Système nerveux

Tuées à la fin de chaque procédure pour des prélèvements de tissus, 3 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur la peau des applications répétées de substances qui provoquent une inflammation ou abîment la barrière cutanée, jusqu'à dix applications en cinq jours pour la peau sèche, et jusqu'à neuf applications sur trois semaines pour un autre protocole d'induction. Le porteur indique que ces souris peuvent présenter des lésions cutanées, des rougeurs, un épaississement de la peau et des grattages répétés, avec un inconfort transitoire ou persistant, et qu'elles passent jusqu'à six séances de tests de grattage, de stimulation cutanée légère et d'exploration, de dix à quarante-cinq minutes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures et les tissus isolés ne reproduisent pas ensemble l'inflammation, l'activation des nerfs et le grattage, et qu'il est donc "nécessaire d'utiliser des modèles animaux permettant d'étudier la démangeaison dans un organisme entier".

Objectifs

La démangeaison est une sensation très fréquente dans les maladies de peau. Elle pousse à se gratter et peut devenir difficile à supporter lorsqu’elle dure longtemps. Dans ce cas, elle peut gêner le sommeil, augmenter le stress et modifier le comportement. Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi la peau démange et pourquoi cette sensation peut devenir chronique. Nous allons étudier le rôle des nerfs qui transmettent le signal de démangeaison depuis la peau, ainsi que celui de cellules de soutien présentes dans le système nerveux. Ces cellules peuvent influencer la façon dont le signal de démangeaison est traité. L’objectif est de comprendre comment ces différents acteurs participent à l’apparition, au maintien et aux conséquences de la démangeaison.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes neurobiologiques du prurit et sur la manière dont les signaux provenant de la peau sont traités par le système nerveux. Il apportera également des informations nouvelles sur l’impact du prurit chronique sur le comportement et l’état émotionnel. À moyen et long terme, ces connaissances pourront contribuer à orienter la recherche dans le domaine du prurit chronique et des maladies cutanées associées, sans constituer une évaluation directe de traitements chez l’animal.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. Injections Les animaux recevront des injections répétées selon les procédures La durée de chaque injection est d’environ 5 à 10 secondes. Selon la nature de l’injection, les gestes sont réalisés sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse brève. Le nombre maximal d’injections pour un même animal est de 6 injections au total, réparties sur une période pouvant aller jusqu’à environ 4 semaines, dans le cas d’une injection initiale suivie, après un délai nécessaire à son action, d’injections répétées d’un produit permettant de moduler l’activité de cellules ciblées. Dans les autres procédures, le nombre d’injections est inférieur ou égal à 4, réparties sur 3 jours à 2 semaines selon le protocole. 2. Applications cutanées répétées Dans les modèles de dermatite chronique, les animaux sont soumis à des applications cutanées répétées de substances induisant une inflammation ou une altération de la barrière cutanée. Chaque application a une durée d’environ 10 à 30 secondes et est réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin de limiter le stress lié à la contention. Le nombre maximal d’applications cutanées est de 10 applications sur 5 jours pour le modèle de peau sèche, réalisé deux fois par jour. Pour les modèles de dermatite induits par des agents inflammatoires ou allergènes, le schéma le plus long correspond au modèle HDM, avec 9 applications réparties sur 3 cycles, soit environ 3 semaines. 3. Manipulations comportementales et observations Les animaux sont soumis à des tests comportementaux non invasifs, incluant l’observation du comportement de grattage, des stimulations cutanées légères et des tests d’exploration. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles et ont une durée comprise entre 10 et 45 minutes par session, selon le test. Le nombre maximal de sessions comportementales pour un même animal est de 6 sessions. Ces sessions sont réparties sur la durée de la procédure, jusqu’à environ 3 semaines pour les modèles les plus longs, avec habituation préalable lorsque nécessaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont principalement liées à l’induction des modèles de prurit, aux administrations de produits par différentes voies d’administration, aux manipulations expérimentales associées et aux évaluations comportementales répétées. Dans les modèles de prurit chronique associés à une inflammation cutanée, les animaux peuvent présenter