Système nerveux

Quarante-cinq minutes de neurochirurgie pour 800 souris, quatorze injections directement dans le cerveau pour 480 d'entre elles : 2 980 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Un régime gras leur est imposé, avec une prise de poids que le porteur estime ne pas devoir dépasser le double du poids initial, alternée avec des jeûnes de 4 ou 24 heures et un hébergement individuel quand la prise alimentaire doit être mesurée souris par souris. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans l'obésité, les pistes thérapeutiques étant renvoyées au long terme et "si les résultats obtenus vont dans ce sens". 1 200 souris passent des tests comportementaux de mesure de l'anxiété, de dix à quarante minutes, dont le résumé ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés du cerveau. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime qui déclenche l’obésité.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire présentes dans le cerveau participent au développement de l’obésité et des troubles du métabolisme en réponse à une alimentation riche en calories. Ils aideront également à mieux caractériser les phénomènes d’inflammation dans cette région du cerveau. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour agir sur ces cellules et ainsi limiter ou prévenir les troubles métaboliques, si les résultats obtenus vont dans ce sens.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 3220. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 800. 3) Test de tolérance au glucose sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min, répétée 2 fois. Nombre d’animaux : 800. 4) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : 1 ou 14. Nombre d’animaux : 480 pour le groupe « 14 fois » et 160 pour le groupe « 1 fois ». 5) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1280. 6) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 1200.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques sur le poids, et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro afin de tester les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. La production d’animaux transgéniques est rationalisée en choisissant un schéma d’accouplement permettant de n’obtenir que des animaux dont les génotypes ont un intérêt pour le projet. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec de tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat de dégradation du bien-être /souffrance des animaux. 2) L’evaluation de la prise alimentaire necessite parfois l’hébergement des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochees au maximum les unes des autres. 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal. 4) Des points limites appropries ont ete definis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée, anatomique, physiologique, comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, il sera mis en place des mesures conservatoires et des critères d’arrêt des souffrances, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le metabolisme glucidique sont depuis longtemps etudies chez la souris, qui represente donc une espece adaptee a ce type d’etudes. De tres nombreux modeles d’obesites ont ete developpes chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximite biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modele predictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, la neuroinflammation hypothalamique induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes lors des procédures. Elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie (3-4 semaines pour les souris transgéniques ; 7 semaines pour les autres), mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Les souris seront à un stade post- puberté (hormones sexuelles stables). De plus, cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance.

1 650 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement des organes à analyser. Les procédures tiennent en trois injections au maximum, d'une minute chacune, réalisées sur animal éveillé. Les souris peuvent développer une inflammation, avec baisse d'activité, stress, perte de température et perte de poids modérées. Le porteur justifie l'effectif par des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés, sans en donner le détail, pour un projet qui mobilise 1 650 souris.

Objectifs

La barrière hémato-encéphalique, interface protectrice entre le sang et le cerveau, fonctionne comme un bouclier en empêchant les toxines et les microbes de pénétrer dans le cerveau, tout en laissant passer les nutriments indispensables. Pour jouer son rôle de barrière, elle exprime des gènes de défense immunitaires. Le but est de comprendre comment ces gènes sont régulés, protègent et maintiennent cette barrière, aussi bien en conditions normales, qu’en cas d’infection. A terme, ces recherches pourraient permettre de mieux comprendre comment protéger le cerveau contre les infections, et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre la maturation de la barrière hémato-encéphalique et sa capacité intrinsèque à contrôler les infections. Cette étude permettra de découvrir de nouveaux mécanismes de régulation et facteurs moléculaires impliqués dans l'intégrité de cette barrière. À terme, ces découvertes pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer ou moduler cette barrière, ouvrant ainsi la voie à des traitements innovants contre les infections ou les maladies neurologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections (maximum 3, durée 1 min). Ces interventions seront réalisées à l’état éveillé.

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements sanguins réalisés peuvent occasionner un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les conditions inflammatoires peuvent entraîner une diminution d’activité, un stress et une baisse de température et de poids modérés.

Devenir

Une fois les animaux mis à mort, nous prélevons les organes requis pour nos analyses expérimentales.

