Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Prélèvements de tissus pour génotypage de souris génétiquement altérées dans l’étude de la communication entre le cerveau et la périphérie (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
Sur 75 000 souris comptabilisées, 49 875 sont mises à mort faute de porter le génotype recherché ou parce qu'elles sont trop âgées pour reproduire, 24 375 sont gardées vivantes pour alimenter d'autres projets et 3 750 sont réutilisées pour des prélèvements de tissus, des formations ou des travaux pratiques d'animalerie. Ces souris subissent au sevrage, vers 21 jours, la coupe d'un bout de queue de moins de 3 mm, parfois d'un morceau d'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucun résultat scientifique propre n'en est attendu, le porteur décrivant le bénéfice du projet comme celui d'élever et d'identifier le génotype de ses souris pour fournir des animaux non-humains à ses autres travaux. Les cerveaux des souris tuées sont congelés dans une biobanque interne, ce que le porteur situe "dans le cadre des 3Rs", sur un projet qui engage 75 000 souris pour la seule gestion des lignées.
Objectifs
Les études faites au sein de notre laboratoire nécessitent l’utilisation de souris génétiquement altérées. Nous étudions l’interrelation entre le cerveau et le reste du corps. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 afin de pouvoir gérer nos lignées sans en augmenter les effectifs pour les différents projets réalisés par la suite.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont d’élever et identifier le génotype de nos souris afin de fournir des animaux pour nos projets scientifiques.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement d’un très petit morceau de queue (inférieur à 3mm). Les outils et la queue de l’animal seront désinfectés afin de prévenir une potentielle infection. Dans de rares cas, les animaux seront prélevés au niveau de l’oreille par une coupe d’un petit morceau de moins de 3mm également. Ces prélèvements seront effectués au sevrage des animaux, soit à environ 21 jours.
Impact sur les animaux
Lors de l’identification de nos animaux au moment du sevrage par la pose d’un Tag d’oreille, un prélèvement de tissu invasif (queue) peut entrainer une douleur momentanée et un stress lié à la manipulation de l’animal. Cette procédure n’entraine que très rarement des complications. Le suivi quotidien des animaux par les zootechniciens de la zone d’élevage permettra cependant de détecter la moindre modification de l’état de la souris (apparence physique ou comportement anormaux de l’animal) qui permettra alors de prendre des décisions adéquates pour éviter toutes souffrances animales. Aucun animal ne présente de phénotype dommageable en zone d’élevage.
Devenir
Les animaux produits pour nos élevages et génotypées seront gardés en vie car utilisés en continuité dans nos projets expérimentaux (24 375 souris). Certains animaux seront ré-utilisés pour prélèvements de tissus, formation, travaux pratiques d’animalerie (3750 souris). Les animaux qui ne présentent pas le génotype d’intérêt ou seront trop âgés pour servir de géniteurs seront mis à mort (49 875 souris) ; dans le cadre des 3Rs, ces animaux serviront à la création de Biobanque interne (cerveaux de souris congelés) à l’équipe ou pour prélèvements de tissus
Remplacement
A chaque fois que cela sera possible, nous utiliserons des méthodes alternatives (organoïdes, cultures cellulaires, …). Cependant, l’étude des mécanismes physiologiques et physiopathologiques neuro-endocrines mettant en jeu le système nerveux et les organes périphériques n’est actuellement possible qu’avec l’utilisation de modèles animaux. Les méthodes alternatives permettant l’étude des intéractions cellulaires et tissulaires complexes in vitro, bien qu’en cours de développement, n’existent pas encore.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est calculé à partir du nombre d’animaux nécessaire aux projets expérimentaux, des stratégies d’élevage de chaque lignée et des données de la littérature sur nos modèles. Il concorde avec les données obtenues pour le maintien de nos lignées au cours des années précédentes. Les lignées sont utilisées dans plusieurs projets et par plusieurs expérimentateurs. La mutualisation des élevages de l’équipe permet une meilleure gestion de chaque colonie et l’optimisation de l’utilisation/ ou la ré-utilisation de chaque animal issu de l’élevage. De plus, afin d’optimiser la production de nos animaux pour l’expérimentation et pour le maintien des lignées : - Les stratégies d’accouplement sont choisies afin d’obtenir un maximum d’animaux de génotype d’interêt par portée. Lorsque cela est possible, nos accouplements sont réalisés à partir de souris homozygotes afin de réduire le nombre d’animaux non utilisés après croisement. - Nous recourrons à la cryoconservation pour les lignées importantes qui ne servent pas sur les projets en cours.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement d’un statut SOPF. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). La manipulation des animaux, la surveillance quotidienne et les soins sont effectués par les zootéchniciens de la zone d’élevage. Un point hebdomadaire est effectué par le référent en charge de la gestion des colonies pour coordonner l’élevage avec les plans expérimentaux des investigateurs principaux et intéragir avec les zootéchniciens en charge des colonies. Lors de la réalisation des biopsies, les outils utilisés sont désinfectés à l’éthanol entre chaque prélevement. Ils seront toujours utilisés propres, autoclavés et coupant. La biopsie de queue de souris ne dépassera pas 3mm afin de réduire la douleur de l’animal. Ces prélèvements seront réalisés au moment du sevrage et de l’identification des animaux par des bagues d’oreilles afin d’éviter la répétition des contentions. Lorsque nécessaire, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) vers l’EU 1/2. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute mise en reproduction.
Choix des espèces
Nos projets de recherche visent à comprendre le lien entre le cerveau et la périphérie, tant pour une recherche fondamentale que des recherches translationnelles ou bien le traitement de maladies (diabète, obésité, infertilité, …). La procédure expérimentale détaillée ici a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres stratégies ou méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’inactivation d’un gène pour déterminer son effet sur un organisme n’est possible actuellement que chez la souris ou le rat. Nos projets se porteront sur la souris, qui est un modèle idéal pour étudier l’inactivation de certains gènes grâce aux techniques de transgenèse et son génome est à 90% équivalent à celui de l’homme. Les animaux produits pour nos expériences en élevage seront des parents et leurs souriceaux, de la naissance jusqu'à leur sevrage (vers 21 jours).
Efficacité pharmacologique et suivi en imagerie de nanoparticules capables d’emmener des molécules thérapeutiques dans le cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trépanées au-dessus du cortex pour y sceller une fenêtre de verre, puis maintenues sous anesthésie jusqu'à trois heures pendant l'imagerie, 336 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de procédure par surdosage d'anesthésique. L'objectif est de suivre le passage, du sang vers le cerveau, de nanoparticules chargées d'une molécule thérapeutique, que le porteur décrit comme un "cheval de Troie" leurrant un transport naturel. Il revendique une "quasi-innocuité" de ses composés et annonce qu'un score de sévérité sévère constitue le point limite déclenchant la mise à mort immédiate.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Dans ce projet nous allons attacher à la surface de nanoparticules (100 nm de diamètre) nos vecteurs et les remplir d'une molécule thérapeutique. Ces nanoparticules leurrent se système de transport comme un cheval de Troie pour pénétrer dans le cerveau suite à leur délivrance dans le sang. L’objectif de ce projet et de quantifier l’efficacité de l’agent thérapeutique embarqué et de suivre en imagerie le passage des nanoparticules, du sang au cerveau avec différents types de contrôles. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Le succès de ces travaux et nos dernières études ont démontré la quasi-innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie.
Bénéfices attendus
Grâce au profil pharmacologique et à l’optimisation de nos composés, nous pourrons envisager de meilleurs effets pharmacologiques /thérapeutiques notamment par la capacité de délivrer une large quantité d’agents encapsulés dans nos nanoparticules. Les correcteurs transitoires d’ADN (dont les ARN messagers et interférents) sont de plus en plus reconnus comme ayant un potentiel révolutionnaire thérapeutique, notamment par leur capacité à moduler transitoirement l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies. Ces entités thérapeutiques peuvent présenter de multiples effets définis par leur design (activation/répression, correction de la transcription de l’ADN en ARN messagers, etc.). Ainsi les limites des applications et des cibles de ces molécules thérapeutiques vont bien au-delà des approches classiques (petites molécules, anticorps, protéines, peptides, etc…). En théorie, ces thérapies pourraient être développés pour toute pathologie et même personnalisables pour chaque patient pour restaurer les fonctions déficientes. C’est particulièrement le cas pour toute pathologie présentant une composante génétique identifiée (maladie génétiques type myopathie de Duchenne, cancers, pathologies neurodégénératives, etc…). Bien qu’ils présentent une excellente sélectivité d’action, grâce à leur appariement précis sur une cible donnée, ils souffrent d’un handicap majeur pour permettre leur développement et leur essor dans l’arsenal thérapeutique : en tant que macromolécules chargées, leurs propriétés physicochimiques, leur stabilité et leur taille ne leur permettent pas de traverser les barrières biologiques à des doses acceptables. En outre, bien qu’ils présentent spontanément une affinité préférentielle pour les organes d’excrétion, avec notamment une accumulation au foie, ils ne se distribuent que très peu dans autres les tissus.
