Système cardiaque

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue, puis subissent un prélèvement de sang, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue et à mesurer le sang perdu pendant 30 minutes, ou une provocation de thrombose dans l'artère carotide, la journée finale se déroulant sous anesthésie sans réveil. Le porteur étudie l'effet de deux mutations d'une protéine de la coagulation sur le risque de thrombose. Il affirme que la coagulation 'nécessite absolument un organisme vivant entier' et qu'il n'existe pas de test adapté évitant le recours à l'animal.

Objectifs

La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Il s'agit donc d'un processus vital mais qui malheureusement peut aussi avoir des conséquences négatives lorsqu'il se produit en absence de toute blessure puisque dans ce cas, il aboutit à l'obstruction d'un vaisseau sanguin, ce qu'on appelle une thrombose. Les protéines qui sont importantes pour la coagulation "normale" sont également potentiellement impliquées dans les phénomènes de thrombose. Nous étudions l'une de ces protéines et en particulier comment des altérations génétiques sur cette protéine peuvent favoriser la survenue de thromboses. Le but du projet va consister à prouver dans un modèle souris que des mutations sur cette protéine d'intérêt conduisent à une protéine anormale, qui va avoir tendance à provoquer des thromboses

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur une des protéines importantes pour la coagulation en montrant que certaines mutations génétiques entraînent la formation d'une protéine hyper active et par conséquent davantage pro-thrombotique. A long terme, le projet contribuera à identifier un nouveau biomarqueur familial de risque thrombotique. Des stratégies thérapeutiques visant à cibler cette protéine pourraient en découler afin de diminuer le risque de développer un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Le premier jour, les souris recevront une injection dans la veine de la queue pour qu'elles puissent produire les protéines portant les mutations désirées. L'injection dure une dizaine de secondes au maximum. Trois jours plus tard, un prélèvement sanguin de petit volume sera effectué sur les souris anesthésiées, ce prélèvement ayant une durée de 3 secondes. Puis le lendemain, les souris seront de nouveau anesthésiées par injection dans la cavité abdominale (geste de 2 secondes). Un groupe de souris anesthésiées sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes. Pour le second groupe de souris anesthésiées, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans l'artère de la carotide, pendant une durée de 30 min au maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse et après le prélèvement sanguin. La journée finale de la procédure se fait entièrement sous anesthésie et sera sans réveil.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car la procédure finale n'est pas compatible avec un réveil et une reprise d'activité.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.

Réduction

Ce projet a déjà bénéficié d'une stratégie de réduction puisque seul l'effet de deux mutations sera étudié chez l'animal alors qu'une vingtaine de mutations potentielles ont été identifiées. Une analyse informatique de modélisation a permis de sélectionner ces deux mutations, basée sur leur plus grand potentiel pro-thrombotique. D'autre part, une analyse mathématique a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne sont pas en souffrance (visibles par leur aspect et comportement). Des points limite précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui a prouvé sa pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui ont l'avantage de ne pas exprimer la protéine étudiée et donc chez lesquels il est aisé de pouvoir tester des mutants sans être gênés par la protéine naturelle non mutée. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible d'expérimenter des évènements de thrombose.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

Une chirurgie du thorax de trois heures pour implanter des sondes de mesure et un câble de stimulation cardiaque, puis, deux mois plus tard, deux interventions par voie percutanée à trois jours d'intervalle, la seconde s'achevant par la mise à mort : 80 porcs vont être utilisés, tous tués pour l'étude de leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une période de repos, une insuffisance cardiaque leur est provoquée par une pression artérielle et une stimulation cardiaque élevées, et certains devraient mal la supporter selon le porteur, avec baisse d'activité, perte d'appétit et poids qui stagne ou baisse en fin de protocole. Une thérapie cellulaire censée régénérer le cœur est le premier traitement testé. Le texte ne dit ni comment la pression est élevée, ni combien de temps dure la stimulation, ni par quelle voie la thérapie est administrée, et qualifie d'"indolores" tous les autres actes.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent d’autres symptômes plus invalidants tels toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs). Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison du prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité chez les personnes âgées, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque (à fonction systolique conservée) avec un modèle de porc à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et aux analyses de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.

41 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs yeux, afin d'étudier le rôle du micro-ARN mir155 dans la formation des vaisseaux de la rétine. Le bénéfice avancé reste conditionnel, un futur médicament qui préserverait l'intégrité des vaisseaux si le mir155 les déstabilise. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'angiogenèse de la rétine et qu'aucune culture 3D n'est envisageable.

