Système cardiaque
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Evaluation de l’efficacité d’une stratégie de compression de la circulation périphérique sur l’efficacité du massage cardiaque dans un modèle de réanimation cardiopulmonaire chez le porc.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
16 porcs vont être utilisés, maintenus sous anesthésie profonde et tués sans réveil. Chaque animal subit la pose de cathéters puis un arrêt cardiaque provoqué, suivi d'un massage cardiaque et de l'essai d'une compression des membres associée à un mélange gazeux, pour comparer cette approche à la réanimation standard. Le porteur indique que des échecs de réanimation, c'est-à-dire l'absence de reprise d'activité cardiaque, sont attendus dans ce modèle. Il conclut à l'"absence de Remplacement possible" au motif que l'arrêt cardiaque met en jeu plusieurs organes à la fois.
Objectifs
L'insuffisance hémodynamique aiguë est fréquente chez les patients réanimés après un arrêt cardiaque extra-hospitalier. Le faible débit sanguin dû au massage cardiaque et l'instabilité hémodynamique survenant après la réanimation cardiopulmonaire (RCP) aggrave les séquelles neurologiques par diminution du débit sanguin cérébral et également par l’hypocapnie et l'hyperoxémie en cas d'hyperventilation. Dans ce contexte, nous proposons d'évaluer les effets bénéfiques potentiels d'un traitement s’appuyant sur la constriction des vaisseaux périphériques par compression des membres, susceptible d’améliorer le flux sanguin dans les organes vitaux, associé à une ventilation avec un mélange gazeux protecteurs contenant 65% Argon, 5% CO2 et 30% O2. L’objectif de ce mélange gazeux est d’apporter un gaz neuroprotecteur (Argon) et de limiter les conséquences potentielles d’une hyperventilation. La prévention de l’hypocapnie et de l’hyperoxie devrait accroitre l’effet bénéfique de la redistribution sanguine permise par la compression des membres. L'objectif de la présente étude est de comparer l'effet de cette thérapie combinée par rapport à la réanimation cardio-pulmonaire standard dans un modèle porcin d'arrêt cardiaque.
Bénéfices attendus
L’occlusion des membres pendant le massage cardiaque est susceptible d’améliorer le flux sanguin dans les organes vitaux, notamment le cœur et le cerveau. Le bénéfice attendu est donc l’augmentation de la perfusion de ces organes qui devrait se traduire par une augmentation de l’efficacité de la réanimation et une réduction des séquelles neurologiques. Pour potentialiser cet effet hémodynamique, nous proposons d’administrerun mélange gazeux contenant de l'Argon, du CO2 et de l'O2, qui possèdent des propriétés anti-ischémiques et devrait prévenir l’effet d’une hypocapnie et d’une hyperoxémie dont les effets délétères sont connus.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés profondément puis soumis à une instrumentation par plusieurs cathéters. A l’état anesthésié, un arrêt cardiaque sera induit et les animaux seront soumis à un massage cardiaque afin d’en évaluer la performance. Pendant le massage cardiaque, ils seront soumis à une procédure témoin ou à l’administration concomittante d’un mélange gazeux protecteur et d’une compression des membres. En cas d’échec de réanimation, la procédure sera interrompu. En cas de reprise d’une activité cardiaque spontanée, l’anesthesie sera prolongée pendant 60 minutes pour évaluer la récupération hémodynamique et les animaux seront ensuite mis à mort. Des prélèvements sanguins seront réalisés à l'état anesthésié tout le long de la procédure (max 20 ml/porc).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, la stratégie thérapeutique d’intérêt sera évaluée chez des animaux profondément anesthésiés au décours d’un arrêt cardiaque et concomitamment à un réanimation cardiopulmonaire. Des échecs de réanimation, c’est-à-dire l’absence de reprise d’une activité cardiaque, sont possibles et attendus compte tenu de ce modèle expérimental. Néanmoins, la stratégie expérimental d’exposera pas les animaux à d’autres effets indésirables puisqu’ils seront euthanasiés en fin de protocole sans réveil dans tous les cas. En cas d’absence de reprise de la circulation spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera également interrompue.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les paramètres évalués dans ce projet nécessitent une instrumentation chirurgicale lourde. Il n'est pas envisageable de réveiller des animaux dans ces conditions.
Remplacement
L’arrêt cardiaque est une situation qui induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation cardio pulmonaire. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire une vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Le critère de jugement principal sera le débit carotidien moyen au cours du massage cardiaque. Afin de montrer une augmentation du débit carotidien de 50% dans le groupe traité par rapport au groupe Témoin, il nous faudra un effectif de 6 animaux par groupe (avec α=0,05 et β =0,8). Ce calcul permet d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants (méthadone 1mg/kg/IM). En cas de signes de douleur pendant la procédure chirurgicale (tachycardie, élévation de la pression artérielle, etc.) une nouvelle administration de méthadone sera administrée. En cas de signe de réponse autonome à la douleur , réfractaire à l’administration d’opiacés, un arrêt prématuré de la procédure sera envisagé. En cas de d’absence de reprise de la circulation spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue. Une administration intra-veineuse de pentobarbital (100 mg/kg) sera réalisée.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. Les porcs pèseront de 25-35 kg.
Détection de l’oxy-myoglobine pour quantifier l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
10 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit deux chirurgies espacées de trois heures, une ouverture du thorax avec ligature d'une artère du cœur d'environ 140 minutes puis la pose d'un cathéter, avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique que ces interventions peuvent provoquer des douleurs modérées à sévères pendant les quatre heures d'anesthésie. L'objectif immédiat reste de valider une méthode d'imagerie de l'infarctus, le transfert vers les patients étant renvoyé au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L'infarctus du myocarde touche environ 80 000 personnes en France (2019) et le taux de mortalité à 1 an est encore de 15% malgré une nette amélioration du diagnostic et des soins. Parmi les pistes d'amélioration de la prise en charge, une meilleure quantification de la taille de l'infarctus lors de la phase aiguë pourrait permettre une personnalisation de la prise en charge suite à l'angioplastie (intervention permettant de rétablir la circulation sanguine dans une artère qui a été obstruée). L'objectif principal du projet général est la preuve-de-concept d'une nouvelle méthode d'imagerie permettant la détection et la quantification précoce du degré d'intensité de l'infarctus du myocarde. Il s’agit ici d’une « étude complémentaire » venant compléter et consolider ce projet afin de confirmer manière robuste notre hypothèse de travail.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice de cette étude consiste à renforcer notre démonstration (permettant sa publication et diffusion dans la communauté scientifique) de la pertinence de l’imagerie photonique dans la quantification précoce de la taille de nécrose post-infarctus. Par effet de conséquence et à plus long terme, nous pensons que notre étude ouvrira un futur champ de développement technologique afin de tenter de transposer notre méthode de quantification du niveau d'oxydation tissulaire, ex vivo, en une méthode applicable in vivo dans un modèle expérimental. In fine, nous espérons que cette stratégie conduira au transfert de notre concept vers l'application clinique pour l'Homme.
