Système nerveux

Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.

Impact sur les animaux

L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.

Raffinement

La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.

Une partie des 1 220 souris utilisées sont des femelles gestantes, dont l'abdomen est ouvert sous anesthésie de 45 minutes pour injecter des particules dans le cerveau de leurs embryons, une injection de cinq secondes qui peut tuer certains d'entre eux. D'autres souris adultes restent anesthésiées deux heures pour une chirurgie du cerveau de quinze minutes, et des souriceaux sont anesthésiés par hypothermie pendant dix minutes avant une injection. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et une autre partie du projet consiste à induire chez des souris témoins les mutations responsables de la microcéphalie pour en caractériser les défauts. Les femelles gestantes sont tuées pour prélever leurs embryons, et les embryons, souriceaux et adultes ayant subi une procédure sont tués pour prélèvement d'organes et analyses génétiques.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse au développement du cerveau. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et de différentiation cellulaire peuvent entraîner des malformations cérébrales. Des études préliminaires nous ont permis de mettre au point des particules (PLA) ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division du cerveau embryonnaire. Ce projet vise (i) à déterminer si ce type de PLA est pertinent pour développer une approche de thérapie génique au cours du développement. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des PLA à compenser la perte de ce gène et corriger les anomalies de développement du cerveau qui lui sont associées. Nous voulons également (ii) utiliser cet outil pour étudier un autre type de malformation cérébrale, la microcéphalie, en induisant des mutations du gène responsable de cette pathologie chez des souris contrôles, afin de mieux caractériser les défauts liés à la perte de ce gène.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation de PLA pour corriger une anomalie génétique constitue une approche thérapeutique valide. Le deuxième bénéfice est de comprendre les défauts développementaux qui apparaissent après une mutation d'un gène entraînant une microcéphalie chez l'humain.

Procédures

Des animaux adultes subiront une injection dans la queue d'une durée de 20 secondes. Des femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Des animaux subiront des injections d’une minute 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection d’une durée de 5 secondes. Des animaux adultes subiront une anesthésie de 2 heures lors d’une chirurgie d'une durée de 15 minutes qui permettra l’injection des PLA dans le cerveau d’une durée de 4 minutes et des points de suture. Des souriceaux subiront une anesthésie par hypothermie de 10 minutes, et une injection d’1 minute. Des animaux subiront, au moment de la mise à mort, une anesthésie et analgésie générale terminale.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent un stress léger et une douleur légère de quelques secondes. L’induction de l’anesthésie gazeuse lors des chirurgies entraîne un stress moyen de quelques secondes, une hypothermie, un déssèchement des yeux et une déshydratation. Les injections intra-cérébrale in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons. L'anesthésie pour les injections stéréotaxique entraîne un stress léger de quelques secondes, une hypothermie et un déssèchement des yeux.

Devenir

Les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvement des embryons. Les embryons, nouveaux nés et animaux adultes qui ont subi une procédure sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses génétiques et phénotypiques.

Remplacement

Les questions scientifiques posées dans le cadre de ce projet concernent le développement du cortex cérébral, un processus complexe qui ne peut être étudié que sur des cerveaux prélevés sur des embryons de mammifères. A l’heure actuelle, aucun modèle de culture cellulaire ne permet de reproduire l’ensemble des étapes de développement cortical ni d’en mimer la diversité cellulaire et les interactions qui s’y déroulent. Le modèle murin, en particulier la souris, constitue une référence dans ce domaine en raison de la richesse des outils génétiques disponibles et de la caractérisation fine des processus qui permettent le développement du système nerveux, ce qui en fait un modèle de choix pour la conduite de ces recherches.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté et en groupe social avant et après la procédure. Lors des actes chirurgicaux les souris, placées sur une plaque chauffante, seront anesthésiées et recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux et du PBS chauffé à 37°C sera administré aux femelles afin de prévenir la déshydratation. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Une expérimentation est menée sur des embryons entre les jours embryonnaires E12.5 et E15.5, ce qui correspond aux fenêtres d’expression de nos gènes d’intérêt. Une expérimentation se déroulera sur des animaux adultes, car la question à laquelle veut répondre cette expérimentation ne nécessite pas de stade de développement particulier. Des animaux utilisés dans une autre expérimentation seront injectés au jour post-natal P0 et mis à mort à P15 et P30. Cela nous permet d’étudier les effets de notre traitement sur les défauts qui apparaissent à ces stades.

Une seconde chirurgie de deux à quatre heures trente, après une première d'une heure : 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées. Le rythme respiratoire de chacune est manipulé, ce qui leur impose une physiologie inhabituelle, et certaines reçoivent jusqu'à sept administrations d'agents anxiogènes ou panicogènes utilisés en psychiatrie. Les séances d'enregistrement, jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, se déroulent sur souris éveillée maintenue en contention, et une partie exécute en plus des tâches d'une à trois heures pendant plusieurs mois, portant sur la perception de la respiration, la prise de risque et l'apprentissage. Le porteur prévoit des points limites gradués à partir d'une grille de score, appliqués au suivi après chirurgie et à l'inconfort pendant les tâches, et annonce des doses minimales d'agents pharmacologiques.