Procédures
Dans la procédure 1 un les animaux subiront une injection dans la queue en contention (durée < 1 min) puis seront stabuler jusqu’à 14 jours post injection avant mise à mort par un surdosage d’un mélange d’anesthésique/analgésique (15min entre l’injection et la mise à mort). Dans la procédure 2 qui se déroule entièrement sous anesthésie générale gazeuse induite en boite (2 min) puis maintenue au masque tout au long de la procédure (jusqu’à 3 heures incluant la session d’imagerie). Ensuite les animaux reçoivent des analgésiques systémiques et locaux (2 min) avant de subir la chirurgie d’implantation d’une chambre optique. Cette fenêtre osseuse est ménagée dans le crâne au-dessus du cortex avec un trépan (10 min) puis une lame de verre est déposée au-dessus puis scellée avec un ciment orthopédique (10min). L’animal est ensuite installé sous le microscope (10min). La procédure d’imagerie commence par une injection caudale d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min). S’en suit l’acquisition en imagerie du réseau vasculaire cérébral (10 min). Les nanoparticules sont ensuite injectées de la même manière (1 min) et s’en suit l’acquisition en imagerie durant 2h30 avant la mise à mort de l’animal par surdosage d’un mélange d’analgésique/anesthésique. Dans la procédure 3, les animaux reçoivent la veille en contention soit une injection IV caudale de VEGF A soit d’une NP chargée avec un ARNm Cre (1 min). Le lendemain il subissent la même chirurgie d’implantation, session d’imagerie et protocole de mise à mort que ceux décrits ci-dessus (durée totale 3H).
Impact sur les animaux
Nos conjugués reconnaissent une cible fortement exprimée au niveau des vaisseaux sanguin du cerveau, et sont relativement bien tolérés. Cependant, toute nouvelle entité peut présenter des effets indésirables malgré des évaluations préalables. Pour limiter la douleur et la souffrance, un suivi quotidien est mis en place, avec évaluation comportementale et attribution d’un score de sévérité (non présent, modéré, sévère) pour les procédures éveillées. L’apparition d’un score sévère constitue le point limite et déclenche immédiatement la mise à mort des animaux. Ces mesures garantissent la protection des animaux tout en préservant la fiabilité des résultats expérimentaux. Les points limites liés à l’administration des composés sont : tout signe de toxicité. Pendant les 24h décisives ces points concernent les constantes vitales ainsi que le comportement des animaux. Pour les procédures chirurgicales et la session d’imagerie sous anesthésie générale, les points limites qui seront observés concernent : les constantes vitales au cours de l’anesthésie et les potentiels dommages que pourrait subir le cerveau pendant la chirurgie. Pour les sessions d’imagerie, une partie des études sont classées sans réveil (toutes les sauf « rupture de BHE et NP-ARNm Cre » où les animaux reçoivent une injection la veille : classe modérée). Tous les gestes suivants jusqu’à la mise à mort sont réalisés sous anesthésie générale. L’autre procédure (efficacité pharmacologique), de classe modérée, comprend une injection en contention, une période de stabulation puis une injection terminale avant récupération des tissus/sang pour post analyses. De fait, les seuls stress rencontrés seront des administrations en contention et l’induction des anesthésies (le projet inclura des anesthésiques et analgésiques). Quasiment aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, en termes de toxicité (données antérieures et élimination rapide). Les volumes d’administration sont en accord avec la littérature. L’administration de ces NP peut potentiellement engendrer un léger impact transitoire sur les constantes sanguines (environ 1h post-administration sans conséquences pour le bien-être des animaux) selon nos données antérieures. Il est à noter que nous avons une grande connaissance de l’innocuité de nos composés (toxicité, risques immunogènes) ainsi qu’une maitrise de leur pureté (>97% selon nos standards) et des taux d’endotoxines comparables à une étude clinique humaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure
Remplacement
Toutes études de mesures pharmacologique ou d’imagerie en temps réel, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de variants génétiquement modifiés ; la souris est l'espèce idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3R, la conformité vis à vis des et du cahier des charges. A noter que la présélection des vecteurs, des NP et des agents thérapeutiques embarqués passent par une phase de criblage in silico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont testés in vitro sur lignées cellulaires avant de passer aux phases in vivo (souches sauvages et génétiquement modifiées) et d’envisager dans d’autre projet un passage au primate non-humain en fin d’étude préclinique. Ce faisant nous respectons scrupuleusement tous les outils à disposition pour sélectionner nos composés avant d’envisager une étude chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs (N.S. one-way anova). Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous nous basons sur notre historique de résultats, notamment au niveau de la reproductibilité inter-individuelle, et d’un plan d’expérience aboutissant à un n=4 pour la première procédure dans chaque groupe et un n=6 pour les procédures d’imagerie 2 et 3.
Raffinement
Pour la procédure d’efficacité pharmacologique, les administrations en contention (très rapides
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé (physiologie connue et proche de l’homme). Il facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la pharmacologie (diminution des quantités administrées). On l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes sans trop de contraintes de stabulation. La souris est également idéale lorsqu’il s’agit de mette en place l’élevage d’une lignée. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés y ont été développés et sont disponibles, dont ceux inclus dans ce projet. Enfin l'utilisation de souris est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler différentes formes de notre récepteur d’intérêt « forme sauvage mais aussi génétiquement modifiée sous sa forme humanisée). Enfin les animaux inclus seront des mâles et femelles à un stade de développement adulte.
Plasticité neuroanatomique du système opioïde en conditions neuropathiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Testées cinq jours de suite, opérées en dix minutes, puis testées tous les trois jours pendant deux semaines et une fois par semaine pendant dix semaines, 420 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. À quatre, huit et douze semaines après la chirurgie, elles sont séparées de leurs congénères cinq heures, testées deux jours de suite, puis séparées quinze heures. La douleur induite persiste au moins six mois dans l'un des deux protocoles, et le porteur indique que les analgésiques ne peuvent pas être administrés puisque les mécanismes de sa chronicité sont l'objet même de l'étude. Vient enfin la chirurgie terminale, sous anesthésie profonde, que le résumé justifie en quatre mots, "mise à mort pour prélèvement".
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitements actuels y compris les opiacés, tels que la morphine, ciblant le récepteur opioïde mu. Elle s’accompagne également de comorbidités de type anxio-dépressif plus fréquentes chez les femmes. Le système opioïde est un acteur clé de la modulation du seuil de sensibilité et de l’humeur. Il est composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par la libération de neuropeptides opioïdes endogènes. La compréhension des changements affectant ce système en condition neuropathique est donc essentielle pour appréhender son rôle dans le développement de la douleur mais aussi dans l’apparition des comorbidités émotionnelles. Elle est également cruciale pour identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos résultats antérieurs ont montré que les récepteurs opioïdes mu et delta peuvent s’associer et que leur interaction est associée avec une diminution de la douleur en condition neuropathique. Notre objectif est donc de cartographier les changements intervenant dans leur distribution dans le cerveau. Un modèle de douleur neuropathique dans lequel le seuil de sensibilité mécanique revient progressivement au niveau initial et un modèle dans lequel il reste faible de façon durable seront comparés pour déterminer si la plasticité observée est strictement associée au développement de la douleur ou si elle est également prédictive de la capacité de récupération. L'objectif global du projet est une compréhension fine des altérations du système opioïde qui interviennent en condition neuropathique afin de déterminer l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier les changements induits par la condition neuropathique et de déterminer leur implication dans le développement de la douleur. Elle permettra aussi de déterminer les potentielles différences liées au sexe, au caractère réversible ou pas de l’hypersensibilité mécanique et au développement ou non des comorbidités de type anxio-dépressif. Au final, cette étude améliorera notre compréhension de la plasticité du système opioïde et, plus particulièrement, du rôle et de l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Procédures
Un premier groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Le comportement de l’animal est également évalué 4, 8 et 12 semaines post-chirurgie sur une séquence de 4 jours comprenant une séparation des congénères pendant 5 heures le premier jour, un test de 5 minutes le 2ème jour, un test de 10 minutes le 3ème jour et une séparation des congénères de 15h le 4ème jour. Un deuxième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis ensuite 1 fois par semaine. Au bout de 4 ou 8 semaines, une injection de 10 secondes sera pratiquée sur animal vigile suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes suivie 4 ou 8 semaines plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un quatrième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Au bout de 4 ou 8 semaines, il subira une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un cinquième groupe de souris adultes vigiles recevra 1 injection de 10 secondes suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes .
Impact sur les animaux
Les deux modèles de douleur utilisés entraînent une douleur modérée qui perdure pendant au moins 6 mois dans l’un des modèles tandis que dans l’autre modèle les animaux récupèrent spontanément au bout de 3 mois. L’identification des mécanismes responsables du caractère chronique de la douleur représente le sujet de l’étude ; Par conséquent, les analgésiques ne peuvent être utiliser pour soulager la douleur. Par ailleurs, la chirurgie induit une inflammation et, potentiellement, une perte de poids transitoire.
Devenir
mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Les changements au niveau cérébral induits dans les modèles de douleur ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant. Le système opioïde exerce un rôle neuromodulateur similaire chez l‘homme et la souris qui constitue dès lors un bon modèle pour en étudier les altérations dans des modèles de douleur reproduisant les signes cliniques observés chez l'homme.