Procédures
Deux interventions chirurgicales, espacées de 3h (sans réveil de l’animal entre les deux), seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée : - Une chirurgie thoracique (sous assistance respiratoire) permettant d’induire la ligature transitoire d’une artère (durée estimée : 140mn) - La mise en place d’un cathéter de perfusion dans l’artère carotidienne (durée estimée : 10mn) suivi de la mise à mort de l’animal pour permettre l’analyse des tissus
Impact sur les animaux
La chirurgie thoracique et la chirurgie de pose de cathéter (l’ensemble réalisé sous anesthésie et assistance respiratoire) peuvent induire, sur toute la durée d’anesthésie (4h), des douleurs modérées à sévères localisées (thorax et cou), prises en charges par ailleurs. En dehors de la chirurgie, aucun acte pouvant engendrer de nuisances n’est pratiqué sur l’animal.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur pour analyse 3D de l’organe (microscopie photonique).
Remplacement
Notre démonstration initiale du rôle de la myoglobine a été initiée par une approche d’imagerie in vitro. Nous avons ensuite mise en évidence une corrélation entre la présence de la myoglobine et notre signal mesuré par imagerie dans des cardiomyocytes (cellules cardiaques) isolées de souris. L'étude de ce projet va permettre de valider définitivement le rôle majeur de la myoglobine en démontrant que son absence (chez des animaux qui en sont dépourvus) corrèle avec la perte du signal mesuré par imagerie.
Réduction
S’agissant ici d’une validation terminale de l’hypothèse de travail et compte tenu de la nature de la réponse attendue (i.e. perte majeure du signal mesuré par imagerie) nous avons pu réduire les effectifs au maximum, sans préjudice pour le résultat scientifique, mais de sorte à pouvoir réaliser un test statistique sur les données.
Raffinement
- Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé ici fait appel à l’approche chirurgicale impliquant deux raffinements que nous avons récemment mis au point et validés au laboratoire, permettant de consolider en outre la pertinence de ces raffinements pour les futurs projets. - En accord avec l’objectif du projet, la durée entre les deux interventions (24h habituellement) a pu être réduite ici à 3h. Ceci nous a permis d’envisager un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure, évitant ainsi les contraintes et conséquences, pour l’animal, d’un réveil post-opératoire de quelques heures entre les deux interventions.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques notables, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde. De plus, la question posée dans ce projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiées, et la lignée transgénique pour le gène d’intérêt est déjà en cours d’élevage (évitant une phase de création de lignée spécifiquement pour ce projet). Les animaux participant à ce projet devront préférentiellement être de jeunes adultes (8 à 20 semaines) afin d'homogénéiser cette dernière étude avec l'ensemble du projet.
Evaluation d’un anticorps bloquant la dégradation du vWF dans le cadre d’une procédure d’assistance circulatoire mécanique chez le porc
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
33 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre eux étant opérés sous anesthésie sans réveil et tués, les trois autres réutilisés pour d'autres études ou l'enseignement. Chaque animal subit une chirurgie de la veine jugulaire, trente recevant en plus une assistance circulatoire mécanique implantée. L'objet est de tester un anticorps censé limiter les hémorragies liées à ces dispositifs de soutien cardiaque. Le porteur affirme que la dégradation du facteur von Willebrand sous assistance circulatoire ne peut pas s'étudier in vitro.
Objectifs
Les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique (ACM) ont révolutionné le traitement de l'insuffisance cardiaque et respiratoire. Un nombre croissant de dispositifs peuvent fournir une assistance circulatoire mécanique aux patients souffrant de complications hémodynamiques aiguës et d'insuffisance cardiaque chronique terminale et sauver des vies. En raison de son efficacité (survie globale de 50 %), l'utilisation de l'ECMO (dispositifs d'oxygénation extracorporelle) a augmenté rapidement au cours des quinze dernières années (30 000 procédures/an), mais elle est confrontée à un risque très élevé de complications hémorragiques majeures et potentiellement mortelles (50 %). Les altérations fonctionnelles du facteur de von Willebrand (vWF) contribue aux saignements. Des études menées chez des patients atteints de la maladie de von Willebrand ont montré que les concentrés contenant du vWF ont une efficacité limitée en raison de la courte demi-vie du vWF. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies de traitement pour prévenir les saignements chez ces patients recevant une ACM. Nous avons développé un anticorps monoclonal de souris interférant avec le clivage du vWF, anticorps que nous avons pu humaniser. Les caractéristiques de cet anticorps permettent une large fenêtre thérapeutique potentielle évitant le risque de thrombose. Des études préliminaires menées ex-vivo nous ont apporté des données sur les capacités de restauration du vWF par cet anticorps. Le but de notre projet est d’évaluer in vivo l’efficacité de cet anticorps dans l’inhibition de la dégradation du vWF dans un modèle animal avec implantation d’une assistance circulatoire. Notre étude sera réalisée chez le porc, espèce reconnue par les sociétés savantes dans les études impliquant des pompes ACM. De plus, le modèle porcin possède une très grande proximité avec l’Homme d’un point de vue hémostase avec la capacité d’effectuer des prélèvements sanguins conséquents et répétés.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies de traitement des complications hémorragiques lors de l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Ces données chez l’animal viendront constituer une partie du dossier efficacité/sécurité permettant de déposer des demandes d’autorisation d’étude clinique.
Procédures
Les 33 animaux auront une procédure chirurgicale : 3 pour la pose d'une voie centrale jugulaire afin d'injecter des molécules et afin d'effectuer des prélèvements sanguins répétés sur 3 heures. 30 pour la pose d'une voie centrale jugulaire et l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Une seule intervention chirurgicale sera réalisée par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances expérimentales directes attendues suite à l’injection d’une molécule d’origine humaine et à la mise en place chirurgicale du dispositif d’assistance circulatoire sont une allergie qui se traduirait par de la fièvre ou l’apparition de boutons, le développement d’un caillot de sang ou un risque de saignement excessif pouvant conduire à une douleur et un stress physique de l’animal.