Remplacement

Les études préliminaires in vitro sur des cellules de la barrière hémato-encéphalique, ont permis d’identifier des facteurs clés impliqués dans la protection de cette barrière face aux virus et pouvant jouer un rôle sur sa fonction. La barrière hémato-encéphalique étant un système complexe il est impossible de reproduire fidèlement toutes les interactions nécessaires à son maintien. C’est pourquoi cette étude nécessite le recours à des modèles animaux. Cette approche est essentielle pour obtenir des résultats fiables et applicables à la biologie humaine.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux à utiliser a été calculé en se basant sur des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions sanitaires contrôlées, en groupe sociaux et dans un environnement enrichi. Les cages seront enrichies (coton, maison en carton) pour limiter les symptômes liés à une inflammation modérée. Les prélèvements et perfusions seront réalisés sous anesthésie et analgésie profonde. Des points limites strictes et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour les études sur la barrière hémato-encéphalique. En effet, comme chez l’humain, la barrière hémato-encéphalique des souris adultes produit naturellement des gènes de défense qui jouent un rôle clé contre les infections. De plus, la souris est un modèle bien établi pour étudier les infections et les inflammations du système nerveux, ce qui nous permet de mieux comprendre comment ces mécanismes fonctionnent chez l’humain.

Exposées 24 heures sur 24 aux signaux radiofréquence 5G du début de la gestation jusqu'à trois semaines après la mise bas, soit environ six semaines, des femelles isolées et leurs petits ouvrent ce protocole. Les nouveau-nés font l'objet d'enregistrements de vocalisations ultrasoniques, puis, à partir de huit semaines, les souris passent deux à trois semaines de tests comportementaux, dont un labyrinthe radiaire avec alimentation contrôlée et une exposition à des stimuli de huit minutes suivie de rappels de six minutes, que le résumé ne nomme pas. 852 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des vérifications histologiques. Le porteur écrit qu'aucun mécanisme ne suggère d'effet délétère immédiat aux niveaux d'exposition utilisés, les effets recherchés étant attendus à long terme.

Objectifs

Les champs électromagnétiques dans la gamme des radiofréquences (RF) sont l'un des agents physiques les plus omniprésents auxquels nous sommes exposés quotidiennement. Ainsi, l'exposition aux ondes RF des communications sans fil dans nos environnements personnels et professionnels soulève des questions légitimes quant à leurs effets possibles sur la santé. Avec le déploiement rapide de la téléphonie mobile et des communications sans fil au cours des dernières décennies, la cinquième génération (5G) a commencé à être déployée en France en 2020. Alors que les seuls effets nocifs connus de l'exposition aux RF sont causés par l'échauffement des tissus, la possibilité d’effets comportementaux induits par l'exposition aux champs RF à des niveaux inférieurs aux recommandations reste à préciser, en particulier au cours de la phase de neurodéveloppement qui s’avère être particulièrement sensibles à l’impact des stimuli environnementaux. Ce projet consiste en l’étude des effets in vivo d’une exposition chronique à des ondes RF à 3,5 GHz chez la souris au cours du développement. Les conséquences comportementales de cette exposition aux signaux 5G seront évaluées à l’âge adulte à l’aide d’une batterie de paradigmes visant à explorer différents domaines comportementaux comme l’anxiété, les aptitudes motrices ou les fonctions cognitives. Les modifications de l’expression de marqueurs d’activité cérébrale seront également investiguées à partir des cerveaux de souris collectés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, à court terme, de mieux caractériser les effets d’une exposition précoce aux signaux 5G sur le développement cérébral et les comportements associés chez la souris. À moyen terme, ces résultats contribueront à mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques potentiellement altérés par ces expositions, notamment en lien avec la formation des circuits neuronaux et les fonctions cognitives et sociales. À long terme, ce projet présente un enjeu translationnel en pouvant contribuer à l’évaluation des risques sanitaires liés aux expositions aux champs RF et à orienter les recommandations en matière de santé publique.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à différentes interventions expérimentales non invasives ou faiblement invasives. - Les souris gestantes et leurs petits seront exposés de façon chronique, corps entier et en continu (24 h/24) aux signaux radiofréquences de type 5G, du début de la gestation jusqu’à trois semaines après la naissance, soit une durée totale d’environ 6 semaines. - Les nouveau-nés feront l’objet d’interventions ponctuelles de courte durée, notamment (quelques secondes par animal) ainsi que des enregistrements de vocalisations ultrasoniques (quelques minutes par session), réalisés avec un minimum de manipulation. - A l’âge adulte (à partir de 8 semaines), les animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux sur animaux vigiles. Chaque test dure de quelques minutes (par exemple 5 à 10 minutes pour les tests d’exploration ou de mémoire) à quelques dizaines de minutes pour certaines épreuves spécifiques. La batterie complète s’étale sur environ 2 à 3 semaines, avec des périodes de repos intégrées. - La procédure expérimentale comprend une phase brève d’exposition à des stimuli contrôlés pendant 8 minutes, suivie de séances de rappel de courte durée de 6 minutes. Les tâches de mémoire spatiale dans le labyrinthe radiaire impliquent des sessions répétées de quelques minutes avec alimentation contrôlée.

