Système nerveux
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Etude de la variabilité individuelle au stress et de la réponse aux antidépresseurs dans des modèles murins de stress chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour identifier des marqueurs de la réponse aux antidépresseurs, 7 776 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes mises à mort pour prélever le sang, le cerveau et des organes. Elles subissent un stress chronique de deux à trois heures par jour pendant huit à douze semaines, jusqu'à soixante injections quotidiennes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie du crâne de vingt minutes à cinq heures suivie de neuf semaines d'hébergement individuel. Le porteur annonce des batteries hebdomadaires de trois tests répétés quatre fois, puis une batterie finale de quatre à dix tests, sans nommer aucun de ces tests comportementaux. Le stress infligé doit provoquer dépression, anhédonie, anxiété et retrait social, et les points limites déclenchent un renforcement des antalgiques ou la mise à mort.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin urgent de meilleure prise en charge du trouble dépressif majeur. Il repose sur la récente découverte d'un facteur de transcription en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la dépression qui (i) permet de développer des stratégies innovantes d’identification de biomarqueurs précoces de la réponse, non réponse aux antidépresseurs, (ii) s'appuie sur des mécanismes biologiques robustes, plausibles et novateurs, (iii) sont transposables à la physiopathologie humaine, ainsi qu'aux phases de Recherche et Développement et aux futurs essais cliniques. Les antidépresseurs occupent une place centrale dans la prise en charge de la dépression, grâce à leur accessibilité étendue et à leur efficacité prouvée, qui s'avère similaire d'un médicament à l'autre. En utilisant des antidépresseurs classique, nous voulons vérifier si les biomarqueurs de la réponse au traitement antidépresseur , (i) dépendent des propriétés spécifiques de l'antidépresseur, comme sa capacité à bloquer la recapture d’un neurotransmetteur en particulier, (ii) peuvent être corréler à des modification les fonctions cérébrales impactés par le trouble dépressif majeur, (iii) peuvent être la cible de modification l’expression génétique permettant d’établir un lien entre vulnérabilité ou résilience au stress. Pour mieux refléter la complexité des situations cliniques, nous proposons d’évaluer ces traitements dans des modèles murin de stress chroniques bien établis, intégrant des dimensions physiques, psychologiques et sociales.
Bénéfices attendus
Nous déploierons ensuite des efforts de Recherche et Développement auprès des acteurs cliniques, institutionnels et privés. Les résultats à long terme créeraient idéalement une valeur supplémentaire par rapport aux stratégies thérapeutiques existantes avec des approches « complémentaires », un potentiel d'amélioration majeur dans la pharmacologie du trouble dépressif majeur (action rapide, meilleure efficacité). Une prise en charge pharmacologique plus abordable de la dépression signifie (i) une guérison plus précoce réduisant les souffrances et les effets secondaires inutiles, (ii) une amélioration de la qualité de vie des 300 millions de personnes souffrant de dépression dans le monde et de leurs familles, (iii) réduction du fardeau social et des coûts de santé publique.
Procédures
Une partie des souris subiront une procédure chirurgicale. Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 20-40minutes ou 3-5 heures par souris, accompagnée d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront soumises à une procédure de stress chronique moyen répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 2-3 heures pendant 8-12 semaines. Les animaux stressés recevront une injection quotidienne de l’antidépresseur ou de composés ayant des effets antidépresseurs allant de 1 injection à 60 injections (animal vigile à raison de quelques secondes par animal). Leur état émotionnel d’anxiété/dépression, de nociception et de cognition sera suivi avec tâches comportementales sur animaux vigiles. Ce suivi se fera avec une batterie hebdomadaire de 3 tests répétés 4 fois. La dernière batterie comportementale sera plus complète, elle comportera de 4 à 10 tests et s’étalera sur 1 à deux semaines. Les animaux ayant subis une intervention chirurgicale pour y implanter des électrodes seront suivis avec une batterie comportementale de 5-7 tests répétés en 3 temporalités (avant stress, après stress, après traitement). Leur activité cérébrale sera mesurée en vigile pendant les taches comportementales. La durée d’un test sera de 10 minutes à 1 heure et l’animal effectuera jusqu’à deux tests par jour. Jusqu’à cinq prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, avec une intervention de moins d’une minute. Chaque prélèvement sanguin sera espacé d’au moins 10-15 jours.