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux. MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs ou alors à deux dans une cage avec séparateur pour éviter l'isolement si les animaux doivent être séparés.] Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Jusqu'à six séances d'imagerie IRM ou SPECT-PET-CT sur une même souris, et jusqu'à quatre actes expérimentaux de trente minutes à une heure, tel est le programme des 640 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Le protocole consiste à injecter des cellules de glioblastome dans le cerveau, à créer une cavité d'exérèse pour reproduire les conditions d'une récidive, puis à administrer une radiothérapie interne sur place. Sans traitement, l'injection de cellules tumorales dégrade l'état général et peut tuer la souris au bout de trente jours. Deux souches sont utilisées, des C57BL/6JRj pour les greffes de cellules murines et des CB17-SCID immunodéprimées pour les cellules humaines, le porteur indiquant que ces dernières ne permettent pas d'étudier le rôle de l'immunité.

Objectifs

Le glioblastome est une tumeur cérébrale particulièrement agressive, son incidence de 3,3/100 000 est en augmentation, avec une multiplication par 4 sur les 10 dernières années, en faisant un véritable problème de santé publique. Une étude approfondie des caractéristiques tumorales et la découverte de potentielles nouvelles cibles pour le traitement dans différents modèles de glioblastome sont essentielles. Le projet consiste à mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques de radiothérapie interne aussi bien pour traiter les tumeurs ou leur récidive. Ces nouvelles stratégies seront basées sur des molécules qui ont été testées en amont lors d’expériences in vitro et qui méritent une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique en ce qui concerne les glioblastomes ou leur récidive dans le but d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes à 1 heure) telles que l'injection de cellules tumorales, la création de cavité d’exérèse, l’administration de thérapies spécifiques dans le cerveau et d’un suivi par imagerie IRM / SPECT-PET-CT. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 4. Le nombre d’IRM / SPECT-PET-CT maximal réalisé sur un même animal est de 6.

Impact sur les animaux

L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détérioration de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour réaliser des prélèvements.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but le ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place ou dans des conditions mimant la récidive pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par des vecteurs sur tumeur en place ou dans des cavités d’exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Il n'y a d’ailleurs pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoïdes, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales in vitro ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables. L'utilisation de l'imagerie pré-clinique SPECT-PET-CT a son importance en ce qui concerne l'éthique puisqu'il permet de réduire le nombre d'animaux avec un suivi longitudinal où le même animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par la SBEA local. Pour chaque procédure, un suivi quotidien du comportement de l'animal et de sa cicatrisation est effectué suite à la chirurgie. Le suivi de la perte de poids sera réalisé 2 ou 3 fois/semaine puis quotidiennement à partir d’environ 20 jours après la chirurgie en rapport avec la croissance tumorale. Un suivi IRM ou SPECT-PET-CT est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM ou SPECT-PET-CT hebdomadaire.

Choix des espèces

Pour ce projet, il est nécessaire de travailler avec la souris car il est prévu d’implanter des lignées cellulaires murines (modèle syngénique de gliobastome avec la souche C57BL/6JRj). Pour les modèles xénogéniques de gliobastome, des lignées cellulaires humaines seront implantées et nécessiteront cette fois-ci la souche CB17-SCID. La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser des cellules murines mais aussi humaines, donc d’utiliser deux souches différentes de souris, est de pouvoir réaliser à la fois des tests à partir de cellules humaines de glioblastome mais également de pouvoir étudier le rôle de l’immunité qui n’est pas possible d'évaluer avec les modèles de glioblastomes humains. Les souris seront utilisées de 8 à 12 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

340 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de quarante-cinq minutes en moyenne pour l'implantation d'un dispositif d'auto-administration de cocaïne, puis entre vingt-cinq et quatre-vingt-une séances de trois heures, cent vingt d'entre eux étant en plus opérés du cerveau pendant environ une heure. Certaines séances sont associées à de brèves expériences aversives destinées à provoquer l'arrêt de la consommation, le porteur décrivant chez le rat un sevrage "extrêmement faible". Il présente le choix du rat comme "une sorte de compromis", cette espèce étant selon lui assez proche de l'humain pour constituer un "modèle animal valide" et assez éloignée "par rapport à d'autres espèces plus sensibles" sur le plan éthique.