Impact sur les animaux

À ce jour, aucun mécanisme ne suggère d’effet délétère immédiat aux niveaux d’exposition utilisés ; les effets potentiels sont attendus à long terme, ce qui constitue l’objectif de l’étude. Les animaux participeront à différents tests comportementaux permettant d’évaluer certaines fonctions cognitives, émotionnelles et motrices. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger et transitoire lié à la manipulation, à la nouveauté de l’environnement ou à certaines situations aversives modérées. Ces effets sont de courte durée et réversibles. Certains tests nécessiteront une légère adaptation des conditions d’alimentation afin de maintenir la motivation des animaux, tout en assurant un suivi régulier de leur état général et de leur bien-être. Certaines procédures expérimentales, comme les injections de substances, peuvent provoquer un inconfort temporaire lié à la manipulation et à l’administration des traitements. L’isolement des femelles gestantes, réalisé à partir de la détection du bouchon vaginal et maintenu jusqu’au terme de la gestation, peut également entraîner un stress léger et transitoire lié au changement de conditions d’hébergement, atténué par le maintien de conditions d’hébergement enrichies et un suivi renforcé du bien-être des animaux. Des effets transitoires sur le comportement ou l’activité des animaux pourront également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder aux vérifications histologiques et à l'étude de marqueurs biologiques.

Remplacement

L’examen des comportements, comme par exemple les fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas l’exposition aux radiofréquences des très jeunes individus pendant leur phase de neurodéveloppement et l’utilisation du modèle animal s’avère nécessaire. Des méthodes alternatives comme les modèles cellulaires in vitro restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que le neurodéveloppement, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De même, les approches de modélisation informatique du fonctionnement du cerveau sont utiles mais restent largement insuffisantes et s’avèrent au mieux complémentaires des données neuro-comportementales obtenues.

Réduction

- Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables. - Le recours à une batterie de tests comportementaux pour un même animal permet également de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous utiliserons des procédures comportementales dont les paramètres opérationnels ont été validés par une approche pharmacologique permettant d’optimiser leur sensibilité, et ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés. D’une façon générale, le nombre de répétition des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une fiabilité statistique suffisante pour conclure de manière robuste, elle ne sera répétée qu’une seule fois ou de façon partielle ; sinon elle sera répétée deux à trois fois maximum. - Les cerveaux, voire d’autres organes des souris mises à mort en fin d’expérience seront conservés afin d’éviter des expériences supplémentaires si des questions nouvelles surviennent.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort liés aux procédures expérimentales. Les protocoles ont été optimisés lors d’études précédentes afin de réduire les manipulations et les contraintes pour les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie afin de vérifier leur état de santé et leur bien-être. En cas de problème, des mesures adaptées seront mises en place rapidement. Des critères de surveillance et d’arrêt ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive. Des mesures adaptées pourront être mises en place pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux si nécessaire. Certains tests comportementaux pourront entraîner un inconfort léger et temporaire lié aux conditions expérimentales. Des périodes de repos seront prévues entre les tests afin de limiter le stress et la fatigue des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont souvent utilisés pour étudier le cerveau et le système nerveux, car ils sont faciles à élever et à manipuler en laboratoire. De nombreux mécanismes du cerveau sont similaires chez tous les mammifères, y compris chez l’être humain. Cela permet aussi d'observer chez les rongeurs des comportements complexes grâce à différents tests adaptés. Dans cette étude, l’utilisation de souris est nécessaire car les phénomènes étudiés dépendent des interactions entre plusieurs régions du cerveau et du comportement global de l’animal. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits correctement avec des cultures cellulaires ou des simulations informatiques seules. Les effets d’une exposition aux signaux 5G seront étudiés pendant le développement du cerveau. Pour cela, des souris femelles gestantes seront exposées pendant la grossesse, puis les petits continueront à être exposés après la naissance. Les conséquences de cette exposition seront ensuite évaluées lorsque les souris deviendront de jeunes adultes, vers l’âge de 10 à 12 semaines, période à laquelle le cerveau est considéré comme mature. Les tests seront réalisés aussi bien chez les mâles que chez les femelles afin d’étudier différents aspects du comportement.