des lésions cutanées locales, des rougeurs, un épaississement de la peau et des comportements de grattage répétés, associés à un inconfort transitoire ou persistant dont l’intensité dépend du modèle utilisé et de la durée d’exposition. Les modèles de prurit aigu peuvent entraîner une réponse transitoire de grattage et un inconfort de courte durée, sans inflammation chronique. Les administrations de produits peuvent entraîner un inconfort transitoire lié à la contention, au geste d’administration ou à l’effet attendu du produit administré. Des réactions locales au point d’administration peuvent également survenir, incluant une rougeur, un gonflement, une irritation, une inflammation locale ou, plus rarement, une infection ou une ulcération. Certaines interventions expérimentales visant à moduler l’activité neuronale et/ou gliale peuvent entraîner une modification transitoire de l’activité des cellules ciblées, pouvant s’accompagner d’un inconfort ou d’une douleur de courte durée selon la population cellulaire concernée et la modalité utilisée. Les évaluations comportementales peuvent générer un stress modéré lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel environnement ou à la répétition des tests. Elles sont réalisées sur des durées limitées, avec des méthodes non invasives et non nociceptives.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines démangeaisons apparaissent, pourquoi elles peuvent devenir chroniques, et comment elles peuvent modifier le comportement des animaux, par exemple en augmentant le stress ou en altérant l’humeur. La démangeaison ne dépend pas seulement de la peau : elle implique aussi les nerfs qui transmettent le signal depuis la peau, la moelle épinière, des cellules de soutien du système nerveux et des cellules immunitaires. Ces différents éléments interagissent entre eux, ce qui rend le phénomène difficile à reproduire avec des méthodes uniquement réalisées en boîte de culture ou sur des tissus isolés. Ces approches alternatives peuvent apporter des informations utiles, mais elles ne permettent pas de reproduire en même temps une inflammation de la peau, l’activation des nerfs responsables de la démangeaison, l’intervention des cellules de soutien du système nerveux, et l’apparition de comportements comme le grattage ou les changements liés à l’état émotionnel. Pour répondre aux objectifs du projet, il est donc nécessaire d’utiliser des modèles animaux permettant d’étudier la démangeaison dans un organisme entier, depuis la peau jusqu’aux comportements observables.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été défini de manière à obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Une veille bibliographique sera réalisée tout au long du projet afin d’éviter la duplication d’expériences déjà publiées et d’adapter les choix expérimentaux aux connaissances disponibles. La stratégie de réduction repose d’abord sur l’utilisation d’un modèle de référence. Ce modèle permettra de valider les approches expérimentales nécessitant des groupes contrôles complets et de vérifier que les effets observés sont interprétables. Une fois ces validations réalisées, les autres modèles seront étudiés avec des plans expérimentaux allégés, limités aux comparaisons nécessaires, afin d’éviter la répétition de groupes contrôles redondants. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes contrôles seront mutualisés au sein d’une même procédure, en particulier lorsque les conditions expérimentales sont comparables. Cette organisation permet de réduire le nombre total de groupes tout en conservant des comparaisons valides. Pour les lignées génétiques, les croisements seront planifiés afin de maximiser l’utilisation des animaux produits. Les animaux présentant un génotype compatible avec les groupes expérimentaux ou contrôles prévus seront utilisés autant que possible, ce qui limite la production d’animaux excédentaires et le nombre de reproducteurs nécessaires. Lorsque plusieurs approches indépendantes répondent à une même question scientifique, elles seront d’abord limitées au modèle de référence. Leur extension à d’autres modèles ne sera réalisée que si les premiers résultats le justifient. Les effectifs reposent sur un minimum de 12 animaux par condition expérimentale, répartis en 3 répétitions indépendantes de 4 animaux par groupe. Les données seront analysées en regroupant ces répétitions, tout en vérifiant la cohérence des effets observés. Ce dimensionnement tient compte de l’expérience de l’équipe, de la variabilité attendue et de la nécessité de détecter des différences biologiquement pertinentes. Enfin, chaque animal sera inclus dans une seule procédure expérimentale et suivra une trajectoire complète au sein d’un modèle donné, afin d’éviter toute exposition cumulative inutile.