Impact sur les animaux
Dans le protocole de stress chronique moyen imprédictible, en plus du stress physique les souris seront soumises de façon répétée à un stress psychologique moyen susceptible de causer des symptômes de dépression, d’anhédonie, d’anxiété, un retrait social chez un sous-groupe d’individus ainsi qu'une perte de qualité de pelage. Ces dimensions seront surveillées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé. Les injections intrapéritonéales chroniques peuvent provoquer des effets secondaires mineurs, ou inconfort comme une douleur légère et transitoire, voir une irritation locale autour du site d’injection. La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire pendant l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant le stress chronique moyen imprédictible pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’éventuellement une augmentation de l’anxiété. Cependant, dans nos conditions expérimentales, l’hébergement individuel n’induit ni stéréotypies ni modifications du comportement émotionnel basal. Les tests de comportement ne montrent pas de changements notables mais nous pouvons considérer une certaine fatigue dans le cadre de batteries de plusieurs tests qui seront répétées au cours du protocole de stress et du traitement antidépresseur.
Devenir
L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Pour une grande partie des animaux du sang, leurs cerveaux et des organes périphériques seront récoltés en vue de procéder à des analyses de biologie moléculaire ou d'anatomie/imagerie et, où chaque animal représente un individu unique.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro avec des modèles cellulaires, les effets de la dépression, du stress, et des antidépresseurs se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures d’expérimentations animales décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress ou les drogues sur des circuits neuronaux intacts. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Nous essayons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir effectuer des études invasives qui ne sont pas faisables chez les sujets humains. Avec l’approche translationelle que nous avons adopté, les résultats obtenus au sein de notre laboratoire sont complémentaires de ceux obtenus chez l’homme.
Réduction
Les études prévues nécessiteront l’utilisation de 7776 animaux. Cet effectif représente un maximum. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par un calcul de puissance afin de s'assurer qu'il soit suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux impliqués. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées. Cette approche nous permet de répondre à la question principale du projet et en optimisant l'effectif, nous garantissons non seulement des résultats fiables, mais aussi une minimisation de l'impact sur les animaux.
Raffinement
Les souris seront placées dans une animalerie aux conditions d’hébergement conformes à la réglementation pour l’espèce utilisée. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire). Des points limites spécifiques ont été établis pour permettre d’évaluer l’état de douleur de l’animal agir en conséquence afin d’éviter toute souffrance supplémentaire, soit par un renforcement du traitement antalgique/analgésique, soit par une euthanasie. Pour le suivi post opératoire, une grille de scoring sera mise en place pour garantir le bien-être des animaux. De plus, un anesthésique local sous forme de crème est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au début et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’antiinflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de détérioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront en hébergement individuel pendant environ 9 semaines.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de la dépression clairement établis chez la souris. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des gènes dans le cerveau permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Expériences chez des animaux adultes : Les souris tests seront réceptionnés à l'âge de 6-7 semaines puis utilisés en procédure à l'âge adultes (âge entre 8 et 16 semaines). Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles affectifs à l’âge adulte en prenant en compte la variabilité individuelle et le dimorphisme sexuel.
Identification des circuits cérébraux régulant l’adaptation saisonnière du sommeil et des rythmes biologiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Elles reçoivent jusqu'à deux injections de vecteurs génétiques de cinquante minutes, subissent une chirurgie du crâne de quatre-vingts minutes pour l'imagerie cérébrale et l'électroencéphalographie, puis sont exposées à des températures chaudes et froides censées reproduire les saisons. Celles qui portent un dispositif crânien sont hébergées seules, ce que le porteur décrit comme inévitable et générateur de stress. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ni simulation informatique ne reproduit le fonctionnement d'un "organisme entier", et que les circuits du sommeil de la souris ressemblent à ceux de l'être humain.
Objectifs
Les saisons influencent profondément notre biologie : la durée du jour et la température affectent notre sommeil, notre humeur et notre horloge interne. Lorsque cette adaptation est perturbée, cela peut contribuer à des maladies psychiatriques telles que le trouble bipolaire, la dépression saisonnière ou la schizophrénie. Pourtant, les circuits cérébraux qui permettent au cerveau de détecter les changements saisonniers et d'y adapter notre comportement restent largement inconnus. Ce projet vise à identifier, dans le cerveau de la souris, les neurones responsables de la détection de la lumière et de la température saisonnières, et à comprendre comment ils orchestrent l'adaptation du sommeil et des rythmes biologiques. En utilisant des outils génétiques avancés permettant de visualiser et de contrôler l'activité de neurones spécifiques, ce projet testera également si ces interventions peuvent corriger les troubles du sommeil et des rythmes biologiques observés dans des modèles murins de trouble bipolaire et de schizophrénie. Ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblées pour les troubles dont les symptômes s'aggravent à certaines périodes de l'année.