Des femelles gestantes sont anesthésiées et opérées vingt à trente minutes pour qu'une injection atteigne directement l'embryon, d'autres reçoivent un gavage de deux minutes sans anesthésie. Leurs petits passent ensuite des tests comportementaux entre trois et vingt et un jours après la naissance, que le résumé ne nomme pas. 1 578 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un risque d'avortement ou de résorption embryonnaire après la chirurgie. Toutes seront tuées à la fin des procédures pour le prélèvement de tissu cérébral. Le porteur écrit avoir "réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaire à ce projet de grande nécessité".

Objectifs

Le cerveau contient différents types de cellules, dont les astrocytes, qui jouent un rôle essentiel dans la communication entre les neurones et dans le bon fonctionnement cérébral. Ce projet vise à mieux comprendre la diversité et les fonctions des sous-populations d’astrocytes dans une partie du cerveau nommée cortex, depuis leur formation jusqu’à leur implication dans des troubles du neurodéveloppement, tels que les troubles du spectre de l’autisme et la schizophrénie. Pour cela, plusieurs modèles de souris seront utilisés afin de suivre ou d’éliminer spécifiquement certaines populations d’astrocytes et ainsi comprendre leurs rôles en contexte sain et pathologique. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Comprendre d'où viennent ces cellules et comment elles se développent. 2. Déterminer leur rôle au cours du développement. 3. Analyser les conséquences de ces cellules sur le comportement social, cognitif et sensoriel. 4. Étudier leur rôle sur l’activité électrique des neurones en conditions saines et dans des modèles de troubles du neurodévelopement. Les connaissances obtenues permettront de mieux comprendre comment et pourquoi les astrocytes sont essentiels au bon fonctionnement du cerveau et jouent un rôle dans les maladies neuroveloppementales, offrant ainsi de nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension du fonctionnement du cerveau en caractérisant une population de cellules du cerveau appelée "astrocytes", longtemps considérée comme un groupe de soutien des neurones, mais aujourd’hui reconnues comme des acteurs essentiels de la communication entre les neurones. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment ces cellules se développent, interagissent avec les neurones et contribuent à la formation du réseau de neurones pendant le développement et ainsi aux comportements cognitifs, sensoriels et sociaux. Cette connaissance est essentielle pour identifier de nouvelles pistes pour lutter contre les symptômes des troubles complexes que sont les troubles du neurodéveloppement (dont les troubles du spectre de l'autisme et la schizophrénie) en constante augmentation et dont les causes restent à ce jour inconnues. À terme, les bénéfices potentiels de ce projet sont : 1. Une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine des troubles du neurodéveloppement ; 2. La mise en évidence de nouvelles pistes de cibles diagnostiques et/ou thérapeutiques centrées sur les astrocytes ; 3. La caractérisation de modèles animaux de troubles du spectre de l'autisme et de la schizophrénie qui seront utiles pour développer, tester et valider de nouvelles stratégies de prévention, de diagnostique et/ou de traitement. Ce projet apportera donc des avancées fondamentales en neurosciences susceptibles d’avoir, à long terme, un impact positif sur la santé humaine.