Réduction
Une veille de la littérature sera effectuée durant toute la durée du projet afin de s'assurer du caractère original des expériences proposées et d'intégrer toute nouvelle donnée qui permettrait de réduire le nombre de paramètres à tester. Des expériences pilote sur des groupes d'animaux de taille réduite seront menées pour toute mise au point de protocole. Le nombre d'animaux est déterminé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (enrichissement, groupes sociaux, transfert de cage avec utilisation de tubes) et de manipulation (habituation à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation) des animaux sont optimisées pour respecter leur besoin d'interaction sociale et réduire le stress des animaux. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie générale et de façon à minimiser les effets négatifs sur l’animal (tapis chauffant, gel oculaire). Des points limites sont établis pour chaque procédure pour prévenir toute souffrance inutile. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.
Choix des espèces
L'espèce animale a été choisie car (1) ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et (2) cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. l'étude sera réalisée sur des souris agées de 6 semaines ou plus.
Etude du contrôle astrocytaire des fonctions et dysfonctions cérébrales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 400 souris vont être utilisées, chacune subissant une injection intracérébrale de trente minutes et, pour certaines, trois injections supplémentaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'accès au cerveau passe par une incision de la peau et une perforation du crâne, suivies d'une douleur et d'une gêne post-opératoires pendant les premiers jours, d'une perte de poids transitoire et d'un risque d'infection de la suture. Toutes sont tuées environ vingt jours après le début des expériences, pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce des retombées "majeures" sur la compréhension du rôle des astrocytes et de nouvelles pistes pour des pathologies neurologiques ou psychiatriques, sans que le projet comporte lui-même d'essai thérapeutique.
Objectifs
Le cerveau est composé de milliards de cellules appelées neurones, qui permettent de penser, bouger, ressentir et mémoriser. Mais les neurones ne sont pas seuls : le cerveau contient aussi un autre type de cellules très nombreuses, appelées astrocytes, dont le rôle est longtemps resté sous-estimé. On sait aujourd’hui que les astrocytes ne se contentent pas de « soutenir » les neurones, mais qu’ils participent activement au fonctionnement du cerveau. Ils peuvent influencer l’activité des neurones, la manière dont les messages nerveux circulent, et l’organisation globale des réseaux cérébraux. Lorsque ces cellules ne fonctionnent pas correctement, cela pourrait contribuer à certaines maladies du cerveau. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les astrocytes agissent sur l’activité du cerveau, dans des conditions normales et lorsque ces mécanismes sont perturbés. Plus précisément, nous cherchons à comprendre comment les astrocytes communiquent entre eux, comment ils utilisent certains signaux internes pour fonctionner, et comment ils contribuent à maintenir l’équilibre chimique nécessaire au bon fonctionnement des neurones. En étudiant ces mécanismes dans le cerveau, ce projet vise à établir des liens clairs entre le fonctionnement des astrocytes et l’activité des neurones. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre comment le cerveau fonctionne normalement et pourquoi certains dysfonctionnements peuvent apparaître.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer notre compréhension du rôle des astrocytes dans la régulation des fonctions cérébrales, aussi bien en conditions normales que pathologiques. En identifiant les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les astrocytes influencent l’activité neuronale et les réseaux corticaux, ce travail pourrait contribuer à renouveler en profondeur notre vision du fonctionnement du système nerveux central. Les résultats attendus auront donc des retombées majeures non seulement sur le plan fondamental en enrichissant les connaissances sur les interactions neurogliales, mais aussi sur le plan biomédical, en ouvrant de nouvelles pistes pour la compréhension de pathologies neurologiques ou psychiatriques impliquant un dysfonctionnement des cellules gliales.
Procédures
Injection intracérébrale (1/animal, 30 minutes environ). Des injections complémentaires pourront être réalisées chez certains animaux (3/animal, 1 minute environ).
Impact sur les animaux
La procédure d’injection intracérébrale (environ 30 min) est susceptible d’entraîner plusieurs types de nuisances chez les animaux : 1. Un stress chirurgical associé à l’anesthésie générale et à l’injection intracérébrale pendant les heures suivant l’intervention. 2. Une douleur et une gêne post-opératoire liée à l’incision cutanée et à la perforation du crâne nécessaire à l’injection intracérébrale durant les premiers jours post-opératoires. 3. Une perte de poids transitoire dans les jours suivant l’intervention. 4. Un risque d’infection localisé au niveau de la suture.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études biochimiques ou immunohistochimiques, ou pour réaliser des techniques de patch-clamp et de field recording, d'imagerie calcique ou de réseaux multélectrodes.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions entre neurones et astrocytes dans un contexte fonctionnel intégré, au sein d’un cerveau intact. Or, les modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, les simulations informatiques, ou les organismes plus simples (comme la drosophile ou Caenorhabditis elegans) ne permettent pas de reproduire la complexité du cerveau des mammifères, ni les interactions spécifiques entre neurones et astrocytes dans leur environnement naturel. Il n’est donc pas possible, dans le cadre de ce projet, de remplacer l’expérimentation animale par des approches alternatives tout en conservant la pertinence scientifique des résultats obtenus.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des groupes de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Par ailleurs, chaque souris est utilisée comme son propre contrôle, grâce à une injection bilatérale : l’hémisphère recevant la condition expérimentale est comparé à l’hémisphère opposé injecté avec une condition de référence. Cette approche de comparaison intra-individuelle permet de limiter significativement le nombre d’animaux requis. Ainsi, 10 animaux par groupe sont nécessaires. Enfin, le recours à des vecteurs viraux ciblés permet de réduire le nombre de lignées transgéniques à générer, croiser et maintenir, contribuant ainsi à la réduction globale de l’utilisation d’animaux dans le projet.
Raffinement
Les injections intracorticales seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention afin de prévenir l’hypothermie per-opératoire. Après la chirurgie, les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique quotidienne. Une grille d’évaluation standardisée intégrant des critères d’apparence (toilettage, posture, aspect du pelage) et de comportement (locomotion, interactions sociales, prise alimentaire) sera utilisée pour détecter précocement toute altération du bien-être. Cette surveillance permettra d’identifier d’éventuels points limites justifiant une intervention rapide.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il présente une organisation du cerveau proche de celle de l’homme, permettant d’étudier de manière pertinente le fonctionnement des cellules cérébrales dans un contexte comparable. La souris est également l’espèce pour laquelle il existe un large éventail de modèles génétiquement modifiés, indispensables pour étudier de façon ciblée le rôle de certaines cellules et de certains mécanismes biologiques dans le cerveau. Ces outils ne sont pas disponibles, ou de manière très limitée, dans d’autres espèces animales. Enfin, le modèle murin présente également des caractéristiques biologiques permettant une gestion maîtrisée des effectifs, garantissant la disponibilité d’un nombre suffisant d’animaux pour les besoins du projet tout en limitant le recours à un nombre élevé d’animaux reproducteurs. Les expériences sont initiées chez des souris âgées d’environ un mois, car les animaux sont ensuite mis à mort environ 20 jours plus tard, à un âge où les circuits cérébraux sont fonctionnellement matures.
Evaluation du bien-être animal d’une nouvelle lignée murine crée par le système Crispr/Cas9.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux d'une lignée voisine meurent avant le sevrage dans 40 à 50 % des cas, dont environ 60 % dans les quarante-huit heures suivant la naissance, et le porteur n'exclut pas de retrouver les mêmes atteintes dans la lignée qu'il crée ici. 240 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères et réduites à des observations non invasives, pour évaluer ce que le porteur appelle le "bien-être animal" de cette lignée obtenue par Crispr/Cas9. Dans cette lignée voisine, les survivants présentent une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une activité motrice réduite. Les souris affectées à l'étude comparative sont mises à mort, celles retenues pour l'évaluation restant en vie pour la reproduction.
Objectifs
Cette demande s’inscrit dans le cadre de la création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, avec pour objectif principal d’évaluer les conséquences de cette altération génétique sur le bien-être animal, tout en les comparant à celles observées dans des modèles murins existants disponibles au sein de notre équipe. Cette approche comparative est essentielle afin de situer précisément les effets propres à la modification ciblée et d’en apprécier la spécificité. La lignée développée cible une région génomique impliquée dans une maladie humaine rare. À ce titre, ce modèle s’inscrit à l’interface entre recherche fondamentale et recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Nous considérons que ces travaux sont susceptibles d’améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques associés à cette pathologie, en particulier durant la période périnatale. Enfin, cette nouvelle lignée pourrait constituer un modèle préclinique pertinent, complémentaire des modèles existants, permettant d’explorer plus finement le rôle des éléments génétiques impliqués, notamment dans le contexte périnatal. Elle offrirait ainsi un outil original pour étudier l’émergence des phénotypes et, à plus long terme, pour identifier de potentielles cibles thérapeutiques.
Procédures
Cette évaluation est basée sur des observations non invasives.
