourrait résulter de complications postopératoires ou d'effets à long terme de l'intervention. - Respect des lignes directrices éthiques : Notre protocole s'aligne strictement sur les lignes directrices éthiques nationales et internationales régissant l'utilisation d'animaux dans la recherche. La mise à mort est envisagée comme une étape nécessaire pour garantir la conformité avec ces normes et pour éviter toute prolongation injustifiée de la présence des animaux dans des conditions potentiellement inconfortables. - Responsabilité envers le bien-être animal : Nous nous engageons à assumer notre responsabilité envers le bien-être des animaux participant à notre étude. La décision de mettre fin à leur vie est prise dans le souci de minimiser leur éventuelle souffrance et d'assurer une conclusion éthique à leur participation à la recherche.
Remplacement
Nous accordons une importance primordiale à la considération des alternatives avant de recourir à l'utilisation d'animaux dans nos recherches. Avant d'atteindre le point où l'utilisation des animaux devient nécessaire, nous nous engageons à explorer des alternatives viables et éthiquement justifiables. Dans le cadre de l'évaluation de ce dispositif, nous avons initialement travaillé sur un modèle in vitro de thrombus de sang frais dans un tube en silicone, nous permettant l'optimisation des paramètres ultrasonores et l'évaluation de l'éfficacité. En revanche le modèle animal est indispensable pour réunir les conditions les plus proches de l'homme, et faire une analyse de sécurité. Pour ce travail, seul un modèle de gros animal pouvait convenir du fait de la nécessité d’un calibre de veine accessible de plus de 2 mm, d’où l’utilisation d’un modèle porcin indispensable déjà validé pour la thrombose aiguë, limitant ainsi l’utilisation d’animaux pour la création d’un nouveau modèle. Nous continuerons à surveiller les avancées scientifiques afin d'incorporer de nouvelles méthodes et technologies alternatives, garantissant ainsi que notre utilisation des animaux reste minimale, justifiée et respectueuse des principes éthiques.
Réduction
Dans le cadre de notre engagement envers le respect du bien-être animal, notre projet de recherche intègre activement des mesures visant à réduire le nombre d'animaux utilisés tout en assurant la rigueur scientifique de nos investigations. Les principales stratégies mises en œuvre à cet égard sont les suivantes : - Optimisation expérimentale : Nous avons minutieusement conçu notre protocole expérimental pour maximiser l'information obtenue à partir de chaque animal participant. Cela comprend la mise en place de mesures permettant d'atteindre nos objectifs de recherche avec un nombre minimal d'individus. - Échantillonnage raisonné : L'approche statistique prévue pour notre projet repose sur un échantillonnage stratégique visant à garantir la représentativité tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires. Les techniques statistiques appropriées seront appliquées pour assurer la validité des résultats avec un nombre optimal d'individus. Nous évaluons à 28 le nombre total de porcs nécessaires. Concernant la détermination du nombre d'animaux spécifique à notre projet, celui-ci a été évalué en tenant compte des considérations éthiques, scientifiques et statistiques. Nous avons pris en compte la variabilité biologique attendue, la puissance statistique nécessaire pour détecter les différences significatives. Nous sommes engagés à maintenir une utilisation minimale et justifiée des animaux dans le cadre de notre recherche, en mettant en œuvre des pratiques rigoureuses et en évaluant continuellement les possibilités d'optimisation tout au long du projet.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par l’utilisation de points limites validés avec l’animalerie, et dédiés pour les procédures sous anesthésie générale avec la possibilité d'une mise à mort précoce en cas de mauvaise tolérance de l'animal.
Choix des espèces
Pour rendre l’expérimentation possible, il nous faut un animal d’un poids suffisant, un diamètre de veine fémorale ≥5mm. Les animaux plus petits ne permettent pas d’obtenir ces conditions. Pour rendre des résultats interprétables, l’anatomie doit être comparable aux caractéristiques humaines et le porc présente un système veineux proche de l’homme. Par ailleurs, la technique de création d’une thrombose veineuse profonde a déjà été validée dans un modèle porcin. Jeunes porcs charcutier avec un poids variant entre 40 et 50kg ce qui correspond a 14- 15 semaines d’age. (suffisamment âgés pour obtenir un diamètre de la veine fémorale commune > 5mm). Le poids est choisi afin de pouvoir realiser les echographies-Doppler veineux comme déjà publié dans la litterature et pour tester la faisabilite de notre therapie ultrasonore sur une anatomie similaire a l’homme.