Devenir
Sur les 33 animaux utilisés, 3 seront utilisés dans d’autres études sans implication cardio-vasculaire ou pour l’enseignement. Les 30 autres animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les variations plasmatiques du vWF dépend de son niveau de sécrétion endothéliale (modulée par la pulsatilité artérielle) et de sa protéolyse (modulée par les forces de cisaillement). Il n’est pas possible d’étudier in vitro la protéolyse du vWF sous assistance circulatoire. Une étude in vivo est nécessaire afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps sur la dégradation du vWF dans la circulation et en présence de forces de cisaillement.
Réduction
Dans la procédure 1, 3 animaux sera nécessaire et suffisant pour déterminer la dose optimale de vWF humain à injecter pour être efficace. Pour les procédures 2 et 3 le nombre suffisant d'animaux pour pouvoir réussir à mettre en évidence un effet statistiquement significatif = 5 animaux par groupe minimum. Le choix orienté sur 7 animaux par groupe permet de palier toute défaillance technique, soit au total 42 animaux pour ces 2 procédures.
Raffinement
Le "Raffinement" est envisagé en réalisant un maximum de prélèvements sanguins par individu ainsi qu'en étant attentif à leur bien-être en utilisant des traitements analgésiques avant et pendant toute chirurgie ainsi qu'à leur conditions d'hébergement.
Choix des espèces
Le modèle porcin est le modèle de référence pour tester les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique. Le porc présente en effet une physiologie cardiovasculaire et un profil d'hémocompatibilité proche de l'homme. Les axes vasculaires sont d'un calibre suffisant et faciles d'accès. Par ailleurs, notre laboratoire a l'expertise de l'exploration biologique du facteur de von Willebrand chez le porc Mini porcs jeunes adultes de 25 à 30 kg
Traitement de la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
388 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie subit une ligature chirurgicale d'une artère du cœur pour provoquer un infarctus, geste dont le porteur attend une mortalité de 20 à 30 %, suivie d'un gavage salé pour déclencher une décompensation cardiaque puis d'un cathétérisme qui sert de mise à mort. L'objet est de tester trois molécules sur l'insuffisance cardiaque aiguë décompensée, qui n'a pas de traitement. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit cette pathologie multifactorielle.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) représente un challenge thérapeutique majeur puisque, à ce jour, il n'existe pas de traitement. Notre hypothèse est que l'altération du métabolisme énergétique du cœur contribue à aggraver la dysfonction cardiaque menant à l’ICAD. En utilisant un modèle expérimental d’ICAD chez le rat, nous allons déterminer si des traitements pharmacologiques améliorant le métabolisme énergétique cardiaque préviennent la dysfonction cardiaque liée à l'ICAD. Ce projet, en ciblant le métabolisme énergétique cardiaque au cours de l'ICAD, permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque chronique est une maladie sévère touchant en Europe environ 6.5 millions de patients. Malgré les traitements actuels, l'insuffisance cardiaque chronique reste la première cause de mortalité parmi les maladies cardiovasculaires en France avec 32 000 morts prématurées chaque année. Cette morbi-mortalité élevée est due au fait que les traitements actuels n’empêchent pas la complication majeure de l'insuffiance cardiaque chronique : la décompensation aiguë. Cette dernière représente un challenge thérapeutique majeur puisque les traitements actuels de l’insuffiance cardique sont inefficaces sur celle-ci. Notre hypothèse est que l’altération du métabolisme énergétique cardiaque est un élément déclencheur de la dysfonction cardiaque lors de la décompensation aiguë de l'insuffisance cardiaque. Le but ultime de cette recherche est de démontrer que des traitements visant l’amélioration du métabolisme énergétique cardiaque pourrait donc constituer une nouvelle cible dans la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque. Nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements permettant de limiter le développement de la décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque chez des patients.
Procédures
Les animaux Wistar de la procédure 1 subiront une procédure chirurgicale (ligature coronaire) pour induire un infarctus du myocarde (n=258 ). Des prélèvements sanguins seront effectués une fois par mois sur tous les animaux de la procédure 1 et 2 sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée. Sur les rats survivants de la procédure 1 et les rats ZSF-1, un gavage en NaCl permettra d'induire la décompensation aigue. A ce moment, sera initié des traitements innovants (3 molécules) qui serons sans la nouriture donc voie peros et l'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) sera effectué sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse de 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort (durée 20 minutes) qui sera effectué dans la procédure 1 et 2 sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anethésiés et sera sans réveil.
Impact sur les animaux
La première procédure est classée sévère et la deuxième est classée modérée. Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. La première procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque et la deuxième est induite génétiquement. La chirurgie dans la procédure 1 qui est une ligature coronaire entraine un taux de mortalité de 20% à 48h suivant la chirurgie et au court des 3 mois après ligature peut entrainer une mortalité de 20 à 30%. Il faut aussi tenir en compte que la mortalité après la décompensation par le NaCl dans nos deux modèles peut entraine une mortalité de 10%. Comme décrit dans la littérature la ligature coronaire est une chirurgie qui entraine un taux de mortalité important même avec une maitrise du geste donc pour un nombre attendu de 15 animaux dans chaque sous-groupe nous prenons en compte un pourcentage de mortalité de 30%, comme référer dans la littérature . Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du cœur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Pour les deux procédures tous les animaux seront mis à mort suite à l'évaluation invasive par cathétérisme cardique.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle de décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque in-vitro. Cela n'est pas possible d'appliquer des modèles alternatif puisque le développement de la dysfonction est multifactoriel et aucun approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet l'implication de tout, c'est facteur dans le développement pour l'étude de ce type de médicament avec une visée cardiovasculaire.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque par échographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice puis une mesure invasive hémodynamique. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avllons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaires afin de détecter une différence de 10% . Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. Notamment, l’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Une meilleure survie post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle d'infractus du myocarde. Les données et prélèvements obtenus des animaux témoins sains et des contrôles (infarctus du myocarde par ligature coronaire sans gavage au NaCl) seront réutilisés entre études pour limiter le nombre d'animaux. Nous allons d'abord évaluer les effets a court termegavage au NaCl, avec un mise à mort pour le groupe 1 à J3 et pour le groupe 2 et 3 à J14.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Les rats perdant plus de 15 à 20% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en pré-opératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Les expériences, in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors de la décompensation cardiaque (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220g) seront utilisés pour induire l'infarctus du myocarde. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la procédure de ligature coronaire permettant de ne pas augmenter le nombre d'animaux utilisés. Les Rats mâles ZSF-1 jeunes adultes arriveront à l'âge de 6 semaines pour une question de coût, mais seront utilisés à l'age de 24 semaines pour que la maladie cardiaque ait le temps de se développer.