Procédures

Les nuisances prévues dans ce projet sont modérées, mais strictement encadrées pour limiter la douleur, le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront soumis à différents types d’interventions selon l’étude concernée : Procédures chirurgicales sur femelles gestantes : pour les expériences nécessitant une injection directement dans l’embryon, les mères seront mises sous anesthésie générale, puis subiront une chirurgie de courte durée (20 à 30 minutes), suivie d’une période de traitement antidouleur de 24 h. Certaines études nécessiteront une alimentation dirigée directement dans l'oesophage de femelles gestantes : manipulation rapide (2 minutes/femelle) sans anesthésie, induisant un stress modéré et transitoire. Tests comportementaux : manipulations non invasives de courte durée (quelques minutes à 1 h selon le test de 3 jours à 21 jours après la naissance), susceptibles d’entraîner un stress léger mais sans douleur ni lésion tissulaire.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales sont susceptibles d’induire chez les animaux plusieurs effets indésirables, malgré la mise en place de mesures analgésiques et de raffinement. Les effets attendus incluent : une douleur post-opératoire transitoire liée aux interventions chirurgicales, généralement de faible à modérée intensité grâce à la prise en charge analgésique ; un stress lié à la contention, aux manipulations et à l’environnement expérimental ; une altération temporaire de l’état général (diminution de l’activité, modification de la prise alimentaire) ; chez les femelles gestantes, un risque d’avortement ou de résorption embryonnaire en post-chirurgie. Ces effets sont surveillés et limités par des protocoles de suivi adapté et des critères d’arrêt prédéfinis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures pour prélevement de tissu cérébral.

Remplacement

Pour comprendre comment se développent les astrocytes et à quoi ils servent, il est nécessaire de les étudier pendant le développement du cerveau, or, aucun modèle à part les animaux ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité de la mise en place des interactions entre les différents type de cellules pendant et après le développement du cerveau. Cette étude nécessite donc l'utilisation d'animaux mais nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaire à ce projet de grande nécessité.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé à partir de données préliminaires et d’analyses statistiques pour garantir la validité scientifique et détecter une possible différence entre les mâles et les femelles, tout en minimisant les effectifs. Les animaux seront utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et éviter la génération d’animaux surnuméraires.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées, sous anesthésie et analgésie appropriées lorsque nécessaire, et les animaux maintenus dans des conditions d’hébergement enrichies. Les manipulations seront limitées en durée et en fréquence, la surveillance quotidienne assurera le bien-être des animaux, et toute source de douleur ou de stress sera prévenue ou immédiatement traitée.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), modèle de référence en neurosciences, avec une organisation et un développement cérébral comparables à l’Homme, présentant des comportementaux sociaux élaborés dont les altérations peuvent être détectées, analysées et quantifiées par des tests comportementaux standardisés et largement utilisés par la communauté scientifique. Les stades étudiés couvrent les périodes clés du développement d'une région cérébrale nommée cortex : les stades embryonnaires (jour embryonnaire 13 à 18) pour le marquage et le suivi des cellules souches neurales et de leur descendance, jour post-natal 0 et 14 pour la différenciation et l’intégration de certaines sous-populations cellulaires d'intéret dans les circuits neuronaux, et jour post-natal 21 et 60 pour la maturation fonctionnelle et l’analyse comportementale et de la communication entre les neurones. Ces stades permettent d’associer observations anatomiques et fonctionnelles, de la circuiterie neuronale aux manifestations comportementales, de manière pertinente.

Les femelles gestantes opérées sont tuées après le sevrage de leurs portées, et leur descendance après prélèvement du cerveau : 3 129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 13,5 jours de gestation, chaque femelle subit sous anesthésie générale l'ouverture de la cavité abdominale, l'exposition des cornes utérines, une injection dans le cerveau des embryons et une électroporation, en trente minutes au maximum. Les souriceaux ainsi porteurs d'un médulloblastome reçoivent, pour une partie d'entre eux, deux injections par jour en contention entre le quatrième et le quatorzième jour de vie, et le porteur annonce des pertes embryonnaires, une croissance ralentie et des troubles neurologiques aux stades avancés. Il écrit que la mise à mort de l'ensemble des souris est justifiée par "la nécessité scientifique des analyses réalisées, l'impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal".