Inhibition d’une lipide kinase comme nouvelle stratégie thérapeutique pour prévenir la progression des lésions post-AVC
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, reçoivent un inhibiteur en injection quotidienne, puis sont tuées 24 heures après pour analyse des lésions. Le porteur décrit une paralysie latérale, une perte de sociabilité et de vitalité, qu'il présente comme non douloureuse par transposition de l'observation humaine. Il affirme que le recours au modèle murin est "irremplaçable" en raison de la complexité des mécanismes de l'AVC.
Objectifs
Les accidents vasculaires ischémiques cérébraux (AVC) sont la deuxième cause de mortalité dans le monde. Ils sont causés par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La restauration de la circulation sanguine le plus rapidement possible dans l’artère occluse est le seul traitement des infarctus cérébraux. Toutefois, dans environ 30% des cas, cette restauration du flux sanguin dans l’artère cérébrale occluse, bien qu’indispensable, entraine l’apparition de nouvelles lésions appelées « lésions de reperfusion ». Les mécanismes sont complexes et impliquent un dysfonctionnement du vaisseau et une réponse inflammatoire importante conduisant à une perméabilité vasculaire et à la mort neuronale. Notre équipe étudie le rôle d’une famille de protéines dans différents contextes physiopathologiques. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine sont normales, nous venons de mettre en évidence son rôle dans le contexte pathologique de l’AVC. Ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, et présentent des lésions cérébrales réduites. Ces résultats identifient la protéine d’intérêt comme une cible thérapeutique intéressante dans le contexte de l’AVC. Nous avons établi un partenariat pour générer un inhibiteur (bloqueur) de cette protéine que nous allons tester sur le modèle murin d'AVC. A terme, ce projet a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant le vaisseau au moment de la reperfusion de l’artère bouchée, afin de diminuer les lésions cérébrales post-AVC et donc les séquelles chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité de molécules candidates les plus prometteuses sur la protection des lésions post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 injection/jour d’un inhibiteur pour induire l’inhibition de la protéine d'intérêt. Une procédure chirurgicale sera réalisée pour induire un AVC (intervention qui dure environ 15 min sous anesthésie et analgésie). Les animaux seront ensuite euthanasiés (24h après la chirurgie) pour être analysés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue) de colorant sera réalisée (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises une chirurgie pour induire un AVC (chirurgie réalisée sous anesthésie générale en présence d’analgésique en prè-opératoire et post-opératoire). Les souris seront euthanasiées 24h après la chirurgie et l’ischémie cérébrale sera analysée. L’ischémie cérébrale entraine une paralysie latérale (patte avant rétractée, œil fermé, animal tourne sur lui-même toujours dans le même sens ou dans certains cas vrille sur lui-même), une perte de sociabilité et de vitalité. Chez l’Homme, cette paralysie latérale due à l’ischémie, bien qu’impressionnante, n’est pas douloureuse. Nous pouvons donc penser qu’il en est de même chez l’animal. Les animaux ne seront pas impliqués dans plusieurs procédures.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les lésions d'ischémie cérébrale.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Les doses d’inhibiteurs à injecter ainsi que la voie d’administration (intraveineuse ou orale) seront déterminés en fonction des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme, et Excrétion) et de pharmacocinétiques (concentration maximale, demi-vie, volume de distribution, clairance et biodisponibilité) qui sont en cours de réalisation par notre collaborateur. Le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus au cours de la procédure. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes (traité / non traité). Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Le traitement « antiplaquettaire + inhibiteur » sera réalisé uniquement si des résultats concluants sont obtenus avec l’inhibiteur seul.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Une observation quotidienne (plusieurs fois par jour) des souris sera réalisée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Expérimentation réalisée sur souris anesthésiées et analgésiées. L’injection de l’analgésique sera également réalisée en post-opératoire (6 à 8h après la chirurgie puis après 8 à 12h). Un anesthésique local en injection intradermique sera également administré avant l’incision (chirurgie). La procédure sera réalisée sur plaque chauffante à 37°C pour le confort de l'animal au réveil. Expérience en manipulation des animaux et en chirurgie des expérimentateurs (formation en chirurgie validée). Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. La vitalité et les expressions faciales seront évaluées (ouverture des yeux, nez et joues « froncées », position des oreilles et des moustaches). Les points limites seront basés sur la perte de poids (maximum 20% du poids initial) et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience.
