Système cardiaque

108 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Stormorken et subissent des sections répétées du bout de la queue pour mesurer le temps de saignement, ainsi que des prélèvements sanguins à la veine cave, pour comprendre le phénotype hémorragique de la maladie. Le porteur précise que la lignée développe un déficit musculaire et hématologique mortel vers 32 semaines, mais fixe les procédures avant 20 semaines. Il qualifie le modèle murin d'"irremplaçable" au motif que l'hémostase ne serait pas modélisable in vitro.

Objectifs

Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent être dus à des défauts de production et de fonctions plaquettaire. La mutation gain de fonction de la protéine STIM1 R304W/+est associée à une anomalie de l'homeostasie calcique intra-cellulaire dont les conséquences sont une modification de la production et de la fonctionalité des plaquettes. Notre étude vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires permettant de comprendre le phénotype hémorragique dû à cette mutation de STIM1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'un point de vue fondamental de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires du role de STIM1 dans la production et la fonction plaquettaire. D'un point de vue clinique, ce projet permettra de comprendre l'évolution de la maladie hémorragique chez l'homme.

Procédures

Une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. La souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Une injection d’un composé inoffensif et non-irritant est réalisée en intra-veineux pendant 10 secondes sur souris anesthésiée par anesthésie gazeuse. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en intra-péritonéal avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Le modèle murin génétiquement modifié STIM1 R304W/+ qui mime la pathologie humaine présente un déficit musculaire et hématologique qui entraine la mort à partir de 32 semaines de vie. Cependant toutes les procédures expérimentales seront réalisées avant 20 semaines. Pour les procédures expérimentales sur animaux vivants, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères (anesthésiques, anti-douleurs et anticorps). Les produits injectés ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le nôtre, et n'ont montré aucun effet indésirable. Ces injections n'induisent qu'une légère douleur au moment de la piqûre et un stress qui ne durent que 5 à 10 secondes.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris pour chaque procédure réalisée. Nous nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent, seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris par procédure. L'approche statistique permettra d'analyser les différences obtenues entre groupes.

Raffinement

Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens ou les responsables du projet en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les personnes impliquées dans ce projet (zootechniciens et les responsables de projet) sont formées et qualifiées au respect des conditions du bien-etre animal et diplômées en expérimentation animale. Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées sauf pour les injections intrapéritonéales qui sont des gestes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyée 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée conformément à une grille de score définie.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiés invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 20 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.

394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour rechercher l'existence de cellules productrices de sang dans l'aorte adulte. Une partie est irradiée, ce qui provoque une aplasie médullaire et une immunosuppression, puis greffée avec de la moelle et soumise à des injections répétées, les animaux dont le greffon échoue étant tués par dislocation cervicale. Lorsque la maladie du sang apparaît vers six mois, le porteur prévoit un prélèvement sanguin maximal auquel les souris ne peuvent survivre, suivi de la mise à mort. Il indique que des essais in vitro sur cellules humaines n'ont pas reproduit le phénomène et affirme que "seules des expériences chez l'animal" le permettront.

Objectifs

A l'âge adulte, les cellules sanguines sont produites dans la moelle osseuse, au cours du processus appelé « hématopoièse ». Les cellules souches hématopoïétiques sont donc un réservoir de cellules sanguines et pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment. Il est actuellement établi que les cellules souches hématopoïétiques présentes à l'âge adulte ont été produites très tôt, pendant un laps de temps très court, au cours de la vie embryonnaire ; de façon étonnante, les cellules qui produisent les cellule souches hématopoïétiques sont des cellules de la paroi de l'aorte, appelées cellules endothéliales "hémogéniques". Il semble que ces cellules endothéliales hémogéniques n’existent pas uniquement chez le jeune embryon mais aussi chez le jeune animal. Cependant, à l'heure actuelle, aucune équipe n'a rapporté l'existence de telles cellules à l'âge adulte. Ces dernières années, notre équipe a étudié le rôle des cellules endothéliales adultes dans la formation de caillots sanguins. Nous nous sommes notamment intéressés aux cellules endothéliales mutées pour la protéine d'intéret. Cette protéïne activatrice de la mutation est très fréquemment retrouvée dans des maladies hématologiques, les néoplasies myéloprolifératives; nous avons créé deux modèles de souris au sein desquels, théoriquement, uniquement les cellules endothéliales adultes portent la mutation. Nous avons eu la surprise d'observer que certaines de ces souris développaient une maladie du sang, avec des cellules souches hématopoïétiques avec la présence de cette protéïne. Ces résultats suggèrent donc qu'il existerait, dans ces modèles murins, des cellules endothéliales hémogéniques. Notre projet de recherche vise à démontrer formellement l’existence de cellules endothéliales hémogéniques dans ces souris adultes. Si nous confirmons la présence de cellules endothéliales hémogéniques avec cette protéïne dans ces souris, nous chercherons à les isoler et les caractériser (marqueurs, profil d'expression génique).