Impact sur les animaux
La lignée développée ici cible une petite région génomique qui chez un autre modèle de la pathologie que nous étudions est altérée pour deux autres gènes. Cette dernière présente de la mortalité en période périnatale ainsi que des défauts métaboliques. 40 à 50 % des individus mutants décèdent avant le sevrage, dont environ 60 % dans les 48 heures suivant la naissance. Les souriceaux présentent un métabolisme altéré, caractérisé par une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une diminution de l’activité motrice spontanée. Les individus survivants apparaissent ensuite globalement normaux, malgré un poids corporel inférieur à celui des témoins. L'objectif étant de déterminer la contribution potentielle de ce gène dans les phénotypes observés il n'est pas exclu d'observer les mêmes altérations pour cette nouvelle lignée.
Devenir
Tous les animaux d'interêt pour l'évaluation du bien-être animal sont gardés en vie pour la reproduction. Tous ceux pour l'édude comparative sont mis à mort.
Remplacement
Nos gènes d’intérêts sont exclusivement retrouvés chez les mammifères placentaires et sont exprimés uniquement dans le cerveau. Ce mode d’expression strictement neuronal, associé à leur apparition tardive au cours de l’évolution des mammifères, restreint considérablement le choix de modèles d’étude biologiquement pertinents. Ainsi, toutes les études publiées à ce jour ont été menées chez la souris, d’autant que ce modèle reproduit certains traits pathologiques caractéristiques de la maladie. Enfin, notre demande porte sur un stade de développement crucial : la naissance. À ce jour, il n’existe aucun modèle alternatif crédible et biologiquement pertinent pour cette étude.
Réduction
Pour étudier les individus sur 2 générations à partir de la G1, nous souhaitons produire 4 mâles fondateurs par génération pour s’affranchir des mutations non voulues et augmenter la diversité génétique. Donc en croisant chaque mâle avec 2 femelles et en raison de 6 naissances par portées nous estimons pouvoir obtenir d'après les rapports Mendélien 12 souris par sexe et par génotype. Il s'agit là d'un chiffre théorique qui nous permettra d'obtenir les 7 animaux minimum par sexe recommandés par le guide européen.En ce qui concerne la génération de la colonie, notre stratégie de croisement permet de limiter le nombre d’animaux produit. Nous attendons à ce que 50 % des souriceaux présentent la délétion pour notre gène d’intérêt contre seulement 25 % avec des croisements classiques.
Raffinement
Ce projet a pour objectif d’évaluer le bien-être des individus générés suite à la création d’une nouvelle lignée. Cette évaluation portera sur les individus issus de deux générations de la mise en place de la colonie. Il s’agit dans un premier temps de faire un suivi non invasif des souris basé sur l’observation pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Cette surveillance sera quotidienne. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation. Des points limites précoces seront mis en place. Si les animaux présentent des signes de souffrance alors ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour ont été réalisés chez la souris. Ce modèle murin est donc devenu la référence incontournable dans notre domaine de recherche, car il permet non seulement d’établir des comparaisons avec les données existantes dans la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant la répétition d’expériences déjà publiées et donc pouvant être considérées comme inutiles sur le plan éthique. Notre demande porte sur un stade de développement crucial, la naissance, jusqu'à l'âge adulte.
Étude des altérations précoces de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de la trisomie 21
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour prélever leur cerveau, ou tuées faute de pouvoir être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique, 1 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un dixième d'entre elles développe une accumulation de liquide dans le cerveau, et toutes sont plus petites et plus légères que les souris sans cette modification. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage sur animal éveillé, une injection de traceur fluorescent sous anesthésie brève et, pour une partie, un prélèvement sanguin. Le porteur retient la souris parce que son génome est modifiable et que la barrière cérébrale y est complète dès la troisième semaine, et fixe l'examen à un et trois mois, avant l'apparition des signes de vieillissement.
Objectifs
Le syndrome de Down, aussi appelé trisomie 21, est la cause génétique la plus fréquente de déficience intellectuelle. Il est dû à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire, en totalité ou en partie. Les personnes porteuses de trisomie 21 présentent également un risque très élevé de développer une maladie d’Alzheimer précoce. Le cerveau est protégé par une barrière naturelle appelée barrière hémato-encéphalique. Cette barrière agit comme un filtre très sélectif : elle contrôle strictement ce qui peut passer du sang vers le cerveau afin de maintenir son bon fonctionnement. Elle est formée par différents types de cellules qui travaillent ensemble au sein d’une structure appelée unité neurovasculaire. Lorsque cette barrière est endommagée, des substances normalement exclues du cerveau peuvent y pénétrer, ce qui peut perturber son fonctionnement. Une altération de cette barrière est observée dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer. Des travaux récents suggèrent que la barrière hémato-encéphalique pourrait également être fragilisée chez les personnes atteintes de trisomie 21 et de maladie d’Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore si ces altérations apparaissent très tôt au cours de la vie en raison de la trisomie elle-même, ou si elles sont une conséquence plus tardive des mécanismes liés à la maladie d’Alzheimer. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène en étudiant si la barrière hémato-encéphalique est déjà altérée dès les premières étapes de la vie dans la trisomie 21. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées reproduisant les principales caractéristiques génétiques de la trisomie 21. Grâce à des méthodes complémentaires bien établies, nous chercherons à déterminer si la barrière protectrice du cerveau laisse passer des molécules anormalement et à identifier les changements affectant les cellules qui assurent son bon fonctionnement.
Bénéfices attendus
Jusqu’à présent, la recherche sur la barrière protectrice du cerveau dans la trisomie 21 s’est surtout intéressée aux périodes tardives de la vie, lorsque les lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer sont déjà bien installées. En revanche, ce qui se passe très tôt dans la vie, bien avant l’apparition de ces lésions, reste largement méconnu. Cette absence de données rend difficile la compréhension de ce qui déclenche réellement la maladie, par opposition à ce qui en est une conséquence. Dans la trisomie 21, plusieurs facteurs liés à la présence d’un chromosome supplémentaire, comme une inflammation chronique, des perturbations du métabolisme ou des réactions immunitaires anormales, pourraient fragiliser dès le plus jeune âge la barrière qui protège le cerveau. Une telle fragilité précoce pourrait, à long terme, favoriser l’apparition de troubles neurologiques. Malgré l’hypothèse largement admise selon laquelle un dysfonctionnement de cette barrière pourrait jouer un rôle clé dans l’apparition précoce et l’évolution rapide de la maladie d’Alzheimer chez les personnes atteintes de trisomie 21, aucune étude n’a jusqu’à présent examiné de manière approfondie l’état de cette barrière dans des modèles animaux représentatifs de la trisomie 21. Ce projet est donc le premier à s’intéresser à l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dès le début de la vie dans un modèle de souris de la trisomie 21. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc, à court terme, de pouvoir révéler un potentiel problème jusqu’ici insoupçonné dans la circulation sanguine du cerveau et ainsi ouvrir la voie à de nouvelles recherches pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. A plus long terme, cela pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement.
Procédures
Pour identifier les souris porteuses de la modification génétique d’intérêt, un très petit prélèvement de tissu sera réalisé pour tous les animaux (une seule fois, d’une durée inférieure à une minute, animal vigile). En cas de problème technique rare, un second prélèvement pourrait être effectué chez ces mêmes animaux, à l’âge adulte et à l’état éveillé, également d’une durée inférieure à une minute et réalisé une seule fois. Une partie des animaux recevra une injection d’une molécule permettant de vérifier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, elle sera effectuée sous anesthésie générale de très courte durée (une seule injection d’une durée inférieure à 1 minute, durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Une partie des souris aura également un seul prélèvement sanguin (durée inférieure à cinq minutes, animal vigile).
Impact sur les animaux
La biopsie pour identifier le patrimoine génétique des animaux peut causer une douleur passagère et un petit risque de saignement. Les souris utilisées dans cette étude présentent une modification génétique spécifique et, dans 10 pourcents des cas, une accumulation de liquide dans le cerveau, appelée hydrocéphalie. Ces souris sont aussi plus petites et plus légères que les souris ne présentant pas cette modification génétique. Lors des manipulations nécessaires aux injections et aux prélèvements, les souris peuvent ressentir un stress léger et passager. Une douleur brève peut également être ressentie au moment de la piqûre. Les injections peuvent entraîner un inconfort temporaire et un faible risque de saignement. Dans de rares cas, une irritation ou une atteinte de l’œil peut survenir. Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection, celle-ci peut entraîner quelques effets secondaires, comme une légère baisse de la température corporelle, une sécheresse des yeux, et dans de très rares cas, des problèmes respiratoires ou cardiaques. Toutefois, cette anesthésie générale sera très courte et présente donc des risques moins importants. Les prélèvements de sang peuvent occasionnellement provoquer un saignement persistant.