Choix des espèces
Ce projet a pour but de tester l’impact d’inhibiteurs nouvellement synthétisés spécifiques de la protéine d’intérêt (aucun inhibiteur n’est actuellement disponible sur le marché) dans la progression des lésions cérébrale post-AVC afin de voir si nous reproduisons l’effet protecteur obtenu avec des souris exprimant une forme inactive de la protéine d’intérêt. A terme, cette étude a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant l’endothélium au moment de la reperfusion. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de tester ces molécules dans ce contexte physiopathologique de l’AVC. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte).
Etude du rôle protecteur d’une protéine anticoagulante dans la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues drépanocytaires, elles subissent des injections répétées sous anesthésie, des prélèvements de sang et, pour une partie, un passage en hypoxie de trois heures destiné à déclencher des crises vaso-occlusives douloureuses, avant prélèvement des organes. Le porteur décrit ces crises comme transitoires et prises en charge par un antidouleur puissant administré en prévention. Il affirme que la souris est "le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible" et conclut à la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier l'inflammation multi-organes.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Les principales complications de cette maladie sont des crises appelées "vaso-occlusives" (CVOs), qui sont très douleureuses, durent plusieurs jours et nécessitent d'être soulagées en urgence, à l'hôpital. Malheureusement, la répétition de ces crises entraine ensuite des dommages sur les organes des patients, ce qui peut entrainer leur dysfonctionnement complet, et la mort du patient. Afin de traiter ou prévenir ces crises, et donc apporter un bénéfice thérapeutique important aux patients, nous nous proposons de montrer qu'une protéine contenue dans notre organisme joue un rôle protecteur important chez les patients. De plus, nous souhaitons également évaluer si cette protéine est importante pour limiter la mise en place de processus qui se mettent en place progressivement (notamment l'inflammation) et qui conduisent à des dysfonctions des organes chez ces patients. Si les résultats obtenus lors de ce présent projet sont positifs, nous sommes également en train de développer au laboratoire un médicament capable de stimuler spécifiquemenent cette protéine, et nous sommes déjà prêts à démarrer le développement clinique de cet éventuel futur médicament. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous espérons montrer pour la première fois un effet protecteur dans la drépanocytose d'une protéine naturellement présente dans notre sang, ce qui permettrait de développer ensuite un futur médicament. Ceci est particulièrement important car la drépanocytose est une maladie grave qui se traite très difficilement, et les traitements de fonds actuels sont limités, ne sont pas complètement efficaces, et/ou présentent des effets indésirables.
Procédures
Une partie des souris utilisées dans le projet seront tatouées au niveau des phalanges et un petit bout d’oreille sera prélevé (sans anesthésie), 10 jours après leur naissance, puis elles seront ensuite laissées dans leurs cages jusqu'à leur accouplement ; après 2 gestations, les souris seront euthanasiées. Les souris issues de ces accouplements seront tatouées au niveau des phalanges et un petit bout d’oreille sera prélevé (sans anesthésie), 10 jours après leur naissance, puis elles seront laissées dans leurs cages jusqu'à l'âge de 8-10 semaines. Elles seront ensuite injectées (pendant une durée de 30 secondes), sous anesthésie locale, tous les jours pendant 4 jours. Après 5 jours, elles seront injectées (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, et laissées dans leurs cages pendant 2 mois, puis seront prélevées sous anesthésie générale (durée d'1 minute). 1) Une partie de ces souris seront alors remises dans leurs cages pendant 1 mois, injectées 1 fois (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, et placées (ou non) dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. 2) Une autre partie de ces souris seront remises dans leurs cages pendant 1 mois, et elles seront injectées 1 fois (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, puis laissées pendant une durée de 3 h. 3) Une dernière partie de ces souris seront remises dans leurs cages pendant 7 mois et seront prélevées sous anesthésie générale (durée d’1 minute), tous les mois. 4) Toutes les souris seront finalement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, rate, poumons, reins) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris rendues drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, et pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris rendues drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Chez des souris rendues drépanocytaires, des témoins de l’hémolyse, de l’activation de la coagulation et de l’inflammation se mettent à augmenter au cours du temps, et une inflammation dans les organes apparait généralement au bout de 7 mois. Toutefois, ceci ne s’accompagne pas de manifestations cliniques et de signes de douleurs/souffrance au cours de ces 7 mois, en dehors de la survenue possible de crises vaso-occlusives transitoires. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris rendues drépanocytaires ou non, et sont liées à la préhension/contention des animaux, à l'inconfort dû au tatouage des phalanges (non douloureux) et au prélèvement d'un tout petit bout de peau très fine au niveau de l'oreille, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie) et aux prélèvements de sang, ainsi qu’à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie) en fin de procédures.