Objectifs

L'angiogenèse est un processus biologique qui consiste en la formation de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus est conduit par les cellules endothéliales. Il est fondamental pour la cicatrisation des tissus et le développement embryonnaire. Cependant, l’angiogenèse aggrave de nombreuses maladies telles que le cancer et les pathologies inflammatoires chroniques. Une dérégulation de ce processus est responsable des rétinopathies. Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures. L’accessibilité du réseau vasculaire à la surface de la rétine permet une quantification précise de différents paramètres comme la fraction de tissu vascularisé, la densité de vaisseaux et le niveau de ramification du réseau vasculaire, et cela sur l’intégralité de la surface de la rétine. Il existe déjà des protocoles standardisés pour la quantification de ces paramètres dans ce modèle. Ceci est réalisable en injectant d’une part, un inhibiteur (anti-miR-155 ou antagoMir) pour évaluer sa capacité à bloquer le processus, et d’autre part en injectant un activateur (miR-155 mimic) pour stimuler le processus. L’analyse des paramètres d’angiogenèse sera effectuée par microscopie confocale après immunofluorescence réalisée sur les rétines entières, à l’aide d’un protocole déjà établi.

Bénéfices attendus

Si le Mir155 déstabilise les vaisseaux sanguins matures, il sera possible d'utiliser un medicament qui l'inhibera pour que les vaisseaux restent intacts (intégrité vasculaire préservée)

Procédures

Nous souhaitons dans un premier temps, administrer localement (injections intraoculaires sous anesthesie générale par inhalation d'isofluorane ) deux doses différentes de ces molécules couplées à un fluorochrome afin d’évaluer la quantité de molécules que nous retrouverons dans les cellules endothéliales de la rétine. Dans un deuxième temps, nous administrerons ces deux molécules non marquées, à la concentration la plus efficace (d’un point de vue de la demi-vie et du ciblage des cellules endothéliales) , afin de déterminer leurs effets sur l’angiogenèse (ce qui nous permettra ensuite de réduire le nombre d’animaux). L'intervention dure 20 min. Le prélèvement de la rétine ne peut se faire sans éviter l'euthanasie de l’animal .

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir de la procédure d’injection intraoculaire. Il n’y pas d’inconfort ou d’effets indésirables connus causés par cette procédure comme déjà décrit dans la bibliographie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale . Il est impossible d'étudier l'angiogenese de la rétine sans euthanasier l'animal puisque nous devons prélever les yeux pour l'extraire.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier la croissance et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). La mise au point de certains paramètres (dose-réponse, toxicité, demi-vie du composé à injecter…) de l’expérience peut être réalisée sur cellules endothéliales d’origine commerciale mais il est impossible de « mimer » l’angiogenèse de la rétine et d’étudier son intégrité en culture 2D. Aucun protocole de culture 3D n’est envisageable.

Réduction

Basé sur notre expérience du modèle, nous devons prendre en compte que les étapes d’injection et dissection peuvent induire la perte de 10% des échantillons (1 œil) et que le traitement pourrait échouer sur 10% des animaux (1 œil). Par conséquent, nous avons pu réduire le nombre d’animaux à 5 animaux par sous-condition pour que l’analyse soit statistique ceci pour chacun des 3 groupes expérimentaux. D’autre part, l’avantage d’étudier l’œil est que chaque animal constitue son propre contrôle car nous étudierons aussi l’œil non injecté (contralateral) qui constituera un contrôle interne permettant d’évaluer les effets du composé injecté (animaux traités au miR ou antimiR) et également les effets de la procédure d’injection en elle-même (animaux injectés avec la version contrôle du miR ). Ceci permet de réduire le nombre d’animaux en évitant de sacrifier une autre série d’animaux juste pour collecter des yeux sains.

Raffinement

Les souris adultes sont hébergées en groupe sociaux, la plupart du temps entre frères ou entre sœurs dans un environnement approprié (litière, boisson et alimentation, dôme) L’élevage est supervisé par le personnel compètent de l’animalerie conventionnelle Pour limiter une éventuelle douleur liée à l’injection, un anesthésique local en gel ophtalmique sera appliqué sur la paupière avant et après l’injection. De plus, nous délivrerons un anti-inflammatoire non steroidien qui permettra une couverture de la douleur sur 24h, soit jusqu'à l'euthanasie des animaux Nous veillerons à ce que la phase de réveil se fasse dans les meilleurs conditions (surveillance accrue, température de la cage...). Nous veillerons à ce que les animaux s’alimentent et s’hydratent normalement. Nous surveillerons leur comportement et l’apparition d’éventuelles blessures.

Choix des espèces

En se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait que le modèle de rétine postnatale de souris C57Bl6J est le plus approprié pour l’étude de l’angiogenèse in vivo. Ce modèle présente l’avantage d’être peu invasif . Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures.