Système cardiaque

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, des injections répétées et, pour 378 d'entre elles, des séances d'irradiation cérébrale, pour tester une molécule antioxydante seule ou avec la radiothérapie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids, de motricité et de sensibilité, et que l'irradiation dégrade l'état général, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Il affirme que les modèles in vitro ne peuvent pas reproduire les tumeurs multi-compartimentales et juge le modèle in vivo "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’impact de la modulation du métabolisme de l’interactome des espèces réactives (RSI) au sein de différents modèles murins de glioblastome (GBM) (immuno-compétent et immuno-déficients). En effet une meilleure compréhension de ce métabolisme permettrait de mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques qui viendraient compléter ou améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin de trouver de nouvelles approches pour le traitement du GBM en cherchant notamment à avoir un effet propre du traitement sur la tumeur mais aussi un effet sur la radiorésistance. Le projet consiste à étudier l’effet d’une molécule innovante aux propriétés antioxydantes « SOD-like » sur différents modèles murin in vivo de GBM. Cette molécule va également être évaluée en complément de la RT afin de voir si elle peut présenter des effets radio-sensibilisants. Des études préliminaires in vitro ont permis de déterminer que l’administration de ce traitement « SOD-like » couplé ou non à de la RT permettait de réduire significativement le nombre de cellules U251-MG après irradiation des cellules. Ces résultats in vitro étant encourageants, l’étude in vivo a pour but de vérifier les effets de ce traitement sur un modèle murin immuno-compétent présentant un microenvironnement complet de la tumeur et sur des modèles murins immuno-déficients présentant un microenvironnement partiel mais permettant l’étude de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le potentiel thérapeutique et radio-sensibilisant d’une molécule innovante « SOD-like ». Il a également pour but d’apporter de nouvelles connaissances sur le métabolisme du RSI dans différents modèles de GBM. Sur le long terme cet apport d’informations à la communauté scientifique va permettre de tester de nouvelles cibles thérapeutiques dans le domaine des tumeurs cérébrales permettant d’améliorer et de compléter les traitements utilisés de façon conventionnelle en clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 756 animaux sont concernés. - Injection intra-péritonéale (animal vigile): 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole ; 5 minutes maximum par animal, les 756 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy espacées de 48h (Groupe A), ou sur 3 jours consécutifs (Groupes B, C, D) : 15 minutes maximum par animal, 378 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. Toutefois, ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir la meilleure molécule SOD-like mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisés des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe pour les groupes A, B et C. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe de traitement pour obtenir une différence significative en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. En raison d’une certaine variabilité observée sur les différents modèles d’injection au sein de l’équipe nous estimons que le nombre d’animaux par sous-groupe de traitement doit être augmenté à 10 animaux par sous-groupe. Ce nombre de 10 animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Aucune simulation statistique n’a pu être réalisée pour le groupe D car les cellules ne sont pour l’instant pas en notre possession. D’après l’expertise de notre laboratoire, les cellules PDX présentes généralement une variabilité inter-individuelle assez importante. Pour cette raison, nous estimons un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement maximum.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée retenue pour réaliser ce travail est la souche Swiss Nude. C’est une souche de souris déficiente en lymphocytes T, mais présentant des lymphocytes B et des cellules tueuses naturelles (NK). Elle est particulièrement préconisée pour les études s’intéressant au développement du GBM d’origine humaine. Lorsque les cellules tumorales sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié. Le choix de la souris se justifie dans ce projet car cette espèce permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles sont bien caractérisés au sein du laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est induit et un traitement au tamoxifène est administré, sans recours à l'analgésie ni à l'anesthésie que le porteur écarte pour ne pas perturber le développement embryonnaire, afin d'étudier les malformations cardiaques chez des souris génétiquement prédisposées. Le porteur indique que le tamoxifène peut être délétère voire mortel pour les femelles gestantes et provoquer des défauts de développement des embryons. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Objectifs

Lors de la grossesse, le tabac, le diabète, l’obésité et l’âge de la mère sont associés à un risque accru d’avoir un enfant présentant une malformation cardiaque. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal compris. Les facteurs épigénétiques induits par les changements environnementaux influent profondément sur l’occurrence et le spectre des malformations chez l’homme et les modèles animaux. Par conséquent, une compréhension détaillée de ces facteurs et les altérations génétiques sous-jacentes est cruciale pour un meilleur diagnostic. Les 3 formes d’hyperglycémie maternelle (diabète de type I, II, gestationnel) sont associées à diverses malformations cardiaques congénitales notamment des anomalies de latéralité (hétérotaxie), des anomalies de type conotroncale (ventricule droit à double issue, transposition des grandes artères, tronc artériel commun, ventricule unique), des défauts de septation des cavités cardiaques et d’hypertrophie cardiaque. Ce projet a pour but d’étudier l’effet du diabète pre gestationnel sur le développement embryonnaire de souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.