Raffinement

Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation d’au moins cinq jours dans une pièce dédiée, sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, séparés par sexe, à un maximum de cinq par cage de 500 cm², dans un environnement contrôlé. Les groupes seront maintenus aussi stables que possible afin de limiter le stress lié aux remaniements. Une attention particulière sera portée aux interactions sociales, notamment chez les mâles, afin de détecter précocement toute agressivité ou blessure. Un enrichissement systématique sera mis en place, comprenant une maison et du matériel de nidification. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour par le personnel de zootechnie ou par le personnel impliqué dans le projet. Le poids sera suivi régulièrement au cours des manipulations, notamment lors des phases de traitement ou d’induction des modèles. Les grilles de suivi clinique et les points limites spécifiques sont définis dans chaque procédure afin d’encadrer la surveillance, les mesures de soutien éventuelles et le retrait anticipé des animaux si nécessaire. Les manipulations expérimentales sont réalisées de manière à limiter le stress, la durée de contention et l’inconfort. Les gestes susceptibles d’induire une gêne transitoire ou nécessitant une contention prolongée sont réalisés sous anesthésie gazeuse brève lorsque cela est compatible avec les objectifs expérimentaux. Les volumes administrés sont limités au strict nécessaire et adaptés à la voie utilisée. Le matériel est choisi de manière appropriée afin de réduire au maximum les lésions tissulaires. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et aux gestes techniques mis en œuvre. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont encadrés et consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Enfin, une analyse rétrospective sera réalisée à l’issue des expériences afin d’identifier d’éventuelles possibilités d’amélioration des procédures et de réduction supplémentaire de la souffrance animale pour les études ultérieures.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie pour ce projet en raison de sa pertinence pour l’étude des mécanismes du prurit aigu et chronique et de ses conséquences comportementales. Des modèles murins validés permettent de reproduire différents contextes de prurit cutané, inflammatoire ou non inflammatoire, et d’étudier de manière intégrée les interactions entre la peau, les neurones sensoriels, les cellules gliales et la moelle épinière. La souris offre également l’accès à de nombreuses lignées transgéniques et conditionnelles permettant le ciblage spécifique de populations neuronales et gliales impliquées dans le prurit, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, des protocoles comportementaux standardisés et largement utilisés permettent d’évaluer de façon fiable le prurit et ses conséquences comportementales. Les animaux utilisés dans ce projet sont exclusivement des souris adultes (Mus musculus). Les procédures expérimentales sont réalisées à des stades de développement compatibles avec la maturité des systèmes nerveux, immunitaire et comportemental. De manière générale, les souris sont utilisées à partir de 6 semaines d’âge. Certaines manipulations préalables (approches génétiques, virales ou inductibles) peuvent être réalisées chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines, suivies d’un délai suffisant avant l’induction des modèles expérimentaux et les évaluations comportementales, afin de garantir une expression ou une recombinaison stable. Les modèles de prurit aigu et chronique ainsi que l’ensemble des évaluations comportementales sont réalisés chez des souris adultes, typiquement âgées de 6 à 12 semaines au moment des tests. Aucune procédure n’est réalisée chez des animaux en phase juvénile précoce ou néonatale.