Bénéfices attendus

La recherche sur les cellules souches hématopoïétiques est très active car non seulement elle est utile pour mieux comprendre (et traiter) des maladies hématologiques comme les leucémies, mais elle est aussi très utile pour envisager la production de cellules sanguines matures, qui pourraient servir pour des transfusions et ainsi s’affranchir des besoins réguliers en dons du sang (avec les risques inhérents aux transfusions sanguines). Mieux comprendre d’où viennent les cellules souches hématopoïétiques est donc un enjeu scientifique majeur, comme en attestent les fréquentes publications dans des journaux renommés. De nombreux efforts ont été faits ces dernières années pour tenter d’amplifier les cellules souches, sans qu’elles ne se différencient (car une fois qu’elles se différencient, elles perdent leur capacité à produire toutes les lignées sanguines et ne s’auto-renouvellent plus). L’avènement des IPS (Induced Pluripotent Stem cell) a susicté des espoirs pour arriver à reprogrammer des cellules matures en IPS et les faire ensuite se différencier en cellules souches hématopoïétiques. Mais malgré des efforts colossaux, aucun laboratoire n’a réussi à obtenir, à partir des IPS, de réelles cellules souches hématopoïétiques. Il n’y a donc à l’heure actuelle, aucune stratégie disponible pour produire de nouvelles cellules souches hématopoïétiques adultes. Ici, nous avons pour objectif de mettre en évidence des cellules endothéliales adultes, capables de fabriquer de nouvelles cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques étant un réservoir de cellules sanguines, pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment.

Procédures

Lot 1 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 40 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 2 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 6 donneuses avec administration par gavage en une seule dose (durée de l'intervention 20s par souris), plus 80 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 20s par souris). Lot 3 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 4 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 5 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 6 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 7 : 20 souris receveuses avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 8 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 9 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 10 : 10 souris avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris).

Impact sur les animaux

L’aplasie médullaire et l’immunosuppression induites par l’irradiation constituent des effets dommageables sur l’animal. Nous resterons donc très vigilent les jours qui suivent l'irradaition. 24h après, les souris receveuses recevront en IV des cellules de moelle de souris donneuses. Pour les souris dont le greffon prendra bien, nous observerons dans la première semaine une perte de poids ne dépassant pas les 10%. Dans la deuxième semaine ces souris retrouveront un poids normal puis poursuivront leurs croissances pour le restant de l’étude. Pour les souris dont le greffon ne prendra pas, nous observerons une perte de poids d’environ 10% dans la première semaine qui se poursuivra dans la deuxième. Ces animaux seront alors mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Lorsque que la maladie hématologique apparaitra vers 6 mois, un maximum de sang sera prélevé sur les animaux pour analyses. Les animaux ne pouvant survivre à un tel prélèvement, ils seront ensuite tous mis à mort.

Remplacement

Nous avons réalisé des études in vitro, à partir de cellules endothéliales humaines (HUVEC) exprimant la mutation. Nous n’avons pas observé de phénotype hémogénique dans ces cellules, ni d’expression de facteurs de transcription laissant penser qu’elles devenaient hémogéniques. Ces résultats ne sont pas surprenants car il était peu probable que Ia seule présence que la mutation dans n’importe quelle cellule endothéliale la rende hémogénique. Les HUVEC sont des cellules endothéliales provenant de cordon ombilical et donc pourtant assez jeunes et les plus « proches » possibles des cellules endothéliales embryonnaires. Il est probable que ce phénotype hémogénique ne soit conféré qu’à de très rares cellules endothéliales. Seules des experiences chez l’animal, permettant, l’expression de la mutation dans toutes les cellules endothéliales, nous permettra de voir quelle sous population de cellules endothéliales portant cette mutation est devenue hémogénique.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux nécessaire à cette étude a été calculé à 394. 20 animaux dans chaque groupe expérimental et par expérience seront utilisés afin d'obtenir un résultat statistique cohérent. Les analyses statistiques des résultats seront réalisées avec le test adéquats. Ce nombre peut paraitre elevé, mais est necessaire compte tenu du fait que nous cherchons à greffer des cellules souches qui sont très rares dans les moelles qui servent de greffon. Ainsi, si nous voulons avoir des résultats scientifiquement valides, reproductibles et qui nous permettent d’estimer une fréquence de cellules souches, nous avons besoin de 20 animaux par lot.