Devenir
En fin d'expériences, les souris seront systématiquement euthanasiées car des analyses post-mortem sur le sang ou sur des organes seront nécessaires. Lors de la génération et l’élevage des souris utilisées pour le projet, certaines souris auront été génétiquement modifiées et ne pourront donc être ré-utilisées ou replacées, et seront donc euthanasiées.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. De même, l'implication d'une protéine sur le développement de l'inflammation qui se développe dans les organes au cours du temps ne peut être mis en évidence que sur un modèle animal permettant d'analyser en même temps l'inflammation dans plusieurs organes, dans le contexte d'un organisme entier. De plus, pour un organe donné, il est encore impossible de reproduire tous les processus conduisant à l'inflammation dans cet organe, dans le cadre de la drépanocytose. En effet, ces processus sont pour l'instant encore largement méconnus. La mise en évidence de l'importance d'une protéine dans les CVOs et l'inflammation des organes qui en résultent, nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Lors de l’élevage des souris utilisées pour le projet, les accouplements réalisés permettront de ne générer que des souris qui auront des caractéristiques génétiques leur permettant d'être toutes effectivement utilisées pour notre projet. Aucune souris avec des caractéristiques génétiques ne leur permettant pas d'être utilisées dans notre projet ne sera générée. La multiplicité des procédures utilisées nous permettra d'optimiser au maximum les souris générées et de limiter toute génération de souris qui ne seront finalement pas utilisées. La procédure employée pour rendre des souris drépanocytaires par greffe de moelle sera optimisée grâce à des études en début de projet, ce qui permettra ensuite d'utiliser le minimum de souris drépanocytaires donneuses pour greffer un maximum de souris receveuses. Dans les procédures déclenchant des occlusions vasculaires chez les souris rendues drépanocytaires, il est prévu de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang et le plasma, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Dans nos expériences, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Les injections et prélèvement seront effectués sous anesthésie générale (ou parfois locales). Lors des interventions consistant à rendre drépanocytaires des souris, celles-ci pourront développer des crises vaso-occlusives (CVOs) (comme chez les patients), qui sont douloureuses. Ces animaux resteront donc sous la surveillance quotidienne de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont détectés, un médicament anti-douleur très puissant sera administré et les souris resteront sous la surveillance de l'expérimentateur. Si ces changements persistent, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Lors des interventions consistant à déclencher des occlusions vasculaires chez les souris rendues drépanocytaires, celles-ci resteront continuellement sous la surveillance de l'expérimentateur, à la recherche de tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, comme précédemment. Si ces changements et ces signes sont détectés, un médicament anti-douleur très puissant sera administré et les souris resteront sous la surveillance de l'expérimentateur. Si ces changements persistent, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher l'occlusion vasculaire. Cette surveillance très rapprochée sera également réalisée lorsque nous analyserons l'installation de l'inflammation dans les organes, et des témoins de cette inflammation seront mesurés tous les mois, pour détecter si note protéine d'intérêt joue un rôle précoce dans l'installation de cette inflammation. L'inflammation dans les organes a été choisie comme un témoin des dysfonctions d'organes qui apparaissent à des âges plus élevés, pour éviter que les souris rendues drépanocytaires dans notre projet arrivent à ce stade.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées en tout début d'intervention. Cet âge est également nécessaire pour atteindre la maturité sexuelle des souris, avant leur accouplement dans une partie de notre projet. Les souris rendues drépanocytaires seront étudiées jusqu'à 7 mois après avoir été rendues drépanocytaires, pour éviter qu'elles atteignent un stade où des dysfonctions d'organes se mettent en place.
Effet de la complémentation en citrulline sur la vascularisation placentaire et la croissance foetale chez des brebis soumises à un stress thermique en fin de gestation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
28 brebis gestantes vont être utilisées, puis replacées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une complémentation en citrulline et deux prises de sang à la jugulaire pendant le dernier mois de gestation, une partie étant placée en stress thermique qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés respiratoires et un risque accru d'avortement ou de mise bas précoce. Le porteur relie le projet au "besoin" d'atténuer les effets du stress thermique sur la productivité du bétail, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider une approche nutritionnelle. Le raffinement décrit une récompense en granulés après chaque prélèvement et l'absence d'anesthésie locale jugée plus douloureuse que la prise de sang.