Etude du role du collagène XVIII dans la formation/fonction des plaquettes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections répétées, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des modèles de thrombose induits sans réveil. L'objet est d'étudier le rôle du collagène XVIII dans la formation des plaquettes et dans une forme de cancer de la moelle osseuse. Le porteur affirme que la thrombose met en jeu des interactions à étudier sur l'animal vivant.
Objectifs
Le collagène XVIII est une protéine de la matrice extracellulaire, notamment présente au niveau des vaisseaux sanguins. Elle participe à l'organisation des tissus. Par l'un de ses domaines pouvant être libéré, appelé endostatine, elle régule également les phénomènes de développement des vaisseaux sanguins, pouvant être mis en oeuvre dans diverses pathologies telles que l'athérosclérose ou les cancers. Ayant observé de façon inattendue une très forte augmentation de l'expression de ce collagène dans un modèle de souris développant de la myélofibrose primaire, un cancer qui chez l'homme entraine une dégénerescence de la moelle osseuse avec insuffisance médullaire , nous cherchons à comprendre comment la surexpression de ce collagène freine ou au contraire contribue au développement de la maladie. En outre, étant présent dans les vaisseaux sanguins, nous chercherons également un rôle éventuel dans les processus d'arrêt des saignements ou à l'inverse dans le développement des thromboses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension des rôles du collagène 18 dans la formation plaquettaires, dans l'initiation ou le développement des myélofibroses, ainsi que dans l'hémostase et la thrombose. Si le collagène 18 est impliqué dans ces processus, cela constituera de nouvelles pistes pour moduler,chez les différents patients, la formation ou la fonction des plaquettes.
Procédures
Pour les expérimentations nécessitant un traitement d'un mois, celui-ce sera administré sur souris vigile, par injection unique 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Tous les prélèvements sanguins répétés seront effectués sur animal anesthésié, à J0, après 2 semaines et 4 semaines. Pour les expérimentations impliquant un traitement unique par chimiothérapie, le suivi de la numération sanguine sera effectué à J0, J5, J7, J8, J9, J12, J14. L'anesthésie et le prélèvement de sang dure entre 5 et 10 minutes pour chaque souris. Tous les modèles de thrombose seront mis en place sur animal anesthésié sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont essentiellement le stress de la contention qui précède l'injection ou l'anesthésie, ainsi que la piqure d'anesthésie ou de traitement par elle-même. Ce stress est minimisé par le recours dans tous les cas à un professionnel expérimenté et diplômé. Le prélèvement sanguin caudal est susceptible d'entrainer un petit saignement, qui est stoppé par un point de compression de 1 à 2 minutes lorsque la souris est toujours sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique et hémostatique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, la thrombose met en œuvre simultanément des interactions entre les plaquettes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Des études pilotes ont permis de déterminer le nombre minimum pour l’obtention de résultats statistiquement analysables. Un certain nombre de souris sont réutilisées au sein de ce même projet. De plus, une fois sacrifiées, les souris seront partagées afin d'utiliser différents organes pour d'autres expérimentations. Les lots sont optimisés afin d'utiliser mâles et femelles. Enfin, dès que possible, nous utilisons des cellules humaines pour nos expériences in vitro qui ne nécessitent pas l'environnement des tissus ou l'animal dans sa globalité.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de même sexe et sans défaire les groupes préformés pour éviter le développement de comportements agressifs. Des objets sont placés dans la cage pour enrichir le milieu et permettre une protection contre l'éventuelle agressivité des congénères. De la ouate est également disposée pour favoriser le comportement de fouissage et du coton cardé pour favoriser le maintien de la chaleur corporelle dans le nid. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduit au maximum, notamment par anesthésie pour toute procédure invasive. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites a été établie pour la procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire afin de limiter la souffrance.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris génétiquement modifiée n'exprimant plus le collagène 18 est un modèle unique et précieux pour étudier le rôle de cette protéine par comparaison avec les souris contrôles exprimant cette protéine. De plus, nous possédons une bonne connaissance de la physiologie de la souris et des similitudes avec l'homme, et nous disposons de nombreux modèles d’étude largement maitrisés chez la souris. Cette lignées de souris est donc parfaitement adaptée à cette étude et constitue un outil original et unique. L'absence de collagène 18 n’induit pas d’effet indésirable chez la souris au vu de leur comportement. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, soit entre 8 et 18 semaines et les mâles et femelle utilisés en quantité similaire, ce qui nous permettra à postériori de déterminer un éventuel effet différent selon le sexe.
Comparaison de deux voies d’injection intraveineuse par fluorescence chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit une injection dans la veine de la queue, l'autre une injection derrière l'œil, suivies de trois séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux techniques d'injection et deux traceurs fluorescents. Les souris sont ensuite tuées au CO2 pour analyser la distribution du produit. Le porteur affirme que la validation d'une injection systémique "ne peut être réalisée que sur un organisme entier".