Raffinement

L'hébergement des animaux permet de reduire le stress et l'inconfort : animalerie agrée, personnels formés, cages de 6 animaux maximum en portoirs ventilés avec libre accès à l'eau et la nourriture ainsi qu'un environnement enrichi avec igloo cortonné de carré de cellulose. Les animaux recevront systématiquement un antalgique 30 min avant l'anesthésie lors des administrations intraveineuse et des prélèvements sanguins et seront placé sur un tapis chauffant. Les anesthésies seront réalisées à l'aide d'un poste automatisé distrubuant un gaz anestésiant. Les animaux seront tout d'abord placés dans la boite pour induire l'anesthésie jusqu'à un endormissement profond puis seront transférés sous masque individuel pour réaliser administrations et prélèvements. Pour éviter les risques d'infection suite à l'irradiation, des précautions seront mise en place. Tout d'abord, nous transporterons (3 minutes) la boite d'irradiation avec les souris dans un sac isotherme décontaminé. De retour au laboratoire, elles seront transférées dans leurs cages d’hébergements pour portoirs ventilés qui auront été préalablement stérilisées par autoclavage avec litière et enrichissement. Les biberons et l’eau de boisson seront également stérilisés par autoclavage. Nous distribuerons à ces souris un aliment stérilisé par le fournisseur. Ces transferts seront réalisés sous une hotte perméttant de maintenir la stérilité de l’environnement des souris. Notre animalerie est de statut conventionnel, une attention toute particulaire sera apportée à ces cages. Durant la première semaine après la greffe une visite quotidienne sera nécessaire pour évaluer le bien-être des animaux à l'aide d'une grille d'Observations/Actions qui nous permettra d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. Nous disposons dans notre laboratoire de différentes lignées de souris transgéniques mutées au niveau d'une ou plusieurs lignées de cellules hématopoïétiques. C'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire et sanguin à de forte ressemblance avec l'homme. Pour toutes ces manip, les souris auront entre 16 et 18 semaines, qui est l'âge de l'apparition de la maladie. Les C57Bl6 seront entre 10 et 12 semaines, âge adulte de la souris où la formule sanguine et les composants du sang sont bien équilibrés et stables.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois de régime gras destiné à induire un surpoids, elles subissent un test d'intolérance au glucose par injection, puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt-et-un jours. Le porteur indique attendre une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une perte de poids et une déshydratation. L'objectif est de comprendre le rôle des comorbidités liées à l'âge dans l'AVC, le porteur justifiant le recours à l'animal par des mécanismes qui "ne peuvent s'envisager que dans un organisme entier".

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.

Objectifs

Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une dizaine d'injections et jusqu'à dix-huit prélèvements de sang, pour tester si la neutralisation d'une protéine circulante limite les effets du syndrome de Cushing. Le porteur décrit des nuisances "très limitées" et un inconfort "léger", tout en indiquant que les glucocorticoïdes peuvent induire obésité, résistance à l'insuline et ostéoporose. Il affirme que l'appétit et le comportement alimentaire ne sont pas modélisables in vitro et conclut au caractère "indispensable" de l'animal vivant.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. L’augmentation de cette protéine accroît la prise alimentaire, réduit la glycémie, et encourage la lipogenèse à tous les niveaux. La neutralisation de cette protéine apparaît donc comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’obésité. Or, l'exposition chronique à des niveaux excessifs de glucocorticoïdes entraine un syndrome de Cushing qui est caractérisé par le développement de l'obésité, une résistance à l'insuline, une perturbation des taux de graisses dans le sang, une faiblesse musculaire, une fragilité des os et des accidents vasculaires. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la neutralisation de cette protéine circulante peut empêcher/réduire les effets secondaires indésirables du Syndrome de Cushing.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique afin de limiter ou d’éradiquer le syndrome de Cushing (effets indésirables associés à une exposition importante aux glucocorticoïdes).