Objectifs
Dans un contexte global de changement climatique, les animaux d’élevage sont de plus en plus fréquemment exposés au stress thermique. Sachant que c’est l'un des déterminants environnementaux les plus importants de la productivité du bétail, de nombreuses études montrent que le stress thermique en fin de gestation peut compromettre la croissance du fœtus, affecter l'absorption postnatale des immunoglobulines du colostrum et avoir des actions à long terme qui se traduisent par une réduction de la production laitière lorsque l’animal devient adulte. Afin de réduire les effets du stress thermique, les animaux sont en général placés à l’ombre et rafraichis grâce à des ventilateurs et des arrosages automatiques, mais toutes ces approches ne sont pas sans conséquences en termes de risque sanitaire pour les animaux ou de consommation d’énergie. C’est pourquoi, d’autres approches, en particulier nutritionnelles, peuvent être envisagées. Sachant qu’il a été démontré chez le bovin que le retard de croissance intra-utérin observé chez les veaux pourrait correspondre à une altération de la vascularisation placentaire, nous avons choisi un acide aminé impliqué dans la synthèse locale d’oxyde nitrique (NO) pour améliorer la régulation vasculaire placentaire. De plus, le projet sera réalisé sur des ovins car les pratiques de dessaisonnement en élevage, induisent un stress thermique en fin de gestation lors de dessaisonnement des animaux pour la mise bas du mois de septembre. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation chez la brebis, dans des conditions de stress thermique ou non, sur la vascularisation et la fonction placentaires, le poids des agneaux à la naissance et leur croissance post-natale.
Bénéfices attendus
Validation d'une approche nutritionnelle pour atténuer les effets négatifs du stress thermique sur le placenta et le poids des animaux à la naissance
Procédures
Les animaux auront 2 prises de sang réparties de la manière suivante: une à 110 jours de gestation et une à 140 jours de gestation. Chaque prise de sang dure environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendus de conséquences néfastes à la prise alimentaire de Citrulline qui est un acide aminé favorisant la santé vasculaire. Il pourrait arriver en revanche une hyperthermie des lots mis en stress thermique avec des difficultés de régulation de température et de respiration dues au stade de fin de gestation, et un risque accru d’avortements ou de mise bas précoce. Un petit hématome peut dans de rare cas subvenir à la veine jugulaire après les prises de sang.
Devenir
Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable puisque l'objectif du projet est de valider une approche nutritionnelle pour permettre d'atténuer l'effet du stress thermique sur la croissance foetale.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés (7 femelles par lots) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs permettra de réaliser des analyses statistiques qui dépendront de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests de comparaison de type ANOVA. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non paramétriques pour comparer les lots expérimentaux. Pour cette configuration, on réalisera le test de Mann et Whitney ainsi que le test de permutation pour mesures indépendantes via le logiciel R.
Raffinement
Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. La cellule sera enrichie avec des miroirs et des filets de foin suspendus. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement et chaque échographie, les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les ovins ont été choisis car c'est une espèce soumise au stress thermique en fin de gestaion lors de désaisonnement des animaux pour une mise bas en septembre. Les animaux utilisés sont en fin de gestation car l'objectif est d'évaluer l'effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation sur la vascularisation placentaire et le poids des agneaux à la naissance, dans des conditions de stress thermique.
Étude du rôle des comorbidités liées au vieillissement dans la réparation post ischémique dans un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.
Objectifs
Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).
Procédures
Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.