Objectifs

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 20 % des cancers du système nerveux central pédiatrique. Il est lié à une croissance anormale de certaines cellules du cervelet, une région du cerveau impliquée dans la coordination des mouvements et l’équilibre. Normalement, ces cellules se développent de manière contrôlée au cours de l’enfance puis arrêtent de se multiplier. Lorsque ce processus est perturbé, elles peuvent se multiplier de façon excessive et former une tumeur. Des travaux récents suggèrent que des mécanismes moléculaires liés au développement normal du cerveau, ainsi que l’activité des neurones, pourraient influencer la croissance de ces tumeurs. Mieux comprendre ces interactions est essentiel pour progresser dans la compréhension de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition et la progression du médulloblastome. Il vise à mettre en place un modèle expérimental chez la souris permettant d’étudier le développement de cette tumeur, à identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des cellules tumorales, à étudier le rôle de l’activité des cellules nerveuses dans l’évolution de la tumeur et enfin, à explorer les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans le cervelet. Les résultats permettront d’améliorer la compréhension de cette maladie et pourraient contribuer, à long terme, à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant. Bien que des traitements existent, ils peuvent entraîner des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces à long terme. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’apparition et la croissance de ces tumeurs afin d’améliorer leur prise en charge. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines cellules du cervelet deviennent tumorales et sur les facteurs qui influencent leur prolifération. En particulier, il vise à mieux comprendre le rôle de l’environnement et l’activité des cellules nerveuses et tumorales dans l’évolution de la maladie. Les résultats obtenus pourraient contribuer à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement du médulloblastome. À plus long terme, ces connaissances pourraient orienter la recherche vers de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement plus ciblées et mieux tolérées par les patients. Par ailleurs, ce projet présente également un intérêt plus large en biologie, car il permettra d’améliorer la compréhension du développement normal du cervelet, en particulier des mécanismes qui régulent la croissance et la maturation de certains neurones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’électroporation in utero, ainsi qu’à une procédure terminale de prélèvement des tissus. La procédure principale est réalisée chez des femelles à 13,5 jours de gestation. Cette intervention est réalisée une seule fois par femelle et dure 30 minutes maximum. Elle consiste en une anesthésie générale suivie d’une ouverture de la cavité abdominale, de l’exposition des cornes utérines, d’une injection dans le cerveau des embryons, puis d’une électroporation permettant l’entrée du matériel génétique dans les cellules du cervelet. Elle est suivie d’une phase de récupération et d’un suivi post-opératoire des femelles gestantes. L’intervention sur chaque embryon dure quelques minutes. Chez les animaux du lot d’étude de l’activité neuronale, des injections seront réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention, deux fois par jour (en alternant de côté) entre 4 et 14 jours après la naissance, et durent quelques secondes par injection. La procédure terminale correspond à l’injection d’un euthanasiant sous anesthésie générale avant traitement puis prélèvement postmortem des tissus. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal et dure une dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin de réaliser l’électroporation in utero. Cette procédure peut entraîner une douleur post-opératoire modérée, un stress lié à la manipulation, ainsi qu’un risque faible d’infection ou de complication au niveau de la plaie chirurgicale. Chez les embryons manipulés, la procédure peut entraîner des pertes embryonnaires ou une variabilité dans le développement. Après la naissance, les souriceaux peuvent présenter une variabilité de croissance, notamment en raison de la procédure ou de l’efficacité de l’électroporation. Chez les animaux développant une tumeur, des effets indésirables peuvent apparaître au cours de la progression tumorale, tels qu’une diminution de la croissance, une altération du comportement, une réduction de l’activité ou, dans les cas les plus avancés, des troubles neurologiques. Dans le cadre de la modulation de l’activité neuronale, les injections répétées peuvent entraîner un stress léger, ainsi qu’une irritation locale au point d’injection.

Devenir

À l’issue des expériences, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur. Les animaux sont utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessitant le prélèvement des tissus cérébraux. Ces analyses impliquent soit une fixation des tissus, soit une extraction de matériel biologique qui ne permet pas le maintien en vie de l’animal. Par conséquent, aucune réutilisation des animaux n’est possible. De plus, le développement tumoral induit dans ce projet peut entraîner, à des stades avancés, une altération de l’état général et du bien-être des animaux. Afin d’éviter toute souffrance prolongée, des points limites stricts ont été définis et toute atteinte de ces critères entraîne une mise à mort immédiate. Les femelles gestantes utilisées pour les procédures chirurgicales ne sont pas réutilisées après les expériences et seront également mises à mort après le sevrage des portées, conformément aux pratiques de bien-être animal. Ainsi, la mise à mort de l’ensemble des animaux est justifiée par la nécessité scientifique des analyses réalisées, l’impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet, car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière fiable le fonctionnement complexe du cerveau en développement et la formation des tumeurs. En particulier, certaines interactions entre les cellules du cerveau et leur environnement, ainsi que l’influence de l’activité des neurones, ne peuvent pas être étudiées correctement en laboratoire sur des cellules isolées. Cependant, afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, des expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture et sur des tissus en dehors de l’organisme. Ces approches ont permis de tester et d’optimiser les outils expérimentaux avant leur utilisation chez l’animal. Grâce à cette étape préalable, seules les conditions les plus pertinentes et les plus fiables sont utilisées dans ce projet, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats.