Objectifs
L'administration de médicament chez la souris peut être réalisée par voie oral (dans l'eau de boisson ou par gavage) ou par injection (sous cutanée, intra péritonéale ou intraveineuse). La voie la plus directe et la plus utilisé en clinique est la voie intraveineuse, puisque le composé injecté passe dans tout le corps très rapidement. Pour l'intraveineuse, toujours chez la souris, il existe deux techniques couramment mises en œuvre qui sont l'injection dans la veine caudale (au niveau de la queue) sans anesthésie où les souris sont mises dans un système de contention indolore et rétro orbitale (derrière l'œil) où les souris seront anesthésie. La première permet des injections répétées et nécessite d'immobiliser la souris durant l'opération. Elle peut être compliquée à réaliser sur des animaux de petite taille ou ayant une peau foncée. Dans le cas de l'injection rétro orbitale, la souris est maintenue en contention légère après l'avoir anesthésié et injectée en passant à côté de l'œil. Cette injection ne doit pas être répétée sous peine de causer des lésions à l'animal. Dans notre institut, ces injections sont régulièrement mises en œuvre. Depuis quelques mois, nous sommes équipés d'un appareil de lecture de fluorescence/bioluminescence dans notre service. La lecture de fluorescence sur animal permet de suivre des composés fluorescents en temps réel dans l'animal. Lors d'expériences, nous avons constaté une fluorescence persistante au niveau de la queue lors d'injection en intraveineux caudale. Afin de garantir nos résultats scientifiques, nous devons connaitre précisément la quantité injectée à l'animal que ce soit de cellules ou de médicaments. Dans le cas d'injection en intraveineuse rétro orbitale, nous avons constaté sur un faible nombre d'animaux (1 sur 4 injectées) un échec de l'injection (le liquide ne s'est pas diffusé dans le sang mais est resté localisé au niveau de l'œil). L'objectif de ce projet est de quantifier pour 30 souris (15 souris pour chaque type d'injections) la perte éventuelle de liquide lors d'injection intra caudale et de quantifier le taux d'échec lors d'injection rétro orbitale. Par la même occasion, nous pourrons comparer la distribution de fluorescence entre ces deux techniques et comparer l'efficacité de deux fluorophores que nous utiliserons en parallèle comme traceurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une amélioration de nos techniques d'injection en intraveineuse et du choix des fluorophores dans nos futures études et ainsi l'amélioration continue de la qualité des résultats scientifiques.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. La moitié des animaux seront soumis à une injection unique le jour même au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. L'autre moitié des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute). Tous les animaux seront soumis à trois séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par CO2.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger (maximum 3 minutes) lié à la cage de contention et une douleur légère (moins d’une minute) liée à l’injection. Après injection, les souris subiront une anesthésie gazeuse ce qui représentera aussi un stress léger lié aux anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution.
Remplacement
La validation d'une injection systémique ne peut être réalisée que sur un organisme entier. Nous ne disposons pas de méthode alternative.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Cependant, les éventuels problèmes d'injections (échec du manipulateur ou formulation du produit) ne permettent pas de descendre sous le nombre d'une quinzaine d'animaux par groupe. Afin de diminuer le nombre d'animaux, l'injection simultanée de deux fluorophores a été privilégié à des injections sur des animaux différents. Afin d'observer un échec d'injection en rétro orbitale ou calculer une éventuelle perte de produit injecté au niveau caudale demande un effectif important de 15 animaux par groupe. D'après nos observations lors d'une étude précédente sur un très faible effectif d'animaux (un échec d'injection sur 4 souris injectées), ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir une statistique fiable sur l'apparition de ce type d'événement.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (5% à l'induction et 2% en entretien). Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, l'appareil d'imagerie est équipé d'une plaque thermostatée. De plus, les animaux seront placés dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d'imagerie. Des points limites généraux avec établissement d'une grille d'évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout le long de l'étude ont été établis pour surveiller l'état général de l'animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle principalement utilisé dans nos études. Ce modèle est le plus pertinent pour le test d'injection intraveineuse que nous effectuerons à l'avenir. Nous utiliserons des souris blanches de taille adulte entre 12 et 20 semaines d'âge. On sera dans des conditions optimales pour la taille de la queue des animaux adultes qui permettra une insertion d'une aiguille de 30 G (la mieux adapté pour les injections IV caudal) et pas trop âgées pour que la peau de la queue ne soit pas durcie.
role du controle qualité des proteines mitochondriales dans le métabolisme hépatique et cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
208 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection dans la veine de la queue, suivie de séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être mis à mort pour prélever le foie et le cœur. Le projet étudie une voie de contrôle des protéines mitochondriales sur des souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas de méthode alternative" et que la souris est le seul modèle porteur d'une déficience pour sa protéine d'intérêt.
Objectifs
La mitochondrie est un organite intracellulaire semi-autonome qui est impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques essentielles comprenant entre autres, la production d'énergie, la régulation du stress oxydatif et la mort cellulaire programmée. Les dysfonctions mitochondriales sont responsables de plus de 120 syndromes. Ces pathologies sévères sont classées dans les maladies rares. Les fonctions mitochondriales reposent sur un protéome de 1500 protéines environ. Chez les mammifères, plus de 99 % des protéines mitochondriales sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseurs qui sont ensuite importés dans l'organite. La qualité de ces protéines néosynthétisées représente un enjeu crucial permettant d’éviter l'accumulation de protéines défectueuses dans l'organite et ainsi prévenir les dysfonctions mitochondriale. A ce jour, on ignore encore comment le contrôle qualité de ces précurseurs protéiques mitochondriaux est assuré avant leur import dans l'organite. Récemment, en utilisant des modèles cellulaires nous avons mis en évidence qu'une E3 ubiquitin ligase, FBXL6, est indispensable pour ce processus de contrôle qualité des protéines nouvellement synthétisées ou naissantes. L'objectif de notre projet est d'étudier les conséquences physiopathologiques de l’invalidation de cette voie sur contrôle qualité des protéines mitochondriales dans deux tissues, le foie et le coeur. Pour cela nous utiliserons un modèle de souris KO pour la E3 ubiquitine ligase.
Bénéfices attendus
La mitochondrie est une organelle intracellulaire jouant un rôle central dans plusieurs fonctions cellulaires et tissulaires. Entre autres, ces organelles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares sévères caractérisés par des perturbations généralisées du métabolisme (acidose lactique, obésité, déficits énergétique ...), encéphalopathie, cardiomyopathie etc... A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Notre projet vise à améliorer les connaissances concernant ces pathologies et réveler des nouvelles cibles therapeutiques pour ces pathologies.