Bénéfices attendus
Ce projet a le potentiel de découvrir de nouveaux mécanismes par lesquels le cerveau s'adapte aux changements de saisons, un aspect fondamental mais encore très mal compris de la biologie cérébrale. En s'appuyant sur ces découvertes, ce projet testera si la manipulation ciblée des circuits identifiés permet d'améliorer les troubles du sommeil et des rythmes biologiques associés aux transitions saisonnières, ouvrant ainsi la voie à des traitements plus précis pour des maladies comme le trouble bipolaire, la dépression saisonnière ou la schizophrénie. Cette recherche est donc essentielle à la fois pour approfondir la compréhension du cerveau et pour poser les bases de nouvelles approches thérapeutiques ciblées.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : 1) Des injections pour administrer des analgésiques lors des chirurgies. 2) des injections de vecteurs génétiques (jusqu'à deux fois, durée 50 minutes). 3) des chirurgies pour imagerie cérébrale et électroencéphalographie (une fois, durée 80 minutes). Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
Les chirurgies pratiquées sur le crâne peuvent causer une douleur modérée et un inconfort dans les heures et jours suivant l'opération. L'hébergement individuel, bien qu'inévitable pour protéger les dispositif médicaux, peut induire un stress. L'exposition à des températures chaudes et froides, visant à modéliser les changements saisonniers de température, peut induire un stress léger et transitoire. La manipulation régulière des animaux et le port de petits dispositifs d'enregistrement peuvent également causer un stress léger.
Devenir
Les souris de chaque procédure seront mise à mort afin de prélever le cerveau pour la réalisation d'analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet ne peuvent pas être atteints sans recourir à des animaux, car les questions posées concernent le fonctionnement intégré d'un organisme entier, ce qu'aucune culture cellulaire ou simulation informatique ne peut reproduire à ce jour. La souris est le modèle de choix car elle permet de modifier des gènes spécifiques et de contrôler l'activité de neurones précis dans un animal vivant en comportement, et ses circuits cérébraux régulant le sommeil et les rythmes biologiques sont très similaires à ceux de l'être humain.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum nécessaire le nombre d'animaux, nous utiliserons une analyse de puissance statistique pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires afin d'obtenir un résultat scientifiquement fiable. Les données seront analysées avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe avec enrichissement environnemental dans la mesure du possible ; celles portant un dispositif médical crâniens sont hébergées individuellement mais dans des cages ouvertes leur permettant de voir, d'entendre et de sentir leurs congénères. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale avec une couverture analgésique de 72 heures, suivie de soins post-opératoires complets et d'une surveillance quotidienne pendant 4 jours. Des critères de bien-être stricts sont appliqués : au moindre signe de douleur, un analgésique supplémentaire est administré, et si nécessaire, l'animal est immédiatement mis à mort selon des méthodes éthiquement validées et réglementaires.
Choix des espèces
Les souris représentent le modèle de choix pour étudier le fonctionnement du cerveau, car leurs circuits cérébraux présentent de nombreuses similarités avec ceux de l'être humain. Elles seront utilisées à l'âge adulte (8-9 semaines), lorsque les circuits cérébraux sont pleinement développés, ce qui correspond à la période où le trouble bipolaire et la schizophrénie apparaissent typiquement chez l'être humain. Des souris des deux sexes seront incluses, car ces maladies présentent des différences entre hommes et femmes ; intégrer cette variable permet de s'assurer que les résultats obtenus sont représentatifs de l'ensemble de la population et potentiellement pertinents pour la biologie humaine.
Role des cellules gliales et immunitaires dans l’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, chacune pouvant subir jusqu'à cinq injections dans le ventre sans anesthésie, une chirurgie du crâne de trente minutes à une heure trente, puis des sessions d'enregistrement de quatre heures, quotidiennes la première semaine et hebdomadaires ensuite. Une épilepsie du lobe temporal leur est provoquée par injection de kainate directement dans le cerveau, et une partie d'entre elles reçoit en plus des électrodes ou une lentille optique intracérébrale. Le porteur écrit que ces crises ne sont pas douloureuses mais qu'elles génèrent un stress chez la souris. Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, alors que les retombées annoncées pour les patients pharmaco-résistants restent au conditionnel et à trois ou quatre ans de travaux supplémentaires.