Devenir
Une partie des souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser des cerveaux dans le but de répondre à notre question scientifique. Toutes les autres souris seront euthanasiées car elles ne pourront pas être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Il n'existe malheureusement pas d'alternative à l'utilisation d'animaux pour ces recherches. Pour étudier comment le cerveau est protégé et comprendre quand cette protection devient défaillante, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris. La barrière qui protège le cerveau ne dépend pas d’un seul type de cellule, mais du travail coordonné de plusieurs cellules différentes (cellules des vaisseaux sanguins, cellules de soutien, neurones et cellules immunitaires). Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de façon fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’injection de substances fluorescentes de tailles différentes permet de vérifier si cette barrière joue correctement son rôle de filtre. En observant si ces substances restent dans les vaisseaux sanguins ou si elles passent anormalement dans le tissu cérébral, il est possible de déterminer si la barrière est fragilisée et dans quelle mesure. Après ces injections, l’analyse du cerveau est indispensable pour visualiser précisément où ces substances se sont accumulées et pour étudier les changements affectant les cellules qui composent les vaisseaux du cerveau. Ces observations sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles de la barrière protectrice du cerveau et, à terme, pour améliorer la prévention et le traitement des maladies neurologiques.
Réduction
Sur une période de quatre ans, ce projet utilisera au maximum 1085 souris. Ce nombre a été soigneusement calculé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les souris utilisées seront élevées au sein du laboratoire tout au long du projet. L’élevage sera géré de façon raisonnée, avec pour objectif de ne produire que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Tous les paramètres ont été pris en compte, comme la proportion de souris réellement porteuses du gène étudié, la nécessité d’obtenir autant de mâles que de femelles, ou encore les difficultés de reproduction propres à cette lignée. Dans nos lots expérimentaux nous inclurons des souris mâles et femelles, ainsi que des animaux jeunes et adultes, afin de tenir compte des différences naturelles liées à l’âge et au sexe. Nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 15 à 20 animaux, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables sans multiplier inutilement le nombre de souris. Les résultats que nous obtiendrons seront ensuite analysés avec les tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris seront élevées et hébergées dans des conditions strictement conformes à la réglementation. Les animaux provenant d’un élevage extérieur disposeront d’une semaine d’adaptation après leur arrivée avant d’être utilisés pour la reproduction. Les souris auront accès librement à l’eau et à la nourriture. Elles vivront également dans un environnement adapté à leur bien-être, avec du matériel pour faire un nid, ronger et se cacher. Elles seront observées quotidiennement et, au moindre signe anormal, l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire seront immédiatement informés afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée. Des mesures préventives seront mises en place pour réduire tout impact des procédures expérimentales sur les animaux. Cela comprend la formation du personnel, la surveillance constante des animaux, et des méthodes pour les habituer à la manipulation avant les expériences. Pour identifier les souris nécessaires à l’étude, un très petit prélèvement est réalisé chez des animaux très jeunes. Ce geste est conçu pour être le moins invasif possible et permettre une cicatrisation rapide. Les souris sont surveillées juste après le prélèvement, puis un peu plus tard, afin de s’assurer de leur bon état. Le choix d’utiliser uniquement des mâles porteurs des modifications génétique d’intérêt comme reproducteurs permet à la fois de faciliter la prise en charge des portées par les mères et de limiter le nombre d’animaux présentant des fragilités liées à leur génétique. Afin de réduire au maximum le stress et toute douleur lors des injections, les souris sont placées sous anesthésie générale de courte durée. Pendant toute la procédure, leur état est étroitement surveillé. Des mesures simples seront mises en place pour assurer le confort des animaux, comme le maintien de leur température corporelle et l’application d’un gel protecteur sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et de limiter les irritations après l’injection. Après l’intervention, les animaux sont surveillés attentivement pendant leur réveil dans un environnement chauffé.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté pour étudier le syndrome de Down et ses effets sur le cerveau. En effet, la souris est un modèle bien connu et largement utilisé pour modéliser les pathologies humaines. Notamment, son génome est parfaitement connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi un modèle de souris génétiquement modifiées possède une copie supplémentaire d’une grande partie des gènes du chromosome correspondant au chromosome humain 21, et il reproduit plusieurs caractéristiques importantes du syndrome de Down. Cette lignée de souris permet d’étudier très tôt dans la vie l’intégrité et la perméabilité de la barrière qui protège le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique, ainsi que les modifications des vaisseaux sanguins et l’inflammation dans le cerveau. Chez les souris, cette barrière cérébrale est pleinement développée dès la troisième semaine après la naissance. Les signes liés au vieillissement ou à la maladie d’Alzheimer, comme la perte de certaines protéines et de neurones, ou l’accumulation de molécules toxiques dans le cerveau, n’apparaissent qu’après neuf mois. C’est pourquoi nous étudierons les souris génétiquement modifiées à 1 et 3 mois. Cette approche nous permettra de savoir si les premières altérations de la barrière cérébrale apparaissent avant les autres signes caractéristiques de la maladie, et de déterminer si ces changements vasculaires et au niveau de la barrière peuvent servir de marqueurs précoces du syndrome de Down. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leur modification génétique très tôt.
Evaluation de l’impact d’une protéine sur la formation, la stabilité et la dissolution d’un caillot sanguin au cours d’un accident vasculaire cérébral chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une moitié des souris est maintenue sous anesthésie jusqu'à sa mise à mort, sans jamais reprendre conscience. 360 souris vont être utilisées, 180 dans ce régime sans réveil et 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang, le caillot et les tissus. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par une intervention chirurgicale d'environ une heure trente avec injection dans le cerveau, suivie selon les groupes d'une observation au microscope pouvant durer deux heures. Le porteur affirme que seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau et la réaction des cellules immunitaires lors d'un AVC, après des essais préalables menés sur du sang de souris.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux dits ischémiques sont dus à un caillot, qui bloque la circulation sanguine dans une artère cérébrale. La résistance de ces caillots aux traitements varie selon les individus. Ce projet étudie une protéine présente dans les vaisseaux sanguins qui, lorsqu’elle circule dans le sang, peut limiter la formation des caillots ou destabiliser les caillots. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de cette protéine, pour empêcher la formation du caillot, ou le déstabiliser une fois formé. Cette protéine permettra de proposer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter les accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la protéine étudiée dans la formation et la dégradation des caillots lors d’un accident vasculaire cérébral. L’ischémie cérébrale, due à l’occlusion d’une artère, endommage les tissus cérébraux et altère les fonctions cérébrales. Plus cette occlusion persiste dans le temps, plus les dommages causés au cerveau deviennent irréversibles pour les patients. Cette étude pourrait ouvrir la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique visant à rétablir ou améliorer la circulation sanguine dans les artères cérébrales et ainsi limiter les séquelles liées à l’ischémie. À terme, cette approche pourrait contribuer à réduire la survenue des complications et la mortalité associées aux accidents vasculaires cérébraux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront d’améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la formation et la dégradation des caillots, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Les animaux seront répartis en différents groupes selon les expériences réalisées. Ils recevront jusqu’à trois administrations de traitement contre la douleur, chaque administration durant environ 30 secondes. Selon les groupes, une anesthésie générale sera réalisée soit pour une intervention chirurgicale d’une durée totale d’environ 1 heure 30 minutes, soit pour une observation au microscope d’une durée maximale de 2 heures. Une injection d’un marqueur permettant la visualisation du caillot, sera effectuée avant cette observation (environ 30 secondes). Plusieurs administrations de molécules seront réalisées à différents moments de l’étude (30 minutes avant ou après l’intervention, ou 2 heures après), chaque administration durant moins d’une 1 minute. En fin d’étude, une anesthésie générale profonde sera réalisée afin de permettre le prélèvement des tissus. Enfin, une ou deux administrations de solution physiologique seront réalisées après la chirurgie pour assurer la réhydratation, chaque administration durant environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’induction d’un accident vasculaire cérébral dû à un caillot nécessite une intervention chirurgicale et une injection dans le cerveau, réalisées sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus comprennent une douleur liée à la chirurgie, d’intensité modérée, prise en charge par un traitement contre la douleur. Selon les situations expérimentales, les animaux peuvent soit être maintenus sous anesthésie pendant toute la durée de l’expérimentation, soit être réveillés après l’intervention. Dans ce dernier cas, ils font l’objet d’un suivi attentif afin de limiter toute douleur ou souffrance.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées permettant de réduire l’utilisation d’animaux vivants. Ces expériences, faites sur du sang de souris, ont permis d’étudier comment la protéine d’intérêt influence la formation et la stabilité des caillots. Elles nous ont aussi aidés à réduire le nombre d’animaux nécessaires, en déterminant à l’avance la dose la plus adaptée pour les études suivantes. Cependant, pour comprendre l’effet de cette protéine dans un accident vasculaire cérébral, il est indispensable d’utiliser un modèle vivant. Seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau, et des cellules immunitaires lors d’un accident vasculaire cérébral, ce qui n’est pas possible avec des tests entièrement in vitro. Ces informations nous permettent de mener les expériences dans les meilleures conditions, en appliquant la règle des 3R pour limiter au maximum l’inconfort animal.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires se fonde sur des travaux précédents réalisés avec le même modèle d’AVC, sur des données de la littérature scientifique et sur l’utilisation d’un logiciel statistique spécialisé.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les interventions nécessitant une chirurgie seront faites sous anesthésie générale, avec des mesures destinées à assurer le confort des animaux avant, pendant et après l’intervention. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier les maladies cérébro-vasculaires, comme l’AVC, en reproduisant plusieurs caractéristiques observées chez l’humain, telles que les déficits comportementaux et l’évolution des lésions cérébrales dans le temps. Les mécanismes complexes impliqués dans l’AVC ischémique, incluant différents types cellulaires et des réponses immunitaires différentes, nous impose l’utilisation de modèle in vivo pour intégrer l’ensemble de ces phénomènes impliqués dans l’étude de l’évaluation d’un traitement préventif ou curatif. En sachant que les accidents vasculaires cérébraux touche principalement les adultes, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 2 à 3 mois. Ce choix garantit que les animaux sont à un stade de développement comparable à celui des patients adultes, tout en permettant une observation fiable des effets du modèle et des traitements testés.