Procédures
Pour chaque animal, une injection sera réalisée dans la veine de la queue grâce à une seringue. Cette étape durera moins d’une minute. Un premier groupe d’animaux sera analysé en imagerie à 1, 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Ces animaux seront anesthésiés par voies respiratoires, puis soumis à une injection par voie intrapéritonéale et enfin placé dans une chambre d’imagerie. La durée totale de cette approche est d’environ 15 min par animal et répétée, donc, à 1, 4 et 8 semaines post injection. En parallèle, deux groupes seront sacrifiés successivement, à 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Nous prélèverons les tissus d’intérêt et cette étape durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Notre procédure nécessite une l’injection intraveineuse dans la veine de la queue susceptible d’entrainer une douleur transitoire. Cette procédure est très rapide (
Devenir
Tous les animaux, incluant les animaux atteignant les points limites seront mis à mort, à des fins d’ analyses, conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'homme. Nos recherches préalables menées sur des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, ont permis d’obtenir un certain nombre de résultats et nous permettent de cibler/restreindre précisément les recherches à mener sur l’animal. En revanche, ces modèles ne peuvent pas reconstituer la complexité de la régulation des fonctions mitochondriales et de leurs conséquences physiopathologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 et les expériences seront répétées à deux reprises. Les tests statistiques afin de comparer les groupes d’animaux seront non paramétriques. Dans un premier temps, un test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test post-hoc de comparaisons multiples. Nous utilisons les souris males et femelles pour notre projet. De plus, nos études préliminaires réalisées sur des modèles complémentaires ont permis de réduire notre étude in vivo à une partie congrue.
Raffinement
1-Hebergement : Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique: - coton dentaire, que les souris dépiautent pour se faire un nid. -des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les injections intraveineuses sont réalisées sur des animaux par un personnel dument formé. Un suivi quotidien des animaux est réalisés post injection afin d’anticiper des éventuels inconforts et douleurs. En cas d’inflammation lors des 24h après la procédure, nous injecterons une dose d’anti-inflammatoire non-steroidien en sous-cutanée. 5. Les points limites : Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant. Les animaux présentant des signes moteurs anormaux après les injections, au réveil après l’anesthésie et l’imagerie seront observés de près et si aucune amélioration observée après 24h, ils seront euthanasiés. Les animaux ayant une perte de poids de plus de 20 % ou présentant des signes tels que piloérection, déshydratation, dos voûté, prostration, isolement pendant plus de 24h jour, seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utiliserons les souris adultes pour cette expérimentation. L’âge adulte correspond au stade durant lequel les effets biologiques que nous analysons sont modifiés. Par ailleurs, nous utilisons la souris car il s’agit de l’unique modèle animal existant présentant une déficience pour notre protéine d’intérêt.
Evaluation du rôle des intégrines β1 et β3 plaquettaires dans les saignements inflammatoires (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une inflammation cutanée, pulmonaire ou cérébrale, ce dernier modèle incluant une chirurgie du cou pour provoquer un AVC, avec prélèvements de sang, injections et pose de cathéter à la queue. Le porteur indique une détresse respiratoire possible et des difficultés motrices et alimentaires liées à l'AVC, les animaux étant mis à mort sous anesthésie pour quantifier les saignements. Il affirme que le rôle des intégrines plaquettaires ne peut être étudié sans le métabolisme entier de la souris.
Objectifs
L’arrêt des saignements implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, adhèrent, s’activent et agrègent pour former le clou plaquettaire qui limite le saignement. Il a été mis en évidence que les plaquettes jouent un rôle particulièrement important également dans l’arrêt des saignements en conditions inflammatoires. En effet, l’inflammation induit un recrutement des neutrophiles qui traversent la paroi vasculaire entrainant la formation de brèches vasculaires. Les plaquettes jouent alors leur rôle et colmatent les brèches. Cependant, les mécanismes impliquant les plaquettes dans ce processus restent encore peu compris à ce jour. Ce projet vise donc à évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements inflammatoires, ce qui à terme pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour l’inflammation cutanée, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections intradermiques et rétro-orbitales et à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h). Pour l’inflammation pulmonaire, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h) et à une inoculation intranasale. Pour l’inflammation cérébrale, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections rétro-orbitales, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h), à une chirurgie au niveau du cou qui permettra d’induire un AVC (maximum 30min) et à une imagerie IRM (maximum 1h).
Impact sur les animaux
Un effet indésirable attendu est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. De plus, une inflammation locale sera observée. Dans le modèle pulmonaire, on pourra observer une surcharge de liquide dans les poumons conduisant à une détresse respiratoire légère à modérée. Pour le modèle d’AVC, on s’attend à des douleurs suite à la chirurgie, à des difficultés motrices et pour s’alimenter dues aux manifestations de l’AVC.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux encore anesthésiés sont mis à mort afin de prélever et quantifier les saignements dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales), il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par d’autres méthodes du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal sous anesthésie • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de tétracaïne sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux effectués sur la souris démontrant le rôle primordial des plaquettes dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés, il est nécessaire de réaliser ce modèle dans la même espèce animale. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Etude des mécanismes de l’atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un prélèvement de queue, des injections intraveineuses, deux chirurgies sous anesthésie et des séjours en cage métabolique, une atteinte rénale leur étant induite pour en étudier les mécanismes avant prélèvement des reins. Le porteur affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier ces maladies rénales rares dans un organisme vivant. Les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort après le seul génotypage.
Objectifs
Les maladies rénales rares et sévères sont à mauvais pronostic et sont associées à des risques élevés d'insuffisance rénale terminale. Ces maladies représentent 11% des causes d'insuffisance rénale terminale en France. Ces maladies sont des maladies complexes et seule l'expérimentation animale, résumant l'ensemble des interactions cellulaires au sein du rein, dans un organisme vivant, permettra d'étudier les mécanismes impliqués dans la destruction rénale au cours de ses maladies. Nous avons identifié une protéine potentiellement impliquée dans ces maladies et nous allons tester le rôle de cette protéine chez des souris où cette protéine aura été inactivée et chez qui nous aurons induit les maladies rénales que nous étudions. Nous réaliserons des prélèvements d'urine pour évaluer la fonction des reins et les animaux serons mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les reins et analyser les lésions.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies rénales rares et sévères. Ce projet permettra d'établir si le mécanisme identifié pourrait faire l'objet d'un ciblage pharmacologique à visée thérapeutique.
Procédures
Baguage à l'oreille et prélèvement d'un morceau de queue de 1 mm sur animal vigile (1 fois 2 min), injection intra veineuses sous anesthésie générale (1 à 3 selon la procédure, 5 minutes), chirurgies sous anesthésie générale (2 chirurgies pour une procédure, 20 minutes). recueil d'urine en cage métabolique (3 à 7 selon les procédures, 8H)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, stress lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleur post-opératoire. Effet lié aux modèles: insuffisance rénale pouvant induire une perte de poids modérée ou une fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Soit ils n'auront pas un génotype d'intérêt et sont mis à mort sans expérimentation autre que le génotypage, soit ils sont d'intérêt et sont mis à mort pour prélèvement des tissus.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères incluant les cultures cellulaires (in vitro). Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions entre les glomérules et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un logiciel dédié. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, les modèles utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Stade de développemnt: de la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Seuls les animaux adultes agés de 2 à 6 mois sont utilisés pour les modèles expérimentaux. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.