Bénéfices attendus

Le diabète prégestationnel chez la mère augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. La prévalence du diabète prégestationnel (type 1 et 2) a d'ailleurs presque doublé au cours des dernières années avec une tendance à augmenter encore plus. Cependant, les mécanismes par lesquels les altérations de l'homéostasie du glucose maternel perturbent le développement cardiaque reste encore largement incertain. Par conséquent, le but de ce travail proposé est d'acquérir une meilleure compréhension des processus compromettant le développement cardiaque dans les cardiopathies induites par le diabète. Cette connaissance nous permettra d'avoir une meilleure prédiction des risques et la possibilité d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées et de prévention. De plus, en utilisant le modèle de méthylation de l'ADN dans le sang, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant à un développement cardiaque perturbé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux suivantes : injection sous cutanée et prélèvement sanguin de 10 microlitres au niveau de la queue..L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans cette étude, nous n’avons pas recours à l’administration d’analgésiants et anesthésiants, une procédure pouvant impacter sur le développement embryonnaire compte tenu de l’interaction gènes-environnement et des effets épigénétiques sous-jacents. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau sera remplacée par une eau enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimental. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.

Impact sur les animaux

Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’injection de Tamoxifène peut avoir un effet délétère voir potentiellement mortel pour les femelles gravides si l’administration a lieu en début de gestation. L’administration de Tamoxifène durant la gestation est associée à des défauts de développement du placenta avec pour conséquences des défauts de formation des embryons. Des défauts embryonnaires peuvent aussi être directement liés à l’exposition au Tamoxifène. Bien qu’aucun défaut cardiaque n’ait été décrit à ce jour nous prévoyons d’inclure des groupes supplémentaires afin d’exclure l’impact du Tamoxifène sur l’apparition d’anomalies du coeur et n’envisageons pas d’administration pendant la gestation mais prévoyons une seule injection 7 jours avant la mise en accouplement, à ce stade d’injection le tamoxifène n’aura pas d’effet délétère.

Devenir

Tous les animaux entrant dans cette procédure seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. 810 (540 en procédure 1, 270 en procédure 2) correspond au nombre minimum d’animaux à utiliser afin d’obtenir des données scientifiquement robustes sans augmenter inutilement la souffrance infligée aux animaux. Il s’agit d’une analyse de biologie fondamentale visant à observer l’apparition potentielle d’un phénotype dans un contexte donné et de caractériser ce phénotype. Nous n’utilisons donc pas d’approche statistiques.

Raffinement

Le modèle animal de diabète pre gestationnel qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et est un excellent modèle au regard de la pathologie humaine. Par ailleurs, le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 microlitres par animal. Afin d'assurer le bien-être des animaux, nous respecterons la réglementation européenne concernant la densité d'animaux par cage et les cycles d’éclairage diurne. Les souris seront au nombre de 5 maximum par cage de 542 cm2 afin de respecter leur instinct grégaire. L’environnement sera enrichi à l’aide de dômes en cartons et de bandelettes de kraft. Les reproducteurs ne seront pas mis en accouplement dans la semaine suivante leur déménagement de pièce ou avant 8 semaines d’âge. Les mères auront au maximum trois portées en production et nous ferons le maximum pour que ces portées ne soient pas immédiatement successives. Bien que le protocole soit relativement peu invasif, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Avant chaque procédure, nous nous assurerons que l’animal présente un bon état général. Après l’injection de tamoxifène, nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection au site d’injection. Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’animal pourra être hydraté par injection intra péritonéale de solution saline. Pour limiter leur stress, nous doublerons l’enrichissement (bandelettes de kraft et maisonnettes en carton).

Choix des espèces

Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par une hyperglycémie maternelle. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes Kir6.2 et Nkx2.5 chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Ce projet utilisera des femelles âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats de souche ZSF1, sélectionnés pour développer une insuffisance cardiaque, sont anesthésiés deux heures pour recevoir un produit de contraste et une imagerie du cœur par ultrasons, avant d'être euthanasiés pour prélever le cœur. Le porteur décrit surtout un stress léger à l'introduction en chambre d'induction et situe les atteintes du côté de la pathologie développée par les animaux. Il affirme que la complexité du système vasculaire empêche de mettre au point cette méthode sans rats, et présente ce marqueur d'imagerie comme un futur outil clinique.