Collatérales: leur rôle dans la réorganisation vasculaire post-AVC ischémique.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Le crâne ouvert au-dessus de l'artère cérébrale moyenne, la tête maintenue immobile et sans anesthésie générale, 168 souris vont subir l'induction d'un accident vasculaire cérébral en étant éveillées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles enchaînent trois chirurgies, quatre jours d'habituation à la contention par sessions montant jusqu'à une heure trente, sept acquisitions d'imagerie ultrasonore vigiles et une IRM. Le porteur justifie l'AVC sur animal éveillé par la volonté d'écarter le biais de l'anesthésie, et prévoit un stress lié à la survenue de l'AVC ainsi que des déficits fonctionnels. Aucune souris n'est gardée en vie, le porteur jugeant impossible de réhabiliter des animaux ayant subi une ischémie et trop élevé le risque d'infection de la prothèse crânienne.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la circulation sanguine cérébrale collatérale est reconnue comme un acteur majeur de la physiopathologie de l'AVC ischémique : une bonne collatéralité étant identifiée comme protectrice dans les différentes phases de la pathologie et un facteur d'amélioration de l'efficacité d'un traitement thrombolytique (le traitement visant à rétablir une circulation sanguine normale). Toutefois, la collatéralité est très variable chez l'Homme. C’est pourquoi il est recommandé d'intégrer ce facteur pour l’intégration des patients dans les phases de recherche chez l'Homme, et les collatérales sont considérées comme des cibles prometteuses pour de nouvelles thérapies. L'investissement de la recherche dans ce domaine semble indispensable, dans ce cadre où l’AVC représente un enjeu de santé publique avec de forts impacts au niveau des populations et où trop peu de patients ont accès à un traitement. Il existe actuellement un problème de translation évident des résultats obtenus en laboratoire vers l'Homme, où malgré les recommandations, la collatéralité est rarement prise en compte en clinique. Parmi les facteurs pouvant expliquer ce décalage (difficultés de translation des résultats obtenus en laboratoire à la clinique, difficultés d’imagerie des collatérales en clinique, diversité des méthodes et critères d’évaluation de la collatéralité, etc.), le manque de connaissances fondamentales sur le rôle des collatérales dans l'AVC ischémique est notable. Les techniques classiques d’imagerie des collatérales sous anesthésie pouvant modifier le fonctionnement cérébral, elles peuvent interférer avec le fonctionnement des collatérales. L’objectif de ce projet est d’augmenter nos connaissances sur la collatéralité dans l’AVC grace à un modèle d'ischémie cérébrale chez la souris vigile. Cela grace à l'imagerie ultrasonore. L'imagerie ultrasonore utilise des ultrasons pour fournir une image d'une manière similaire à l'échographie. Mais ici avec l'imagerie dites Microscopie de Localisation Ultrasonore (ULM) en vigil, l'image révèle l'anatomie des vaisseaux sanguins cérébraux. Et avec l'imagerie Fonctionnelle UltraSonore (fUS) en vigil, l'image révèle des informations fonctionnelles (un signal en fonction du temps) qui indique le fonctionnement du cerveau.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant d'augmenter les connaissances fondamentales sur la collatéralité dans l'AVC à court, moyen et long terme, tout en évitant le biais de l'anesthésie, les bénéfices seraient de mieux comprendre le rôle des collatérales dans l'AVC et ainsi de promouvoir la recherche de solutions thérapeutiques en lien avec celles-ci.
Procédures
Les animaux seront soumis : A 3 chirurgies : - Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie analgésie d'une durée de 20 minutes; - Une chirurgie permettant une pose d'un cathéter dans la veine de la queue de la souris pour injecter les traitement ainsi que l'accès à l'artère cérébrale moyenne en retirant le crane situé juste au dessus de l'artère dans laquelle sera faite l'injection pour modéliser l'AVC ischémique, sous anesthésie et analgésie, d'une durée de 30 à 45 minutes; - Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous analgésie et anesthésie locale. A 1 protocole comportemental : Un protocole d'habituation à la contention (le maintient immobile de la tête) pendant 4 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h30 au total. A 2 protocoles d'imagerie vigile : 7 acquisitions à l'imagerie ultrasonore soit fUS soit ULM, où chaque acquisition dure 10 minutes avec une injection de produit de contraste lors de chaque acquisition. Et 1 acquisition à l'IRM où chaque acquisition dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'appraître chez les animaux seraient : Des douleurs post opératoires après la pose de prothèse, un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, une perte de poids après les anesthésies et l'induction de l'AVC,des douleurs post opératoires après la chirurgie d'accès à l'artère cérébrale oyenne, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (168) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, le risque d'infection au niveau de la prothèse crânienne et de la craniotomie sont trop importants pour garder les souris en vie.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné en reprenant les données d'études antérieures comparant la taille des lésions ischémiques obtenues chez les souris Swiss versus souris C57 avec le modèle thromboembolique. Au cours de ce projet, chaque animal faisant l'objet d'un suivi longitudinal est son propre contrôle, grâce à l'utilisation de l'imagerie. Cela permet de ne pas faire de groupes supplémentaires pour chaque étape du projet où il est nécessaire de caractériser l'ischémie cérébrale, en plus de renforcer la validité des résultats. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet à été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. Nous avons principalement utilisé pour ce calcul les données obtenues sur l'ischémie vigile chez la souris Swiss (ayant peu de collatérales) et la C57 (ayant beaucoup de collatérales), pouvant mimer les résultats attendus dans notre étude avec les souris Rabep2-/- (peu de collatérales) et leur contrôles (ayant beaucoup de collatérales), on observe une moyenne du volume de lésion lié à l'ischémie de 10,18 mm3 (SD: 5,356) dans le groupe des souris Swiss, et de 10 mm3 (SD: 6,501) dans le groupe des souris C57. Pour un seuil de significativité à 95 % et une puissance de 80 % (beta = 20%), 15 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe. Cependant, nous avons observé un taux d'exclusion d'environ 40%. Car il peut arriver d'avoir des exclusions durant les nombreuses étapes de l'étude (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations, ...). Le nombre d'animaux a donc été augmenté à 21 par groupe, sachant qu'il sera réduit à 15 si aucun incident ne survient au cours du protocole.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Les cages seront pourvue de coton en quantité pour la fabrication d'un nid, paillettes, kraft et bout de bois pour ronger. Une période de récupération de 3 jours et prévue après la pose de la prothèse crânienne, durant laquelle les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigiles. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie, et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM. Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire. Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des point limites, les animaux seront mis à mort (anesthésie profonde suivie d'une dislocation cervicale) dans les 24 heures dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stopper, détresse cadiorespiratoire, échec) ; - perte de poids >15%. - décollement de la prothèse crânienne.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’influence de l’anesthésie sur le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. L'étude se déroulera sur une souches de souris C57BL/6-Rabep2em2Jef/J (Rabp2-/- et son contrôle) présentant des profils de collatérales différentes. Ces deux souches ont un fond génétique de C57BL6, régulièrement utilisée pour la recherche, et C57BL/6-Rabep2em2Jef/J est décrite comme une souche utile à l'étude de la circulation collatérale dans le contexte de l'AVC. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 6 et 10 semaines (6 semaines lors du début du protocole, et 10 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Etude de l’implication de récepteurs dans le cerveau dans la physiopathologie de la migraine et son traitement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une crise de migraine leur est provoquée par injection intrapéritonéale quotidienne, répétée cinq jours de suite, puis leur douleur est mesurée par des tests comportementaux durant de trente-cinq minutes à deux heures. Le porteur cherche à savoir si un récepteur déjà breveté par son équipe pour la douleur neuropathique joue aussi dans la migraine, et si une molécule capable de l'inhiber en efface les symptômes. Aucun analgésique ne peut être administré puisque la douleur est le paramètre mesuré, et les animaux qui développent des troubles du comportement sont tués sans délai.