Procédures

Pour certains animaux 12 injections sous anesthésie locale par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux: 10 injections par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux, 11 injections par souris (durée quelques secondes), 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute). Pour tous, 1 prélèvement de sang unique sous mandibulaire (100µL, 1 minute), à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Les injections sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort léger, local et transitoire. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les glucocorticoïdes peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie et l'ostéoporose.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible de modéliser, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de détecter toute modification.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections et des prélèvements de sang répétés, une partie subissant un test de saignement par section des trois derniers millimètres de la queue avant la mise à mort. Ces souris génétiquement modifiées expriment très peu du facteur étudié pour reproduire la maladie de Willebrand, le porteur cherchant à raccourcir la protéine pour une thérapie génique. Il affirme qu'il est "indispensable de faire appel à un organisme vivant entier".

Objectifs

La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines et l'absence de l'une ou l'autre de ces protéines va conduire à des pathologies hémorragiques congénitales. La plus fréquente de ces pathologies est causée par l'absence d'une protéine circulant dans le sang et qu'on pourrait tout à fait envisager de remplacer par une approche de thérapie génique. Le problème principal est que la séquence d'ADN qui permet de produire cette protéine est trop grande pour rentrer dans les vecteurs biologiques actuellement disponibles pour aller livrer la protéine au site cellulaire désiré. Le but de notre projet va donc consister à tester s'il est possible de retirer ou remplacer des parties de notre protéine d'intérêt tout en préservant sa fonction normale. Cette approche permettrait ainsi de faire rentrer l'ADN de cette protéine dans un vecteur standard et donc de pouvoir enfin proposer une approche de thérapie génique aux patients.

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur le facteur Willebrand en déterminant quelles régions/domaines de cette protéine sont les plus importantes pour sa fonction. A long terme, le projet contribuera à rendre la thérapie génique possible pour les patients souffrant de la pathologie hémorragique congénitale la plus fréquente.

Procédures

Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée de la procédure: 1) 1 injection qui dure 5 secondes 2) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. En cas de plusieurs prélèvements ceux-ci seront espacés de 2 mois et leur nombre maximum sera de 4. Ces prélèvements durent entre 5 et 10 secondes. 3) 1 injection finale qui va durer 5 secondes pour anesthésier les animaux. Les deux gestes suivants seront réalisés sur ces souris anesthésiées: 4) Soit un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires ou un test de saignement consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une douleur transitoire de courte durée pendant et après l’injection intra-veineuse et après le prélèvement sanguin.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. La ré-utilisation des animaux n'est pas possible du fait de la procédure subie dans le présent projet .

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Il est donc indispensable de faire appel à un organisme vivant entier.

Réduction

Nous avons séparé le projet en deux procédures successives afin de pouvoir identifier rapidement les protéines les plus efficaces et donc n'en tester que quelques-unes (ou même pas du tout) dans une la seconde procédure bien plus longue. D'autre part, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. Les souris seront surveillées 3 fois/semaine pendant la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne sont pas en souffrance (visible par leur aspect et comportement). Des point limite précoces ont été anticipés et mis en place et seront appliqué en cas de signes évidents de douleurs importantes. Si ces points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui a prouvé sa pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui expriment seulement une quantité très faible de la protéine étudiée et chez lesquels il sera donc aisé de voir une augmentation de cette protéine après traitement. Pour une des procédures nous utiliserons des animaux adultes des deux sexes. Par contre, pour l'autre procédure, nous serons limités à des animaux adultes de sexe mâle exclusivement car chez les rongeurs, la thérapie génique est 5-10 fois moins efficace chez les femelles. Des souris adultes (8 - 16 semaines) seront utilisées.

352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un diabète de type 2 d'origine génétique, reçoivent un médicament hypoglycémiant par gavage ou injection et passent des échographies cardiaques sous anesthésie, avant une injection létale pour prélever le cœur. Le porteur indique que les gavages, injections et prélèvements provoquent douleur et stress, aggravés par la pathologie diabétique. Il teste une molécule censée protéger le cœur diabétique lors d'un infarctus et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible.