Objectifs

Parmis les personnes développant une addiction à la cocaine, une partie significative parvient à atteindre l’abstinence. Notamment, des événements négatifs intenses (accidents, maladies) peuvent constituer des signaux clés qui font prendre conscience aux individus qu’ils sont « allés trop loin ». Cependant, l’abstinence met du temps à s’établire et la survenue d’événements négatifs est risquée. Aussi, trouver des thérapies efficaces est nécessaire. Les objectifs de ce projet sont de modéliser l’abstinence induite par des événements négatifs et d’en étudier les bases cérébrales. Nos travaux antérieurs montrent que des rats ayant une prise soutenue de cocaine arrêtent quasi-instantanément de prendre la drogue lorsqu’elle est associée à un événement négatif. Cependant, cette abstinence est de courte durée et beaucoup de rats rechutent lorsque les conséquences négatives disparaissent. Selon des témoignages et données issus de la littérature, l’apparition cyclique de conséquences négatives aurait un effet cumulatif qui pourrait conduire à l’abstinence. Aussi, notre protocole testera l’effet de l’exposition cyclique à des conséquences négatives (1 fois tous les 10 jours) sur l’abstinence volontaire. Nous prévoyons que la majorité des rats arrivera à une abstinence durable après un maximum de 5 cycles. Une certaine variabilité est cependant attendue avec des individus atteignant l’abstinence après 1, 2, 3, 4 ou 5 cycles. Aussi, nous prélèverons les cerveaux des rats dès qu’ils présenteront une abstinence durable. L’évaluation post mortem du cerveau permettra d’identifier les zones cérébrales associées à l’abstinence volontaire dans les différents sous-groupes de rats. Après avoir isolé les régions cérébrales associées à l’abstinence volontaire, nous les activerons ou désactiverons temporairement pour confirmer leur rôle causal dans ce comportement. Afin de mieux comprendre l’engagement/désengagement progressif de ces régions avec l’abstinence, les signaux cérébraux, dans ces régions, seront également mesurée en direct durant le comportement. Enfin, pour évaluer les spécificités biologiques associées à l’abstinence, les régions cérébrales clés seront prélevées chez les différentes populations de rats pour des études biologiques approfondies.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de l’abstinence de la cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires au moment précis où les individus développent une abstinence. A moyen terme, les résultats issus de ces expériences seront très important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques de l'addiction. En effet, ces résultats permettront d'orienter de futures études d'imagerie cérébrale chez l'humain et permettront d'affiner la compréhension des mécanismes nécessaires à la mise en place de l'abstinence.

Procédures

Etant basé sur la prise de cocaine, la totalité des animaux (n=340) sera soumise à une chirurgie permettant l'auto-administration de cocaine (45 minutes en moyenne). Les animaux seront sous anesthésie chimique et sous analgésie. De même, l'ensemble des rats sera soumis à des tests comportementaux comprenant des séances d'auto-administration de cocaine de 3 heures. Suivant les groupes et les phénotypes (rechute ou abstinence), les rats suivront entre 25 et 81 séances d'auto-administration. Certains animaux (n=120) seront égelement soumis à une chirurgie du cerveau (1 heure en moyenne). Les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont principalement celles associées aux différentes chirurgies, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Le cas échéant, les douleurs post opératoire seront minorés par des antalgiques durant quelques jours. Afin de mener à l'abstinence, certaines séances d'auto-administration seront associées à de brèves (0,5 sec) expériences aversives légèrement stressantes, mais non douloureuse, dont l'intensité ne dépassera pas le degré modéré. Avec l'abstinence, les animaux cesseront rapidement et durablement de consommer de la cocaine induisant un sevrage. Cependant, il est à noter que comme pour la majorité des psychostimulants, la cocaine entraine un sevrage extrêmement faible chez le rat.

Devenir

A l'issu de chacune des procédure, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour des études post mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (jeunes adultes, mâles et femelles). Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologique invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe de certains processus cérébraux dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou informatiques valides et réalistes permettant d’étudier les processus cérébraux avec un niveau de complexité suffisant ; 3) contrairement à la dépendance physique, l’addiction est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ; 4) Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider des mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions.

Réduction

Ce projet s'intéresse à la présence de deux sous groupe d'animaux : ceux qui s'abstiennent et ceux qui rechutent. Etant donné que tous les animaux ne montreront pas une prise stable de drogue, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 10 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes sur le plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 6 individus dans chacun des sous groupes (abstinence et rechute). Par ailleurs, et si nécessaire, certains animaux qui ne montreront pas une prise stable de drogue mais qui montrent tous les signes de bonne santé, pourront être utilisés pour des tests chirurgicaux (optiminsation de certains paramètres). Dans ce cas, la procédure de chirurgie sera similaire en tous points à celle décrite dans ce projet. Ceci permettra, de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection de solution saline pour favoriser la réhydratation. Pendant une période de récupération de 7 jours les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter rapidement d'éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et d'y remédier rapidement. Suivant un arbre décisionnel établi, la décision de soins conservatoires sera appliquée en fonction du type et de l'intesité de l'inconfort et/ou de la douleur. Si la prise en charge ne fonctionne pas après 5 jours de traitement ou si une aggravation rapide est observée, la décision de mise à mort sera prise rapidement par le porteur du projet. Avant le début des expériences, les rats sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales afin de limiter le stress et l’anxiété. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de l’arrêt de la procédure/du test. Ces critères sont listés dans une grille d'observation ayant plusieurs niveau d'intervention selon le niveau de douleur (de léger à sévère). Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis dans la musure où cette espèce est suffisamment proche de l’homme du point de vue de son évolution (mammifère, divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles. Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.