Objectifs
La migraine est une pathologie très invalidante, touchant 12 à 15 % de la population. Les formes chroniques sont particulièrement difficiles à traiter et les traitements actuels ne soulagent pas toujours correctement les patients. Parmi les symptômes les plus handicapants on retrouve la sensibilité accrue au toucher, la sensibilité à la lumière et la douleur spontanée. Ces signes peuvent aussi être observés chez l’animal et servent alors de repères pour mieux comprendre la physiopathologie de la migraine. Nos travaux précédents ont montré que l’activation d’un récepteur neuronale est nécessaire et suffisante pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleurs liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Puisque les douleurs neuropathiques et les douleurs migraineuses partagent plusieurs mécanismes communs — comme une amplification anormale des signaux de douleur — nous pensons que ce même récepteur pourrait également être impliqué dans la migraine. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ce récepteur dans le développement et l’entretien des crises migraineuses, notamment au niveau du réseau de nerfs qui gère la sensibilité du visage, une zone clé dans la migraine. Nous testerons également si une molécule capable de bloquer ce récepteur pourrait diminuer la douleur, la sensibilité à la lumière et les autres symptômes associés. Ce travail pourrait ouvrir la voie à un nouveau traitement pour les personnes souffrant de migraine.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur l’intégration de l’information douloureuse et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes dans un contexte de douleur migraineuse. D’autre part, le manque d’efficacité des traitements de crises et prophylactique dans la migraine agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs provoquées par un dysfonctionnement nerveux, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Afin d’évaluer l’étendue potentielle du champ d’action de notre cible pharmacologique, nous nous intéressons maintenant au rôle de ce récepteur neuronal dans le développement de la migraine. Nous cherchons notamment à comprendre comment son activité participe à l’initiation et au maintien de la douleur. Grâce à ces avancées, nous espérons pouvoir identifier de nouveaux composés prometteurs, les tester en préclinique, puis ouvrir la voie à de futurs essais chez l’être humain afin de développer des traitements mieux adaptés aux personnes souffrant de douleurs chroniques, notamment des patients migraineux.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à une injection péritonéale par jour (durée d’intervention < 1 minute). Cette injection i.p. peut être répétée pendant 5 jours consécutifs. De plus, les animaux pourront recevoir, par voie orale et sous légère sédation, une solution de la substance d’étude ou une solution témoin le jour de la première injection i.p. ou le jour de la dernière injection i.p. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux de mesure de la douleur seront réalisés (habituation+test: entre 35min et 2h).
Impact sur les animaux
La douleur étant le paramètre étudié aucun anti-douleur ne peut être utilisé dans ce projet. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour garantir la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux, les animaux seront euthanasiés sans délai afin de prévenir toute souffrance inutile. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.
Devenir
La migraine aigue et chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.
Remplacement
A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme), mécanismes impliqué dans la chronicisation des crises de migraine. Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel.
Raffinement
Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Un animal partage sa cage avec les autres animaux de la même portée ; ils bénéficient également d'un enrichissement du milieu de leur cage (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi hebdomadaire de l’animal sera mis en place où seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Ces paramètres pourront nous indiquer les potentiels soins à apporter aux animaux.
Choix des espèces
La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Connectivité et physiologie des interneurones cholinergiques du striatum chez le macaque MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 3
Sept macaques, quatre crabiers et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ils subissent une restriction hydrique pendant douze à vingt-quatre mois, une chirurgie de pose d'implant crânien de quatre à six heures, parfois répétée sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois. Le porteur liste les risques encourus : œdème cérébral, accident vasculaire lors de la descente des électrodes dans le cerveau, infection au site d'implantation. Le projet vise à créer chez le primate non humain un modèle de troubles compulsifs par inactivation de neurones du striatum, démarche que le porteur juge "indispensable" pour extrapoler aux aptitudes humaines.
Objectifs
Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.
Bénéfices attendus
Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.
Procédures
(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.
Impact sur les animaux
1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.
Devenir
Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.
Remplacement
Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.
Réduction
Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.
Raffinement
Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.
Choix des espèces
L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.
Etude du rôle des astrocytes (cellule de soutien du neurone) dans le développement de lésions dans un modèle de traumatisme crânien pédiatrique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À sept jours de vie, des souriceaux reçoivent une incision du cuir chevelu puis un poids lâché sur le crâne, avant que la plaie soit refermée à la colle biologique, le tout en moins de deux minutes sous anesthésie. 1 072 souris vont être utilisées ainsi, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce une mortalité inférieure à 4 %, liée à l'anesthésie ou au traumatisme lui-même, et des troubles du comportement, anxiété et déficits sociaux, mesurés au quarante-cinquième jour de vie. Il indique ne disposer d'aucune donnée comportementale sur des animaux plus jeunes, et ne précise pas quels tests seront employés.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un problème mondial majeur, affectant particulièrement les enfants et les jeunes, avec environ 69 millions de cas par an. Il ne s'agit pas seulement du choc initial (lésion primaire), mais surtout de l'inflammation qui s'ensuit (lésions secondaires et tertiaires). Si cette inflammation persiste, elle endommage le cerveau à long terme, entraînant des problèmes moteurs, cognitifs et émotionnels. Pour briser ce cercle vicieux, il faut comprendre précisément qui est aux commandes de cette inflammation chronique. Dans le cerveau, nous avons deux types de cellules impliqué dans l’inflammation. Les astrocytes sont des cellules en forme d'étoile qui, normalement, jouent un rôle vital de soutien et de réparation. Après un traumatisme chez l'enfant, ces astrocytes peuvent devenir hyper-actifs. Au lieu de réparer, ils forment parfois une cicatrice trop rigide qui empêche la guérison, ou alors ils libèrent des signaux qui alimentent l'inflammation pendant des mois, causant des lésions à long terme. Notre connaissance de ce que font les astrocytes chez l'enfant est très limitée. Notre étude a donc pour objectif de comprendre le rôle précis de l'astrocyte dans ces dégâts post-traumatiques chez les jeunes enfants.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de comprendre quand et pourquoi ces cellules, qui sont normalement les "architectes" de la réparation, se mettent à former une cicatrice trop rigide ou à relâcher des signaux qui continuent d'abîmer le cerveau de l'enfant. En identifiant le moment exact où l'astrocyte bascule de protecteur à destructeur, nous pourrons intervenir pour le maintenir dans son rôle de guérisseur. Cela permettrait de limiter l'inflammation chronique qui est responsable des problèmes de mémoire, de concentration, et des troubles du comportement qui apparaissent des mois ou des années après l’accident. Jusqu’à présent, les traitements anti-inflammatoires sont souvent trop généraux. L’avantage de notre recherche est qu’elle isole une cible cellulaire très précise : l'astrocyte. En étudiant le comportement de cette cellule clé dans le cerveau en développement, notre projet vise à offrir une meilleure qualité de vie aux enfants victimes de traumatisme crânien.
Procédures
Des souriceaux subiront un traumatisme crânien à 7 jours de vie sous anesthésie générale : une incision cutanée suivie d’un lâcher de poids et d’une fermeture cutanée par de la colle biologique. Cette procédure est réalisée en moins de 2 minutes. Les groupes contrôles subiront la même procédure sans le traumatisme crânien.
Impact sur les animaux
La mortalité est de moins de 4% (principalement due à l’anesthésie générale ou au traumatisme crânien lui-même). Le fait de manipuler les souriceaux quotidiennement n’entraîne pas de rejet par la mère lors de la remise au nid car les souris utilisées ne sont pas perturbées par cela. Une irritation/inflammation au niveau de la cicatrice peut arriver de façon rarissime. Les animaux peuvent présenter des modifications du comportement (anxiété, déficits sociaux) qui seront analysées à P45 (45e jour de vie post natale). Nous n’avons pas de données comportementales sur des animaux plus jeunes. Une attention particulière sera apportée pour limiter le stress lors des différents tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à différents temps avec prélèvement du cerveau et analyse.
Remplacement
L’impact du traumatisme crânien ne peut être envisagée que dans des conditions « in vivo », c’est-à-dire dans un organisme vivant. Aucune solution alternative n’est possible pour conduire ce projet de recherche. Il est impossible d’évaluer les conséquences sur le fonctionnement cérébral d’un traumatisme crânien sur un modèle de cellules en culture ou sur des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques pour ce type d’étude ont été réalisé. En effet, des études antérieures sur ce modèle permettent d’évaluer la mortalité et ainsi d’avoir le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats statistiquement corrects. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés pour les tests comportementaux seront également utilisés pour des tests sur des coupes de cerveaux.
Raffinement
La procédure chirurgicale de traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale inhalatoire. Les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera que l’adoption par la mère se fait bien. Des arbres décisionnels seront proposés en fonction de l’âge des animaux, déterminant ainsi des points limites prédictifs : on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront euthanasiés. À distance du traumatisme crânien, on réalisera une surveillance hebdomadaire de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress. Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Le personnel technique de l’animalerie réalise aussi un suivi clinique quotidienne des animaux et de leurs conditions d’hébergement (nourriture, eau, température de la pièce, taux d’humidité) et nous alerte en cas de problème.
Choix des espèces
Les études chez l’animal permettent d’étudier les conséquences d’un traumatisme crânien modéré localisé sur l’ensemble du cerveau et de mimer au mieux la pathologie humaine. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de lésions du cerveau et notamment le traumatisme crânien. De plus, ce modèle de souris présente l’avantage de ne pas rejeter les petits après une séparation de courte durée. Les souris seront utilisées de 7 jours de vie à 45 jours de vie au maximum en fonction des groupes. Le traumatisme crânien sera fait à 7 jours de vie, pour mimer la survenue d’un traumatisme crânien chez le jeune enfant humain. Le rôle de l’astrocyte sera analysé à plusieurs temps (45 jours de vie pour voir les effets à la phase tardive), car l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps.