Effet du régime alimentaire maternel et paternel sur les malformations congénitales cardiaques des nouveaux nés et impact sur la santé cardiovasculaire des adultes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
199 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont soumises à des régimes carencés en vitamine D ou riches en graisses induisant une obésité, à un gavage et à des échocardiographies sous anesthésie, avant une mise à mort pour collecter les embryons. Le porteur étudie l'effet de l'alimentation parentale sur les malformations cardiaques de la descendance, en menant en parallèle un modèle d'organoïdes cardiaques encore à optimiser. Il présente le passage à l'animal comme une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Les cardiopathies congénitales sont des malformations cardiaques se développant au cours de la vie intra utérine. Elles surviennent assez fréquemment et touchent environ 10 naissances sur 1000. Il s’agit de pathologies ayant une cause multifactorielle. Les facteurs les plus souvent rencontrés sont les anomalies génétiques, les maladies métaboliques maternelles voire paternelles ou la consommation de drogues, de médicaments ou d’alcool. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de différents facteurs nutritionnels, seuls ou en combinaison, sur l’apparition de ces anomalies. (1) La carence en vitamine D : une alimentation maternelle carencée en vitamine D affecte le développement cardiaque de la progéniture par différents mécanismes dont les mécanismes non génétique (2) L’obésité maternelle : bien que fortement suspectée comme ayant un impact négatif sur le développement cardiaque, nous ne savons toujours pas si et comment l’obésité maternelle affecte les embryons. Nous ne savons pas du tout l 'impact du statut nutritionnel paternel. (3) Le sexe fœtal : la réponse métabolique du nouveau-né semble être spécifique au sexe de l’individu . Il est donc intéressant d’analyser les différences développement cardiaque en condition pathologique en fonction du sexe. (4) La flore intestinale : La flore intestinale est susceptible de jouer un rôle de médiateur dans au moins une partie de l’effet des régimes maternels déficients en vitamine D et riches en graisses et avoir un effet délétère sur la formation cardiaque de la progéniture. Cette flore est de plus différent eentre les deux sexes. Notre projet permettra une meilleure connaissance de l 'origine des pathologies cardiaques congénitales.
Bénéfices attendus
le projet devrait permettre de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaire de l impact des regimes maternel ou paternel sur les malformations cardiaques.
Procédures
Gavage 1 min un seul par souris. Echocardiographie sous anesthésie: 30 min 1 seule /souris. Le gavage implique une contention de 30 s de la souris. L’échocardiographie est la technique d’imagerie de choix pour le suivi longitudinal de la fonction cardiaque in vivo et une technique non invasive. Il s'agit d'une procédure indolore ne nécessitant pas d’analgésie. Elle se fait sous anesthésie générale gazeuse simplement pour maintenir la souris immobile sur le dos
Impact sur les animaux
L’obésité des souris en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. Elles ne présentent pas non plus de signes de souffrance. Les souris seront observées chaque jour par l’expérimentateur pour contrôler leur état de santé. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie sur un matelas chauffant pour le maintien de leur température. Le gel nécessaire à l’échographie est préchauffé pour minimiser toute nuisance ou inconfort ou stress thermique. Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus prend seulement 30 s et la souris est conditionnée deux jours avant le gavage à la contention de 30 s pour diminuer le stress. Le gavage sera fait une seule fois pour chaque souris pour induire la recombinase at avec une sonde trempée dans l’eau sucrée. L’expérimentateur visite les souris chaque jour de sorte de les habituer au contact humain. Une grille de score jointe au projet sera suivie quotidiennement.
Devenir
Les prélèvements de sang se feront une seule fois par ponction cardiaque au moment de la mise à mort pour la collecte des embryons. Les autres souris seront mises à mort avant reveil au terme de l 'echocardiographie
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro; Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle requiert encore une optimisation pour mimer la vraie formation et le fonctionnement d'un coeur.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique Les même souris et embryons serviront à de multiples analyses cardiaques. Nous avons donc d' ores et déjà reduit le nombre d animuax dans ce projet au statistiquement strict nécessaire ( test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes à l aide du logiciel Graphpad selon les recommandations de "Analyses statistiques des données acquises lors d’analyses fonctionnelles chez la souris. Méthodologie [stat.ME]. 2012. ffdumas-00729021f" . Les données acquises sur cellules humaines validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Des points limites clairs seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. Dans la mesure du possible, les souris seront plusieurs par cage afin de respecter leur instinct grégaire. Leur milieu sera enrichi par du Sizzle Kraft et des buchettes chaque semaine pour leur permettre de se cacher de la lumière et de les occuper à confectionner leur nid, cela a pour but de réduire leur stress. Les animaux seront observés tous les jours de la semaine et les week-ends, de leur arrivée à leur mise à mort.
Choix des espèces
la souris est un bon modèle de developpement cardiaque comparé à l 'homme et a un microbiote semblable au microbiote humain. La souris permet une étude intégrée de la physiologie
Etude collaborative de l’impact de l’insuffisance cardiaque sur la sévérité du Covid 19 et de l’efficacité de son traitement chez la souris (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque de près de deux heures provoquant un infarctus et une insuffisance cardiaque, puis une infection intranasale par le SARS-CoV-2, entre deux établissements reliés par transport. Le porteur veut mesurer l'effet d'une maladie cardiaque sur la gravité du Covid et l'efficacité d'antiviraux, en reconnaissant des preuves existantes "contradictoires". Il répète que l'objectif ne peut être atteint sans modèle animal et invoque la "nécessité" de l'étude in vivo.
Objectifs
Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.
Procédures
Au préalable, les animaux transgéniques sont genotypés et identifiés par la méthode de biopsie de phalange, réalisée entre le 7ème et 10ème jour de vie des souriceaux. Au sein de l’établissement EU1/2, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines postopératoire (20 min). Au sein de l’établissement EU 2/2, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo en injection intranasale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des perfusions et prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).
Impact sur les animaux
Il n’a pas été identifié d’effet indésirable court-terme ou long-terme conséquent à la biopsie de phalange telle que réalisée en routine dans l’établissement. Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2/2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.