Réduction

Le projet a été conçu de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été estimé en tenant compte des contraintes techniques et de la variabilité du modèle étudié. Ce calcul prend en compte les pertes expérimentales attendues, liées à la réussite des gestations et à l’efficacité de la procédure utilisée. Les expériences sont réalisées sur plusieurs portées indépendantes afin d’assurer des résultats représentatifs. Les expériences seront arrêtées dès que le nombre nécessaire d’animaux permettant une analyse fiable sera atteint. Par ailleurs, la méthode utilisée permet de limiter le recours à la création de nouvelles lignées animales qui nécessiteraient la production d'un très grand nombre d'animaux pour très peu d'animaux ayant les bonnes caractéristiques pour l'étude). Plusieurs types d’analyses sont réalisés sur les mêmes animaux, ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement tout au long du projet, en particulier pendant et après les interventions. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, avec des traitements adaptés pour limiter la douleur et le stress. Des mesures strictes d’hygiène sont appliquées afin de réduire les risques d’infection. Après chaque intervention, un suivi régulier est mis en place pour vérifier l’état général des animaux, leur comportement et leur récupération. Une attention particulière est portée à leur croissance, leur mobilité et à tout signe de gêne ou de douleur. L’état des animaux est évalué à l’aide de grilles de suivi standardisées permettant de détecter rapidement toute altération. Les animaux sont observés au minimum une fois par jour, et plus fréquemment si nécessaire, notamment lorsque la maladie progresse. Si des signes de mal-être apparaissent, des mesures de soutien sont mises en place, comme un accès facilité à la nourriture et à l’eau ou une surveillance renforcée. Des critères clairs ont été définis pour intervenir rapidement si l’état d’un animal se dégrade. Si ces critères sont atteints, l’animal est mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance. Des grilles spécifiques sont également utilisées pour le suivi des femelles après chirurgie.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle expérimental en raison de leur grande pertinence pour l’étude des mécanismes biologiques et des pathologies humaines. Le développement du système nerveux central chez la souris présente de fortes similarités avec celui de l’homme, ce qui permet d’étudier de manière fiable les processus impliqués dans la formation des tumeurs cérébrales. De plus, l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées aux objectifs du projet constitue un atout majeur pour répondre aux questions scientifiques posées. Les animaux seront utilisés à différents stades du développement, en lien direct avec les étapes de la progression tumorale. L’induction tumorale sera réalisée au stade embryonnaire correspondant à 13.5 jours de gestation chez les femelles, période clé du développement des progéniteurs à l’origine des neurones conduisant au type de médulloblastome étudié. Les analyses seront ensuite effectuées à plusieurs stades après la naissance, afin de couvrir les différentes phases de la maladie. L’initiation tumorale et les premiers événements de prolifération neuronale seront étudiés entre 7 et 14 jours après la naissance, la phase intermédiaire de croissance sera étudiée 21 jours après la naissance et la phase tardive caractérisée par des tumeurs établies 60 jours après la naissance.