Photopharmacologie nicotinique in vivo chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à trois séances par jour, jamais deux jours de suite, sur une période pouvant atteindre trois mois, 860 souris vont être utilisées pour contrôler par la lumière des récepteurs cérébraux, 320 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans réveil, les 540 autres subissant des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des animaux reçoit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente pour implanter un dispositif d'illumination, puis participe éveillée aux séances d'injections et d'illuminations locales. Le porteur reconnaît que les substances employées sont nouvelles et que des effets imprévus ne peuvent être totalement exclus, tout en qualifiant les nuisances attendues de légères à modérées et réversibles. Les retombées thérapeutiques annoncées, des traitements plus ciblés avec moins d'effets indésirables, sont renvoyées au long terme, tandis que toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le cerveau fonctionne grâce à des cellules nerveuses qui communiquent entre elles à l’aide de substances chimiques. Parmi elles, l’acétylcholine joue un rôle important dans de nombreuses fonctions, comme la motivation, l’apprentissage, l’anxiété ou encore la réponse à certaines récompenses. Pourtant, il reste difficile de comprendre précisément comment cette substance agit dans des régions cérébrales spécifiques et à des moments précis. Ce projet a pour objectif de développer une nouvelle méthode permettant de contrôler très finement l’action de certains récepteurs cérébraux de l'acétylcholine grâce à la lumière. Pour cela, nous utiliserons des molécules conçues pour rester inactives tant qu’elles ne sont pas exposées à la lumière. Une fois activées localement dans le cerveau, elles permettront de modifier de manière ciblée l’activité de certains circuits nerveux. Chez la souris, nous étudierons ainsi comment cette activation influence l’activité cérébrale et certains comportements, comme la locomotion, la préférence, l’aversion ou l’anxiété. À plus long terme, ce projet pourrait améliorer la compréhension du fonctionnement du cerveau et contribuer au développement de traitements plus ciblés, avec moins d’effets indésirables.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d’abord scientifiques et méthodologiques. Il permettra de développer une nouvelle approche pour contrôler de façon précise, dans le temps et dans l’espace, l’activité de certains récepteurs du cerveau directement chez l’animal vivant. Ce type d’approche offre une précision supérieure à celle des méthodes pharmacologiques classiques, qui agissent de manière plus diffuse dans l’organisme. Le projet permettra également de mieux comprendre le rôle des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans le fonctionnement des circuits cérébraux et dans certains comportements, notamment ceux liés à la motivation, à l’apprentissage, à l’aversion ou à l’anxiété. À plus long terme, les connaissances et les outils développés dans ce projet pourraient contribuer à l’élaboration de stratégies thérapeutiques plus ciblées, avec moins d’effets indésirables que les traitements pharmacologiques agissant sur l’ensemble du cerveau ou de l’organisme.
Procédures
Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon la procédure. Un premier groupe d'animaux sera profondément anesthésié, sans réveil, afin de prélever le cerveau pour des analyses d'activité cérébrale réalisées en laboratoire sur tissu prélevé. Cette intervention unique dure environ 30 minutes. Un deuxième groupe recevra une injection sous anesthésie générale, suivie d'enregistrements de l'activité cérébrale avec illumination locale. Cette intervention unique, d'une durée maximale de 7 heures, est réalisée sans réveil. Un troisième groupe subira une chirurgie cérébrale d'environ 1 h 30 sous anesthésie générale, permettant la mise en place d'un dispositif dans le cerveau. Après une période de récupération d'au moins 5 jours, ces animaux participeront à des séances expérimentales chez l'animal éveillé, comprenant une ou plusieurs injections rapides (quelques secondes chacune) et des illuminations locales. Chaque séance dure entre 30 et 60 minutes. Les séances sont répétées au maximum trois fois par jour, jamais deux jours consécutifs (au moins un jour de repos entre deux journées d'expériences), sur une période maximale de 3 mois. Un dernier groupe subira une chirurgie cérébrale d'environ 1 heure pour la mise en place de dispositifs d'illumination. Après récupération, ces animaux seront soumis à différents tests comportementaux, d'une durée comprise entre 5 et 120 minutes selon le test. Chaque animal participera au maximum à six tests différents, certains pouvant être répétés sur plusieurs jours (jusqu'à cinq jours consécutifs pour les tests d'apprentissage), sur une période maximale de 6 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur légère à modérée et passagère après les chirurgies, généralement limitée à quelques jours. Une fatigue passagère est également possible. Une légère perte de poids transitoire peut survenir après la chirurgie ou lors de certaines phases expérimentales. Les manipulations, les injections, le branchement aux dispositifs expérimentaux et les tests comportementaux peuvent entraîner un stress léger à modéré et de courte durée. Les illuminations locales du cerveau peuvent induire des modifications transitoires du comportement, sans effet durable attendu. Les substances utilisées dans ce projet étant nouvelles, des effets imprévus ne peuvent être totalement exclus. L'état de santé des animaux est régulièrement surveillé, et les expériences sont interrompues si des signes de souffrance apparaissent. Dans l'ensemble, les nuisances attendues sont principalement légères à modérées, limitées dans le temps et réversibles.
Devenir
À l'issue des expériences, tous les animaux sont mis à mort. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre les prélèvements du cerveau indispensables aux analyses scientifiques : ces prélèvements permettent soit la réalisation d'enregistrements de l'activité cérébrale sur tissu prélevé, soit la vérification de la localisation des dispositifs implantés au cours de l'étude, étape essentielle à l'interprétation des résultats. Dans tous les cas, la mise à mort est réalisée sous anesthésie profonde, garantissant une perte de conscience préalable et une mort rapide et indolore.
Remplacement
Les objectifs du projet visent à étudier le rôle de récepteurs cérébraux dans le fonctionnement intégré de circuits du cerveau impliqués dans la motivation, l'aversion ou l'anxiété. Cette complexité ne peut être reproduite ni dans des cultures cellulaires, ni dans des modèles informatiques (in silico), qui ne permettent pas de préserver l'intégrité des circuits cérébraux ni d'évaluer les conséquences comportementales des manipulations expérimentales. L'utilisation de l'animal vivant reste donc indispensable pour relier l'activité cérébrale aux comportements étudiés. Lorsque cela est possible, les expérimentations sur animal vivant sont précédées d'études exploratoires en amont (caractérisation des substances en laboratoire, sélection des doses et des conditions d'illumination les plus pertinentes), afin de limiter au strict nécessaire le recours à l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est déterminé à partir de données issues de la littérature scientifique, de calculs de puissance statistique et de l’expérience acquise dans des projets similaires. Il correspond au nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Les procédures ont été conçues de manière à limiter au maximum le recours à de nouveaux animaux. Lorsque cela est scientifiquement possible et compatible avec le bien-être animal, un même animal peut participer à plusieurs phases complémentaires d’une même étude, en particulier dans les procédures comportementales, sans augmentation de la sévérité globale. Les animaux issus d’une même portée sont utilisés autant que possible, sans exclusion systématique selon le sexe, afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Les analyses sont réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, afin de garantir la validité scientifique des résultats tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux.
Raffinement
Des mesures de raffinement sont mises en place afin de limiter la douleur, le stress et la détresse. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec prise en charge adaptée de la douleur. Les animaux sont habitués à la manipulation lorsque cela est nécessaire, afin de réduire le stress lié aux procédures expérimentales. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier, en particulier après les interventions chirurgicales. Une grille d’évaluation standardisée permet de détecter précocement tout signe d’altération de l’état général. Des points limites ont été définis en amont du projet ; leur atteinte entraîne immédiatement la mise en place de mesures adaptées afin de préserver le bien-être animal. Lorsque cela est nécessaire, des ajustements des conditions expérimentales ou d’hébergement peuvent être réalisés afin de garantir la protection des animaux.
Choix des espèces
Les systèmes cérébraux cholinergiques et dopaminergiques étudiés dans ce projet sont bien conservés chez les mammifères, et en particulier chez les rongeurs. Leur organisation anatomique et leur fonctionnement présentent des similitudes importantes avec ceux observés chez l’être humain, ce qui rend la souris particulièrement pertinente pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans la locomotion, la motivation, l’aversion ou l’anxiété. Ces mécanismes ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate chez des invertébrés, des poissons ou des oiseaux, dont l’organisation cérébrale est trop différente. La souris présente en outre l’avantage de disposer d’outils expérimentaux et génétiques particulièrement développés, permettant une étude fine des mécanismes cérébraux, ce qui n’est pas le cas de nombreuses autres espèces. Le recours à d’autres mammifères ne se justifie pas dans ce projet, compte tenu de contraintes expérimentales plus importantes et d’une moindre accessibilité à ces outils. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (> 8 semaines), lorsque le développement cérébral est achevé et que les circuits étudiés sont pleinement fonctionnels. Pour les expériences nécessitant une injection virale, les souris sont opérées à l’âge adulte, puis utilisées après un délai de 2 à 4 semaines permettant une expression suffisante du transgène. Lorsque cela est nécessaire, l’implantation des fibres optiques est réalisée au cours de la même intervention chirurgicale.