Objectifs

Nous avons récemment développé une molécule inhibant la mort cellulaire et protègeant le coeur au cours de l’attaque cardiaque (infarctus). Les expériences, pour faire cette preuve d’efficacité, ont été réalisées chez des souris saines. Cependant, parmi les patients qui font un infarctus, un grand nombre ont un diabète de type 2 qui est un facteur d’aggravation de l’infarctus augmentant leur risque de décès. De plus, en clinique humaine, les patients diabétiques de type 2 sont traités par un médicament diminuant le taux de glucose sanguin (traitement hypoglycémiant). Notre projet vise donc à explorer l’effet thérapeutique de notre molécule dans le cœur de souris diabétiques de type 2 ayant subi un infarctus et traitées par le médicament hypoglycémiant afin de mimer la situation clinique.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucune thérapie pharmacologique disponible pour protéger le cœur des patients diabétiques ayant un infarctus. Développer une molécule permettant de protéger le cœur diabétique est donc un enjeu majeur surtout en considérant l’épidémie de diabète qui sévit dans le monde actuellement. Ce type de traitement permettra de diminuer le risque de décès mais également de faire des économies sur les dépenses de santé publique. Nos résultats devraient également apporter une meilleure connaissance des aspects de la cardiopathie liée au diabète, en particulier les mécanismes de mort cellulaire.

Procédures

Un lot recevra le médicament hypoglycémiant par gavage (durée : 2 minutes; une fois /jour pendant 15 jours) et les souris seront pesées 4 fois. Le 2ème lot recevra 1 injection du médicament hypoglycémiant dans le péritoine (durée: 1 minute; une seule fois) et les souris seront pesées 3 fois. Les souris diabétiques ont un fonctionnement du coeur modifié sur le long terme. Cette pathologie sera évaluée par échographie sur animal anesthésié (durée: 35 min; une fois avant le gavage avec le médicament hypoglycémiant et une fois au jour 11 du traitement). Les animaux sont euthanasiés par une injection d’un composé létal dans la cavité abdominale pour prélever le cœur.

Impact sur les animaux

- douleurs et stress des gavages et injection intrapéritonéale (IP) - douleurs et stress des prélèvements sanguins - stress de l’anesthésie pour l’échographie - pathologie du diabète

Devenir

Euthanasie pour prélever le coeur qui sera analysé (coeur perfusé isolé).

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. La cardioprotection par notre molécule se mesure sur cœur entier ex vivo¸ résultant à la fois d’effets vasculaires et musculaires après un traitement au long cours avec un hypoglycémiant (Metformine) pour mimer au mieux la situation in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : poids, mesure du taux de glucose sanguin (glycémie), échographie, analyse de la taille d’infarctus et de la mort cellulaire. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (prévision réalisée grâce à un logiciel statistique).

Raffinement

Les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient les moins invasifs possibles, gavage et injection unique du médicament hypoglycémiant, échographie, puis une seule injection létale pour prélever le coeur et réaliser une expérience ex vivo (infarctus sur cœur isolé). Des points limites, une grille de score ont été établis afin de prendre en charge les nuisances. De plus, l'utilisation d'anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures modérées. Raffinement des conditions d’hébergement : Les souris seront hébergées par 3 dans une cage et la litière sera changée fréquemment car ses souris urinent beaucoup. De plus le milieu des cages sera enrichi (maisons en carton) afin de réduire au minimum les nuisances (stress) et favoriser le bien-être des animaux. Concernant le modèle diabétique, il s'agit d'un diabète génétique spontané dans une lignée mutante à la place d'une souris alimentée durant une longue période avec une nourriture riche en graisse et riche en sucre pour induire le diabète.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus a été choisie pour utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées reconnu internationalement comme modèle de diabète de type 2. Ce sont des souris déficientes pour le récepteur à la Leptine (hormone de la satiété). Ces souris développeront spontanément un diabète de type 2 par augmentation de la prise alimentaire (hyperphagie) présentant l'avantage de ne pas leur faire subir un régime riche en gras et en sucre sur plusieurs semaines. -Petite taille des animaux. -Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. -l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes similaires donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera appliquée en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à 9 semaines et 10 semaines selon les protocoles appliqués.