Devenir
La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de procéder à des prélèvements incompatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie. De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test »), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe sociaux et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et la mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Impact du système d’oxygénation par membrane extra-corporelle sur la pharmacocinétique de l’association d’un antibiotique (la pipéracilline) et d’un antifongique (la Caspofungine)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
49 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil au bout de huit heures de suivi. Chez une partie d'entre eux un arrêt cardiaque est provoqué puis réanimé, et tous reçoivent l'implantation chirurgicale de canules d'assistance cardiorespiratoire (ECMO) avant des prélèvements sanguins répétés. Le porteur mesure ainsi comment l'ECMO modifie le devenir de deux anti-infectieux, et reconnaît des échecs possibles de réanimation ou de pose du dispositif entraînant une mise à mort anticipée. Il justifie le recours au cochon par ses "similitudes" cardiovasculaires avec l'humain et conclut qu'un remplacement total n'est "pas possible".
Objectifs
Les techniques d’assistance cardiorespiratoire temporaire par circulation extracorporelle ou ECMO (Extracorporeal Membrane Oxygenation) sont de plus en plus utilisées soit en ECMO veino-veineuse (ECMO-VV) pour les applications respiratoires ou ECMO veino-artérielle (ECMO-VA) pour les applications cardiovasculaires. Il a été démontré que l’utilisation de l’ECMO entraînait des modifications de la pharmacocinétique des médicaments administrés chez les patients critiques notamment les molécules sédatives et antalgiques et les anti-infectieux. Néanmoins l’influence exacte de chacun des types d’ECMO n’a pas été spécifiquement étudiée. Notre projet a pour objectif de documenter l’influence du type d’ECMO sur la pharmacocinétique de l'association d'un antibiotique (pipéracilline) et d'un antifongique (caspofongine) utilisés couramment en association chez les patients critiques. Cette étude sera réalisée en comparant les deux modalités d’ECMO dans un modèle porcin anesthésié, placé sous ventilation mécanique et sans réveil. Au cours de ce protocole nous réaliserons un certain nombre de prélèvements sanguins qui nous permettrons de réaliser un modèle pharmacocinétique et de quantifier, pour chacune des deux molécules, l’aire sous la courbe (ASC) de la concentration plasmatique en fonction du temps, le volume de distribution et la clairance. Nous pourrons ainsi comparer les altérations pharmacocinétiques entre les deux modalités d’ECMO et par rapport à deux groupes contrôle, sans ECMO, l’un uniquement anesthésié et l’autre soumis à un arrêt cardiaque réanimé. Cela nous permettra, à terme, de documenter précisément les altérations pharmacocinétiques causées par l’ECMO et de proposer des adaptations posologiques adaptés à la situation et permettant de maximiser l’effet thérapeutique de ces molécules.
Bénéfices attendus
L'association d'un antibiotique (pipéracilline) et d'un antifongique (caspofungine) est pertinente cliniquement puisqu'elle est fréquemment utilisée en réanimation dans plusieurs situations cliniques : neutropénie fébrile, choc septique comme par exemple les patients graves souffrant d'une infection intraabdominale communautaire ou associée aux soins et pris en charge par l’ECMO. Les données concernant la séquestration de ces deux molécules dans le circuit d'ECMO sont contradictoires. Cette étude in-vivo permettrait d'appréhender les déterminants pharmacocinétiques pour une meilleure personnalisation des traitements anti-infectieux sous ECMO VA ou VV et éviter les risques d'inefficacité ou de toxicité.
Procédures
- Induction anesthésique des animaux - Mise en condition et instrumentation sous anesthésie générale - Induction de l'arrêt cardiaque sous anesthésie générale - Implantation des canules d'ECMO sous anesthésie générale - Les prélèvements sanguins pour l'étude pharmacocinétique des anti-infectieux administrés sous anesthésie générale - Tous les animaux seront mis à mort au termes des 8 heures de suivi
Impact sur les animaux
Dans ce projet: - Les échecs de réanimation sont possibles chez les animaux, compte tenu de la difficulté du modèle. En cas d’absence de reprise de la circulation spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue. La mise à mort sera réalisée dans ce contexte précis. - Les échecs liés à la mise en place chirurgicale de l’ECMO sont possibles chez les animaux, compte tenu de la difficulté du modèle. La mise à mort sera réalisée dans ce contexte précis.
Devenir
L’implantation d’un circuit de membrane extraporelle par voie chirurgicale est une technique invasive difficilement compatible avec un sevrage en moins de 48h de la procédure. En conséquence, tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.
Remplacement
La pharmacocinétique est une discipline complexe et intégrative visant à décrire la distribution, le métabolisme et l’élimination des molécules dans l’organisme. Le caractère intégré et l’influence des nombreux paramètres physiologiques ne permettent pas de reproduire in vitro, le comportement des molécules dans l’animal. Un remplacement total n’est donc pas possible. Néanmoins, dans une démarche de remplacement, un certain nombre de mesure de séquestration des molécules par les tubulures et les membranes d’ECMO ont déjà été conduites in vitro, préalablement à ce projet.
Réduction
Différents tests statistiques ont été réalisés afin de démontrer que 10 animaux seront nécessaires dans chaque groupe pour observer un effet sur les paramètres pharmacocinétiques. Ce nombre est le plus faible possible pour conduire le projet présenté.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants (méthadone 1mg/kg/IM). En cas de signes de douleur pendant la procédure chirurgicale (tachycardie, élévation de la pression artérielle, etc.) une nouvelle administration de méthadone sera administrée. En cas de signe de réponse autonome à la douleur, réfractaire à l’administration d’antalgiques, un arrêt prématuré de la procédure sera envisagé.
Choix des espèces
Le modèle porcin présente de grandes similitudes avec l’homme au niveau anatomique, physiologique et biochimique concernant le système cardiovasculaire, le tractus gastro-intestinal, le foie, les surrénales, la peau et le rein. Le volume vasculaire moyen, le débit cardiaque ainsi que les troncs artériels et veineux sont compatibles avec les circuits d’ECMO et les canules de diamètre important. Cela en fait un modèle fréquemment retrouvé dans la littérature. De plus, ces similarités en font également un modèle fréquemment utilisé pour les études de pharmacocinétique et de toxicologie en vue d’une extrapolation des données animales à l’homme. C’est pour l’ensemble de ces raisons que nous avons utilisé le modèle porcin pour réaliser notre étude. Porcs à maturité sexuelle de 30 à 35 kg car ce poids est utilisé pour les modèles d'arrêt cardiaque chez le porc.