Une solution de chlorure de fer ou d'aluminium est appliquée sur l'artère cérébrale moyenne, au terme d'une chirurgie de la tête de quinze à vingt minutes, pour provoquer l'occlusion de l'artère et un accident vasculaire cérébral. 924 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergées seules, avec cinq passages en IRM à 7 teslas jusqu'à quarante-cinq minutes et une batterie de trois tests comportementaux, non nommés, répartis sur trois semaines. Le porteur qualifie les déficits fonctionnels de "léger" à court et moyen terme et écrit que l'animal "peut aisément continuer à s'alimenter, s'abreuver et se fabriquer un nid", tout en décrivant des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion, et une mise à mort par dislocation cervicale en cas de dépassement des points limites. Toutes finissent ouvertes du ventre au thorax pour une ponction cardiaque, puis tuées pour le prélèvement du cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à une par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, BUCHETTE EN BOIS et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Le jour de l’induction de l’AVC (J0), les animaux seront pesés et installés dans une armoire ventilée permettant de maintenir leur rythme nycthéméral. Pendant l’opération chirurgicale induisant l’AVC ischémique, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en s.c ENTRE 30 MINUTES ET 1 HEURE AVANT LA PREMIERE INCISION CHIRUGICALE. L’ADMINISTRATION SERA REPETEE EN FIN DE JOURNEE DE FACON A PROLONGER LA DUREE D’ACTION JUSQU’AU LENDEMAIN MATIN OU UNE TROISIEME ADMINISTRATION SERA REALISEE. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection à la CHLORISEPTINE ET D’UNE INJECTION EN SOUS CUTANEE DE LUROCAINE (5mg/kg). La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris EN CAS d’HYPOTHERMIE. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et pendant les jours suivant l’opération chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Comprendre quels neurones du cortex relient une action à un but conduit à opérer 1 876 souris du cerveau, sous anesthésie générale, pendant soixante à quatre-vingt-dix minutes. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse histologique des neurones marqués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une à trois semaines de récupération, chacune passe jusqu'à dix séances de trente minutes où elle doit introduire le museau dans un orifice pour obtenir une récompense sucrée, sous restriction alimentaire destinée à entretenir son appétit. Le porteur qualifie ce geste d'"action non stressante" et annonce par ailleurs une perte de poids sur toute la durée du protocole, des douleurs post-opératoires et un isolement de trois semaines qui "peut être une source de stress".

Objectifs

Pour répondre à un besoin essentiel comme la faim ou la soif, un individu doit être capable d’identifier un objectif et de choisir les actions qui permettent de l’atteindre. Par exemple, lorsque l’on ressent la faim, on compare plusieurs possibilités (manger les restes disponibles ou commander un repas) ainsi que les actions nécessaires pour y accéder (aller au réfrigérateur, passer la commande sur son téléphone). Le but de cette étude est d’étudier les mécanismes cérébraux qui déclenchent une action orientée vers un but, pour mieux comprendre les troubles où ces comportements sont altérés, comme certaines formes d’impulsivité (addictions, trouble du déficit de l’attention) ou la baisse de motivation (dépression, bipolarité). Des travaux ont montré qu’une partie du cortex joue un rôle clé pour relier une action à un but, mais les mécanismes précis restent à identifier. Notre objectif est de déterminer quels groupes de neurones du cortex réalisent ces associations, quelles sont leurs caractéristiques moléculaires (pour développer de futurs traitements) et quel est leur mode d’activité électrique (pour servir de marqueur signant les dysfonctions). Pour cela, nous utiliserons des souris comme modèle animal. Les souris réaliseront une action non stressante : un nose-poke (introduire brièvement leur museau dans un petit orifice du mur), afin d’obtenir une récompense sucrée. Ce modèle permet de combiner l’étude de comportements dirigés vers un but avec l’utilisation d’outils génétiques permettant de marquer, enregistrer et manipuler précisément certains neurones, ce qui n’est pas possible chez d’autres espèces.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche apportera des connaissances essentielles sur la manière dont le cerveau génère un comportement volontaire, un mécanisme fondamental au cœur de nombreuses actions du quotidien. À court terme, il nous permettra de caractériser précisément les neurones activés lorsqu’un animal réalise une action orientée vers un objectif. Cette compréhension des circuits cérébraux impliqués sera rapidement accessible grâce aux premières publications issues du projet. Sur le plan clinique, les retombées concernent directement la santé mentale. Dans plusieurs troubles psychiatriques, tels que le trouble de déficit de l'attention et hyperactivité (TDAH), la dépression, l’addiction ou les troubles impulsifs, la prise de décision orientée vers un but est altérée : elle peut être mal dirigée, insuffisamment contrôlée ou désorganisée dans le temps. Ces difficultés peuvent aller à l’encontre des besoins exprimés par les personnes concernées. Comprendre en détail comment le cerveau structure une décision volontaire est donc primordial pour mieux expliquer l’origine de ces troubles, mais aussi pour identifier les mécanismes qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, ce projet offrira des bases solides pour développer des stratégies cliniques pour renforcer l’autonomie et la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une neurochirurgie réalisée sous anesthésie générale avec analgésie durant environ 60 à 90 minutes, qui sera suivie d’une période de récupération de 1 à 3 semaines. Après récupération, les animaux participeront à un maximum de dix sessions d’apprentissage à l’obtention de récompense, chacune d’une durée de 30 minutes. Après récupération, les animaux participeront à un maximum de dix sessions de conditionnement opérant (30 minutes chacune), où ils devront effectuer un nose poke pour obtenir une récompense sucrée. L’ensemble de ces procédures sera réalisé sous faible restriction alimentaire pour motiver l’appétit face aux récompenses. Dans la première procédure, chaque session d’apprentissage sera précédées d’une injection unique. Ces tests seront effectués par paires, avec une injection dans le ventre (peu douloureuse) administrée 20 minutes avant chaque session. Chaque injection dure environ 1 minute, et l’effet de la pharmacologie sur les neurones s’étend sur plusieurs heures. La durée totale du protocole pour chaque animal est estimée à environ un mois et demi, incluant la chirurgie, la récupération, les sessions comportementales et les injections. Aucun prélèvement n’est prévu sur les animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La restriction alimentaire mise en place entrainera une perte maîtrisée de poids sur les animaux sur la durée complète des procédures. Les chirurgies peuvent entraîner des douleurs, potentielles inflammation du site de chirurgie et un inconfort post-opératoire durant 1 à 3 jours. La consommation d’antibiotique peut entraîner des inconforts intestinaux. L’isolement des souris durant 3 semaines peut être une source de stress