Impact sur les animaux
L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques
Remplacement
Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Rôle d’un facteur de croissance dans le vieillissement vasculaire pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant maintenue sous anesthésie jusqu'à la mort. Elles sont placées 21 jours dans un caisson à 9 % d'oxygène pour induire une hypertension pulmonaire, ou reçoivent de l'élastase dans la trachée par chirurgie pour provoquer un emphysème, avec mesure de la pression cardiaque et de la fonction pulmonaire sous anesthésie. Le porteur indique une perte de poids modérée et un stress liés aux manipulations, ainsi qu'une douleur légère au poinçonnage de l'oreille servant à l'identification. Il mène en parallèle des cultures de cellules humaines mais affirme que la souris génétiquement modifiée reste "incontournable" pour étudier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Le vieillissement des vaisseaux sanguins avec diminution du nombre de capillaires est un élément clé du vieillissement de l'organisme, ce qui réduit l'apport de nutriments et d'oxygène aux tissus. Ce phénomène semble lié à la diminution d'un facteur synthétisé par les cellules endothéliales des vaisseaux. L’action de ce facteur serait perturbée par une protéine. En absence de ce facteur sécrété par les cellules endothéliales, celles-ci vieillissent plus rapidement, avec un arrêt de leur multiplication et la libération de facteurs nocifs pour le poumon. Il a été démontré qu'un nombre élevé de cellules endothéliales vieillissantes est associé au vieillissement prématuré du poumon et à plusieurs maladies pulmonaires. Notre objectif est de comprendre comment l'absence de ce facteur contribue à ce vieillissement prématuré entrainant des maladies comme l'hypertension et/ou l'emphysème pulmonaires. Pour cela, nous étudierons la protéine, le vieillissement des cellules endothéliales pulmonaires, la fonction pulmonaire et la densité des vaisseaux sanguins chez des souris jeunes et âgées, avec ou sans maladies pulmonaires. De plus, nous travaillerons avec des souris génétiquement modifiées pour produire plus du facteur synthétisé par les cellules endothéliales afin de prévenir l’action de la protéine le perturbant, et ainsi protéger les souris du vieillissement prématuré du poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de décrire le lien suspecté entre la diminution de l'action du facteur VEGF et le vieillissement des vaisseaux pulmonaires. Nous étudierons ce lien au cours du vieillissement et dans deux maladies, l'hypertension artérielle et l'emphysème pulmonaires. A l’issue de ce projet, nous souhaitons tester le sVEGFR1 comme un marqueur du vieillissement et de la sévérité de la maladie pulmonaire chez des patients atteints d’emphysème.
Procédures
Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. A l'issue de la procédure d'hypoxie, les animaux seront profondément anesthésiés pour la mesure de la pression au niveau du coeur droit. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) par injection dans la trachée sous anesthésie générale lors d'une intervention rapide (5 minutes). Une petite incision à partir de la base du cou est effectuée afin de visualiser la trachée, la souris est maintenue anesthésiée tout au long de l'injection. Une fois le traitement effectué, un point de suture à l’aide d’un fil résorbable sera réalisé. A la fin de la procédure d'injection d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil (Flexivent) durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectées grâce à une sonde. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (1 seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois), nécessaire à leur identification.
Impact sur les animaux
Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, instillation intratrachéale, Flexivent) peuvent générer un stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cages. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit alors également un stress. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (un seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois). Cette méthode d'identification peut causer une douleur légère de courte durée.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (quantification des marqueurs de sénescence, expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude sera portée sur des cellules issues d’échantillons pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. La culture de cellules endothéliales permet d’étudier et de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l’augmentation du VEGF sur des souris avec des maladies pulmonaires, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de ces maladies.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris porteuses d'hypertension pulmonaire. Aucune perte de poids supérieure à 10% n'est attendue.
Choix des espèces
Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour étudier l’effet de l'augmentation de cellules vieillissantes chez ces souris mutantes.
Etude des altérations de la signalisation calcique mitochondriale au cours de la progression de l’insuffisance cardiaque à fraction d‘éjection préservée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries d'un régime riche en gras et en sucre, complété pour certaines d'un traitement qui provoque une hypertension, des souris prennent rapidement du poids et développent un cœur plus gros qui se remplit mal. Au total, 162 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec jeûnes de six heures, prises de sang à la queue, test d'endurance sur tapis de course et, sous anesthésie, mesure de la pression dans le cœur par une sonde juste avant la mise à mort. Le porteur écrit vouloir "supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements", et indique que ces mêmes injections et prises de sang "peuvent entrainer un stress et une douleur". Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes.
Objectifs
Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. La mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque, a été montrée comme altérée dans cette maladie, notamment au niveau de la communication du signal calcium. Une structure appelée uniport est en charge de l’entrée du calcium dans la mitochondrie. L’uniport est un complexe composé de différents constituants protéiques. Une modification de la composition de l’uniport altère sa fonction, pour laisser entrer plus ou moins de calcium dans la mitochondrie. L’objectif de cette étude est de déterminer quelles sont les altérations de la composition et des interactions des différents constituants de l’uniport, son impact sur sa fonction et d’identifier des déterminants moléculaires pouvant l’expliquer (changement de composition lipidique…) au cours de l’évolution de la pathologie de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de préciser les modifications de la structure dans la mitochondrie en charge de la communication du signal calcium au cours de la progression de la maladie au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.