Objectifs

La circulation coronarienne est responsable de la perfusion du myocarde. Les modifications du débit coronarien ont des conséquences graves sur les performances du cœur, comme dans l’infarctus du myocarde. À ce jour, seules les grosses artères épicardiques de l’ordre du millimètre peuvent être visualisées in vivo chez l'homme et l’animal par les techniques d'angiographie telles que les rayons X, la tomodensitométrie ou l’IRM. Ces dernières années, nous avons démontré au laboratoire la faisabilité de la microscopie ultrasonore de localisation. Cette technique d’imagerie permet de visualiser en profondeur dans les organes les flux sanguins dans les micro-vaisseaux de quelques dizaines de microns de diamètre. Au-delà de la simple visualisation,d'autres nouvelles techniques échographiques de mesure des flux sanguins permettent de quantifier les vitesses de flux dans les vaisseaux, ce qui est crucial pour évaluer la fonction des micro-vaisseaux. Nous avons récemment amélioré cette technique pour faire de l’imagerie 3D, ce qui permet de visualiser et de quantifier les flux au niveau d'un organe entier tel que le cerveau et le cœur. Une première étude sur des rats témoins a démontré la faisabilité de la mesure des diamètres et des flux des vaisseaux de la microcirculation ainsi que leur réactivité au cours d’une vasodilatation. Nous voudrions maintenant mettre en évidence une différence de réactivité et d’anatomie de ces vaisseaux dans l’insuffisance cardiaque. Cette pathologie a touché 40 millions de personnes en 2015 dans le monde. La moitié des patients sont atteints d’une forme appelée insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICEP) très difficile à diagnostiquer. Cependant, des altérations de coronaires apparaissent très tôt et pourraient être un marqueur précoce de l’ICEP car Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique des altérations du muscle cardiaque. Nous utiliserons une souche de rats mutants ZFS1 obèses développant cette pathologie au cours de leur croissance. Avec ce modèle d’imagerie microscopique non invasif, nous pourrons mettre en évidence les effets précoces du développement de l’insuffisance cardiaque sur la microcirculation dans le cœur. Pour ce projet nous prévoyons d’utiliser 20 rats sur une durée de 5 ans. Il est important de noter que le projet s'inscrit dans la démarche des 3R.

Bénéfices attendus

Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique de l’insuffisance cardiaque. Nous pensons que cette technologie permettant l’exploration des flux myocardiques des petits vaisseaux de quelques dizaines de micron mettra en évidence des différences significatives chez les animaux insuffisants cardiaques. Ces données recueillies sur l’animal entier présentent un intérêt thérapeutique majeur qui pourront être utilisées en clinique dans le futur comme un marqueur précoce du développement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Les interventions auront toutes lieu sous anesthésie générale pendant 2 heures. Pour chaque animal, Il y aura : - Injection intraveineuse de produit de contraste et d'adénosine ou de sérum physiologique. -Tonte de la peau au niveau de la cage thoracique. - Positionnement d'une sonde échographique en contact de la peau sur la cage thoracique. - Euthanasie à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Au cours des expérimentations, une manipulation pour introduire le rat dans la chambre d’induction peut engendrer un léger stress de l’animal. Un soin particulier sera donné dans la surveillance des rats pendant leur hébergement notamment pour les rats développant une insuffisance cardiaque. A part cela, les opérations auront lieu sous anesthésie générale. Les prélèvements de coeur seront réalisés après euthanasie du rat.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés a la fin de la procédure. Un prélèvement de cœur sera effectué afin de réaliser une analyse quantitative du degré de l'insuffisance cardiaque de l'animal.

Remplacement

Cette étude a déjà été mise au point au cours de l’étude coronarographie 3D. La complexité du système vasculaire ne nous permettait pas de mettre au point cette méthode sans utiliser des rats. Dans cette étude des mécanismes de développement de l’insuffisance cardiaque nous sommes obligés d’utiliser des modèles qui sont très spécifiques. Seule L’application de cette méthode qui est nouvelle sur ce modèle nous permettra de découvrir les mécanismes du développement de la maladie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de cette étude dans la mesure où nous utiliserons les mêmes conditions expérimentales que l’étude « Coronarographie par ultrasons en trois dimensions ». Les conditions expérimentales sont parfaitement maîtrisées et nous n’aurons donc pas besoin d’animaux pour la mise au point. Pour cette étude, une comparaison entre deux groupes sera effectuée. Un groupe témoin composé de 10 rats sains et un groupe composé de 10 rats insuffisants cardiaques. Une deuxième comparaison sera effectuée entre les résultats avant et après ajout d’agents pharmacologiques sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront reçus au moins une semaine avant la procédure et seront manipulés régulièrement afin de les habituer et éviter le stress le jour de la procédure. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats pour favoriser leurs comportements sociaux dans un environnement enrichi (tunnel en carton et bâton en bois) avec un accès illimité en eau et nourriture. Durant l’opération sous anesthésie générale, la température et les constantes de l’animal (température corporelle, fréquences respiratoire et cardiaque et saturation d’oxygène) seront contrôlés et toute anomalie conduirait à l’ajustement immédiat des paramètres de l’anesthésie, si les modifications n’amélioraient pas l’état de l’animal, la procédure serait arrêtée et l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

Les développements effectués sur les coronaires de rats dont la structure est élaborée et complexe pourront être utilisés de façon fiable sur les études futures chez l’homme. La souche de rats ZSF1 répond aux critères d’exploration de la méthode, il n’y aura pas de mise au point supplémentaire à effectuer. Des rats adultes seront utilisés afin de s’assurer que l’imagerie est faite sur des cœurs pleinement développés.