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour effectuer des analyses histologiques sur l’identité cellulaire des neurones étiquetés

Remplacement

Nous cherchons à comprendre comment le cerveau prend des décisions en fonction de la valeur des options (par exemple choisir ce qui est le plus avantageux). Pour cela, nous étudions l’activité des neurones pendant que le sujet réalise une tâche. La prise de décision fait intervenir de nombreuses régions du cerveau qui communiquent entre elles, mais aussi avec le reste du corps (comme le foie, les muscles ou le tissu adipeux). C’est pourquoi les méthodes réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés, ne permettent pas encore de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant et de son interaction avec l’environnement.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Pour la manipulation des ensembles neuronaux au cours de la tâche, chaque souris sera testée dans deux conditions distinctes. Cela permettra que chaque animal puisse générer son résultat et son propre contrôle, ce qui permet de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, à l’issue de chaque procédure, les animaux mobilisés sur les expériences seront prélevés post mortem afin d’éviter de mobiliser un troisième groupe d’animaux dédié à l’étude de l’architecture neuronale.

Raffinement

Dans le cadre des procédures impliquant de la neurochirurgie, la santé des animaux sera surveillée en continu tout au long de l’intervention, notamment par le contrôle des paramètres physiologiques. Une habituation préalable des animaux sera faite afin de limiter leur stress. Le déroulement des chirurgies sera accompagné de mesures de confort et d’une analgésie adaptée tout au long de la procédure. Un suivi post-opératoire poussé, avec une grille d’observation, permettra la mise en place de soins adaptés.

Choix des espèces

D’un point de vue technique, la souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés. Elle est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. De plus, la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Notamment sur le système de décision qui est relativement bien conservé par rapport à celui de l’Humain, anatomiquement et fonctionnellement. Ce qui n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux, pour lesquels l’organisation anatomique du circuit de décision est trop différente pour que ces espèces puissent être utilisées pour comprendre les mécanismes neuronaux. De plus, ces comportements de prise de décision (motivation alimentaire, apprentissage d’action et mémoire) sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour comparer avec de précédentes études. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines, et les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 11 mois.