Procédures
Le protocole dure au total 16 semaines. Les souris seront mises sous régime standard, sous régime enrichie en lipides et en sucrose (développement d’un stade précoce de la dysfonction contractile) ou sous régime enrichie en lipides et en sucrose complémenté par un traitement hypertenseur (développement d’un stade avancé de la dysfonction contractile). Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 10 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue (durée prise de sang : quelques secondes). Un test d’endurance sera également effectué à 15 semaines sur tapis de course (durée du test : 2 min d’habituation sur 3 jours consécutifs et 20 min maximum de mesure le jour du test). Une échographie sera effectuée à 12 et 14 semaines sous anesthésie légère (durée examen :
Impact sur les animaux
Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité et n’empêchent pas la prise alimentaire et hydrique. L’ajout d’un traitement hypertenseur entraine une hypertension modérée qui aggrave la dysfonction cardiaque, sans entrainer de surmortalité, ni de dysfonctionnement alimentaire ou métabolique supplémentaire. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale. Le test sur tapis pourra entrainer un léger essoufflement. Lors des tests métaboliques, les injections et prises de sang peuvent entrainer un stress et une douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.
Remplacement
Le recours à l’animal vivant est nécessaire pour cette étude car pour obtenir un modèle de cardiomyopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, un régime riche en gras et en sucre doit être mis en place sur plusieurs mois et l’analyse du diabète et de la fonction cardiaque doit être réalisée sur un animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 162 animaux sur 3 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course et une stimulation par la voix et à l’aide d’un pinceau a été mise en place en remplacement des stimulations par flux d’air. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques ou 4h avant le sacrifice est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale). Pour la stabulation, les animaux sont placés à maximum 5 souris par cage et en respectant les groupes sociaux, dans un environnement enrichi (boules de coton, dôme) avec un change réalisé toutes les deux semaines quel que soit la diète utilisée.
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux auront 5-7 semaines lors de la mise en place du régime alimentaire pour 6 mois, menant à un âge de 21-23 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place du régime dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.
AVENANT Impact de la modulation β3-adrénergique sur la fonction vasculaire dans le choc septique expérimental
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Elles subissent une ligature et ponction caecale, chirurgie qualifiée de sévère qui provoque un choc septique, puis selon les séries une échocardiographie, la pose d'un cathéter carotidien, une injection de Bleu Evans ou une étude de survie sur cinq jours. Le porteur décrit une douleur traitée par buprénorphine et des séries écourtées à 18 heures pour limiter la souffrance, la série de survie étant suivie chaque jour avec mise à mort possible au point limite. Il affirme que le choc septique ne peut être modélisé in vitro et revendique un modèle proche des situations cliniques humaines, le plus utilisé dans la littérature.
Objectifs
La présente demande est un avenant au projet autorisé en cours. Le choc septique est défini comme la forme la plus sévère d’une infection caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Le choc septique est un problème majeur de santé publique, responsable de 15% des admissions et de 40% de mortalité en réanimation. Le choc septique est associé à une dysfonction du système cardiovasculaire et immunitaire. En effet, afin de combattre l’infection, l’organisme active une série de phénomènes au niveau vasculaire notamment pour permettre l’arrivée des globules blancs sur le site inflammatoire. L’activation excessive de ces mécanismes conduit entre autre à un phénomène d’hypotension (chute de la pression dans les vaisseaux) menant à un défaut d'apport en oxygène aux organes. La présence des récepteurs β3-adrénergiques (β3-ARs) au niveau vasculaire, dont la concentration croît durant une infection (inversement aux β1, β2-ARs), pourrait jouer un rôle dans l'hypotension. La vasodilatation excessive, responsable de l'hypotension, est contrée par l’organisme grâce à une modulation de la vitesse et de la force de contraction du cœur. L'utilisation de ligands β-adrénergiques, des β1-bloquants, permet ainsi de moduler la fonction cardiovasculaire dérégulée pendant l’état de choc septique via le système nerveux. En effet, il a été prouvé que l’administration de β1-bloquants lors du choc septique améliorait expérimentalement la réactivité vasculaire à un vasoconstricteur de vaisseaux de gros et petits calibres. Parallèlement, la quantité de sang éjectée par le cœur, était améliorée alors que les animaux présentaient la même fonction cardiaque et le même volume de fluide perfusé témoignant peut-être d’une moindre fuite liquidienne au niveau vasculaire induite par le choc septique. Les β1-ARs étant très peu présents dans les vaisseaux, notre hypothèse est que, durant le choc septique, la modulation des β3-ARs au niveau vasculaire modifie la vasoréactivité. L'hypothèse de ce travail est qu'en agissant sur les β3-ARs, les fonctions vasculaires et cardiaques des patients septiques pourraient être améliorées.