Toutes tuées après des évaluations fonctionnelles terminales, sans qu'aucune soit maintenue en vie ni réutilisée, 818 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection intrapleurale d'un traceur, puis une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes sous anesthésie générale ouvrant l'accès à la moelle épinière cervicale, où sont injectés des pièges extracellulaires produits en laboratoire. La perte de poids attendue va jusqu'à 10 % du poids initial dans la semaine suivant l'opération, y compris chez les souris du groupe témoin, opérées sans injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'observer à la fois ces pièges dans la moelle épinière, leur effet sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme et les conséquences musculaires dans un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment une inflammation générale dans l’organisme peut aussi provoquer une inflammation de la moelle épinière et perturber le fonctionnement des muscles, en particulier ceux impliqués dans la respiration. Parmi les mécanismes étudiés figurent les « pièges extracellulaires », des structures libérées par certaines cellules immunitaires. Ces structures jouent normalement un rôle de défense, mais lorsqu’elles sont produites en excès, elles peuvent entretenir l’inflammation et endommager les tissus. L’objectif est de déterminer si la présence de ces pièges extracellulaires dans la moelle épinière peut, à elle seule, provoquer une inflammation locale et altérer la fonction neuromusculaire. Pour cela, des pièges extracellulaires produits en laboratoire à partir de différentes cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages et microglies) seront injectés dans la moelle épinière de souris saines. Cela permettra de comparer leurs effets respectifs sur l’inflammation et sur le fonctionnement des muscles respiratoires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre une inflammation générale de l’organisme, l’inflammation de la moelle épinière et l’apparition de troubles musculaires et respiratoires. Nos premiers résultats suggèrent que les « pièges extracellulaires », produits par certaines cellules immunitaires, pourraient jouer un rôle dans ces altérations, mais leur effet exact reste encore mal connu. Ce projet permettra de déterminer si la présence de ces structures dans la moelle épinière est suffisante pour provoquer à elle seule une inflammation locale et perturber le fonctionnement neuromusculaire, en particulier celui du diaphragme, principal muscle respiratoire. Il permettra aussi de comparer les effets de pièges extracellulaires provenant de différents types cellulaires, afin de mieux comprendre si certains ont des effets plus délétères que d’autres. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour limiter les conséquences neurologiques, musculaires et respiratoires associées à une inflammation systémique, notamment dans certaines maladies graves comme le sepsis.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant d’atteindre la moelle épinière cervicale et d’y injecter des « pièges extracellulaires » produits par des cellules en laboratoire. Cette chirurgie sera précédée de quelques jours par une injection intrapleurale quasi non-invasive (5 minutes) d’un traceur moléculaire permettant d’identifier les cellules permettant la contraction du muscle diaphragmatique, et localisées dans la moelle épinière cervicale. Ces souris seront ensuite soumises à des tests fonctionnels terminaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration du traceur en intrapleuraléritonéal. - Perte de poids jusqu’à 10% du poids initial durant la première semaine après la chirurgie et l’injection dans la moelle épinière des pièges extracellulaires. Les animaux du groupe contrôle pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à la chirurgie contrôle sans injection de pièges extracellulaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure, après les évaluations fonctionnelles terminales. Les tissus et organes d’intérêt, notamment la moelle épinière cervicale, le diaphragme et, selon les analyses prévues, d’autres tissus associés, seront ensuite prélevés pour des analyses histologiques, immunohistochimiques, cytométriques et moléculaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie ou réutilisé à l’issue de la procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant d’étudier en même temps les effets des pièges extracellulaires dans la moelle épinière, leur impact sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme, et les conséquences sur le fonctionnement musculaire. Les études réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et les muscles dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour répondre à cette question de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. L’organisation de l’étude repose sur l’expérience du laboratoire, sur des données préliminaires, et sur les analyses prévues à la fin des expériences. Le choix de plusieurs groupes et de plusieurs temps d’observation est nécessaire pour comparer correctement les effets étudiés, mais a été limité afin d’éviter toute utilisation excessive d’animaux. Cette stratégie permet d’obtenir des résultats exploitables tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur et l’inconfort. Les conditions opératoires seront soigneusement contrôlées afin de réduire au maximum les risques liés aux injections et aux manipulations. Après chaque intervention, les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière pendant toute la durée de l’étude. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés à l’aide de grilles de suivi. Si nécessaire, les animaux seront pris en charge de manière adaptée. L’isolement (dans un environnement enrichit) ne sera utilisé qu’en cas de besoin lié aux soins ou à l’état de l’animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est une espèce largement utilisée en recherche biomédicale pour étudier les interactions entre inflammation, système nerveux et fonction musculaire. Les modèles murins de neuroinflammation sont bien connus et permettent d’obtenir des résultats comparables à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques utilisées dans ce projet, comme les injections dans la moelle épinière, le marquage de certaines cellules nerveuses et les analyses des tissus en fin d’expérience. Sa petite taille, son cycle de vie court et la disponibilité de lignées élevées dans des conditions standardisées permettent de bien contrôler les conditions expérimentales et de limiter la variabilité entre animaux. De plus, la souris partage avec l’humain plusieurs caractéristiques importantes du fonctionnement des systèmes nerveux, musculaire et immunitaire, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de recherche. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés d’au moins 8 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance et au développement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi d’étudier ces mécanismes dans une situation plus proche de celle observée chez l’adulte humain.