Toutes tuées pour des analyses histologiques ou biochimiques, 56 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe reçoit une injection quotidienne pendant sept jours puis passe un test par jour pendant six jours, un second subit une chirurgie de 45 à 60 minutes suivie d'un prélèvement terminal de tissus. Ces souris portent une invalidation génétique d'un récepteur à la sérotonine dont le porteur affirme qu'elle reproduit des déficits de sociabilité et des comportements stéréotypés, et le projet mesure si un traitement déjà employé chez des personnes autistes corrige ce tableau. Les tests comportementaux ne sont nommés nulle part, alors que l'évaluation du traitement repose entièrement sur eux.

Objectifs

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) touchent environ 1 % de la population, selon de récentes études épidémiologiques à grande échelle. Les TSA constituent un ensemble de troubles neurodéveloppementaux dont les symptômes touchent principalement le comportement et la communication sociale. Parmi les gènes récemment identifiés comme potentiellement impliqués dans les TSA, notre équipe a mis en évidence le rôle d’un type de récepteur à la sérotonine. Des souris génétiquement invalidées pour ce récepteur présentent des déficits de sociabilité ainsi que des comportements restreints et stéréotypés, caractéristiques des TSA. L’objectif de notre projet est double : 1/ Évaluer si un traitement pharmacologique actuellement utilisé pour atténuer les symptômes des TSA, permet de corriger le phénotype autistique observé chez les souris. 2/ Étudier l’impact de la délétion du gène du récepteur à la sérotonine sur la morphologie des cellules gliales et neuronales dans des régions cérébrales clés dans la régulation des comportements sociaux et des comportements répétitifs

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du récepteur à la sérotonine dans le développement de la pathologie autistique, ainsi que l’exploration de nouvelles pistes thérapeutiques pour atténuer les symptômes de l’autisme. À court terme, il nous permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la pathologie et les voies de signalisation du récepteur qui constituent une cible thérapeutique potentielle. À plus long terme, il nous permettra de mettre au point de nouveaux médicaments ciblant notre récepteur et agissant spécifiquement sur les voies de signalisation dérégulées dans la pathologie.

Procédures

Un premier lot d’animaux sera injecté une fois par jour durant 7 jours avec une solution de traitement ou contrôle, puis passera des tests comportementaux (5 à 10 minutes par test, un test par jour durant 6 jours) puis une fixation terminale de tissus pour prélèvements. Le deuxième lot sera soumis à une chirurgie unique avec anesthésie et analgésie (45-60 minutes) puis un prélèvement terminal de tissus.

Impact sur les animaux

Des animaux recevront des injections d’agents pharmacologiques. Une inflammation au site d’injection peut être observée. Un léger stress dû à la manipulation par l’expérimentateur et à la séparation courte d’avec les congénères peut survenir durant les tests comportementaux. Un inconfort au niveau du site d’intervention et de légères douleurs locales peuvent survenir après la chirurgie, normalement résolues sous 24 heures.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour analyses histologiques ou biochimiques

Remplacement

Pour pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le cadre des TSA, il faut comprendre les mécanismes moléculaires provoquant ces pathologies afin d’agir spécifiquement sur ces mécanismes. Pour ce faire, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux d’autisme, sur lesquels nous pourrons d’une part effectuer des tests biochimiques, permettant de caractériser les déficits moléculaires associés à la pathologie et d’autre part des tests comportementaux qui permettront d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique. En effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental

Réduction

Nous testerons chaque animal dans différentes tâches comportementales. Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique suffisante pour exploiter les résultats.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Comme l’autisme est une pathologie qui touche autant les hommes que les femmes, nous utiliserons les animaux des deux sexes. L'injection stéréotaxique de petits volumes est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil. En fonction des signes cliniques observés en post-opératoire, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien sera utilisé pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris montre une perte de poids significative, alors elle sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels il est possible d’étudier de nombreux comportements, en particulier ceux qui sont altérés chez les patients souffrants de TSA. Des animaux jeunes adultes (8-12 semaines) seront utilisés car à cet âge les déficits comportementaux sont facilement mesurables, et les structures cérébrales sont bien en place. Nos tests seront donc suffisamment robustes pour permettre de détecter des différences dans l’organisation des régions du cerveau des animaux modèles de TSA et également pour tester les effets bénéfiques potentiels de composés médicamenteux.

Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.