Bénéfices attendus
En mettant en évidence un effet de la modulation des β3-ARs sur la perte de la vasoréactivité dans le choc septique, il est attendu un bénéfice sur la prise en charge clinique du choc septique. En effet, un traitement modulant les β3-ARs pourrait améliorer la chute de la contraction vasculaire et diminuer la vasodilatation excessive conduisant à l’hypotension lors du choc septique.
Procédures
Les animaux (n=354) seront soumis à une procédure chirurgicale pendant 15 minutes, la ligature et ponction caecale, de type sévère conduisant à un état de choc septique. C’est 18 heures après cette intervention que les analyses in vivo et ex vivo (procédure 2) débuteront pour les animaux de la première série (n=178). Les animaux de la première série seront soumis à une évaluation hémodynamique par échocardiographie pendant 15 minutes et par l'implantation d'un cathéter carotidien pour une durée d'environ 15 minutes sous anesthésie. La mise à mort des animaux sera effectuée à la fin de la procédure de cathétérisme carotidien et permettra le prélèvement des organes et du sang permettant les analyses ex vivo (myographie, rapport poids humide/sec pulmonaire) et biochimiques. Les animaux de la deuxième série (n=110) traités pendant 24 heures seront soumis à une étude de survie sur 5 jours. Les animaux de la troisième série (n=66) recevront une injection de Bleu Evans (procédure de 10 minutes) dix-huit heures après la chirurgie CLP pendant une heure avant d'être mis à mort.
Impact sur les animaux
La ligature et ponction caecale, notre modèle, est une procédure chirurgicale sévère qui induit un choc septique chez l'animal. Cette procédure va induire une douleur chez l'animal qui sera traitée grâce à l'administration d'un analgésique, la buprénorphine à la posologie de 0,2mg/kg une heure avant la chirurgie, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois/jour. Le stress et la douleur engendrés chez les animaux de la première et troisième séries sont limités dans le temps avec des analyses in vivo et des prélèvements suite à la mise à mort 18h après la chirurgie. Une observation de l'état général des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour et dans le cas où un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être décidée.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux (n=354) seront mis à mort à la suite des procédures pour réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Tout d'abord, ce modèle est choisi par rapport à sa proximité avec les situations cliniques humaines. En effet, on ne peut pas modéliser le choc septique avec d’autres types de modèles, par exemple in vitro, puisqu’on étudie plusieurs fonctions biologiques et leurs interactions : fonction cardiaque, fonction vasculaire, et le métabolisme. De plus, il n’existe pour l’heure nulle autre expérimentation que le modèle animal afin de remplacer l’utilisation des souris pour les procédures expérimentales prévues dans ce projet (ligature et ponction caecale, échocardiographie, cathéter carotidien, perméabilité vasculaire). Enfin, ce modèle est le plus utilisé dans la littérature (modèle de choc septique multi-microbiens) et il est maîtrisé par le laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les mâles et les femelles seront utilisés. Dix animaux par groupe (séries 1 et 2) et six animaux par groupe (série 3) sont nécessaires afin de ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris sont hébergées à 5 maximum par cage individuellement ventilées de 500 cm². Elles auront de l'eau et de la nourriture à volonté. L’enrichissement du milieu se fera avec des petits abris, des tunnels, du sizzle pad ou des bâtons à ronger. Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus rapide conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Plusieurs types de mesures seront effectués sur un même animal en traitant la douleur induite par injection sous-cutanée d’analgésique (buprénorphine) une heure avant, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois par jour. Les chirurgies se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Enfin, la durée de l’étude est courte (18 heures) pour la première et troisième séries d'animaux en post-opératoire afin de limiter les souffrances. Une observation des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour, et dans le cas où un point limite est atteint la mise à mort pourra être décidée.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est une espèce fréquemment retrouvée dans la littérature sur le choc septique. Nos résultats seront ainsi plus facilement comparables avec la littérature. Le modèle animal dont nous avons accès est un modèle de souris rare KO pour le β1-AR, ce qui est un avantage pour les expérimentations puisque les animaux sont déjà connus des expérimentateurs. Les évaluations hémodynamiques, vasculaires et inflammatoires de ces souris KO pour le β1-AR subissant la CLP ou non permettront de mettre en évidence des effets modulatoires des β3-ARs en l’absence du β1-AR. Des souris de 20g-30g seront utilisées pour comparer avec les autres résultats dans la littérature, qui utilisent cette gamme de poids. Ces souris auront entre 12 et 16 semaines et les mâles et les femelles seront utilisés.