Objectifs
L’épilepsie correspond à un ensemble de pathologies qui se caractérisent par une hyperactivité synchronisée de réseaux de neurones du cerveau et qui touche 600000 personnes en France. Il n’existe pas de médicaments permettant de soigner les causes de l’épilepsie mais seulement des anti-épileptiques qui régulent l'activité des réseaux neuronaux excitateurs ou inhibiteurs pour limiter ou empêcher les crises et qui ont de nombreux effets secondaires indésirables. Il est donc urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager les patients pharmaco-résistants aux anti-épileptiques et/ou véritablement soigner l’épilepsie. L'épilepsie du lobe temporal (ELT) est la forme la plus fréquente d'épilepsie focale focale (c.a.d. limitée à une région du cerveau) qui touche environ 60% des patients. Au cours des quinze dernières années, il a été montré que l’ELT s’accompagne d’une réaction inflammatoire au niveau des régions cérébrales les plus touchées, notamment l’hippocampe. Identifier les mécanismes inflammatoires et immunitaires impliqués dans l’ELT pourrait ouvrir la voie à de nouvelles solutions thérapeutiques. Nos travaux sont centrés sur des cellules de soutien des neurones, appelées cellules gliales, qui aident au bon fonctionnement des neurones, et plus récemment, sur les lymphocytes T dans la progression de l’ELT. Les cellules gliales acquièrent des caractéristiques spécifiques dans les aires du cerveau touchées par les crises. Dans un modèle murin d’ELT, nos études suggèrent que les cellules gliales sont responsables d’une modification de la transmission synaptique dans l’hippocampe épileptique. Nous voulons étudier les mécanismes par lesquels les cellules gliales impactent la progression des crises dans notre modèle d’ELT. De plus, nos résultats actuels indiquent que les lymphocytes T ont des effets protecteurs dans ce modèle murin d’ELT et nous voulons identifier les mécanismes impliqués dans cette protection, en ciblant en particulier les voies de signalisation impliquant les cellules gliales.
Bénéfices attendus
De plus en plus de données indiquent que les cellules gliales et immunitaires contribuent à la progression de l’ELT. Identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les dysfonctions des cellules gliales et immunitaires permettrait d’envisager de nouvelles voies thérapeutiques qui ne cibleraient pas les neurones et pourraient avoir moins d’effets secondaires indésirables. Les premiers résultats de ce projet en continuité avec nos travaux actuels seront publiés dans des journaux à comité de lecture en « open access » d’ici deux ans. Les autres parties de ce projet nécessiteront 3 à 4 ans supplémentaires pour être finalisées. A plus long terme, nous discutons régulièrement avec des médecins pour voir comment nos résultats pourraient mener à des développements thérapeutiques pour la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux de ce projet recevront une ou plusieurs (jusqu’à 5) injections intrapéritonéales pour manipuler pharmacologiquement les cellules immunitaires ou les cellules du système nerveux central. Ces injections sont réalisées sans anesthésie lors d’une contention manuelle. Des injections intracérébrales de virus permettant d’induire l’expression d’un biosenseur fluorescent ou d’inhiber l’expression d’un gène seront réalisées sur une partie des souris. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale lors d’une chirurgie qui dure 30 minutes. Une injection intrapéritonéale d’un analgésique est réalisée avant la chirurgie. L’expression du virus n’entraine aucune douleur ou gène de l’animal. Des injections intracérébrales de kainate ou de solution saline (groupe contrôle) seront réalisées pour induire une épilepsie du lobe temporal chez tous les animaux de ce projet. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale lors d’une chirurgie qui dure 30 minutes. Une injection intrapéritonéale d’un analgésique est réalisée avant la chirurgie. Une partie de ces mêmes animaux sera également implantée, lors de la même chirurgie, avec des électrodes intracérébrales pour suivre l’activité neuronale. Dans ce cas la durée de la chirurgie est d’une heure. Enfin, certains de ces animaux seront implantés lors de la même chirurgie avec une lentille optique intracérébrale pour suivre les variations de fluorescence d’un biosenseur. Dans ce cas la chirurgie dure 1h30. Plusieurs jours après la chirurgie, les animaux équipés d’électrodes intracérébrales et d’une lentille optique seront enregistrés sans anesthésie et libre de leurs mouvements, lors de sessions d’une durée de 4h à des fréquences quotidiennes, pendant la première semaine, ou hebdomadaires, pendant la phase chronique. Pour cela les animaux sont d’abord habitués à la préhension pendant les 3 jours précédents le premier enregistrement qui nécessite de connecter les implants au système d’enregistrement. Pour cela la souris éveillée est maintenue en contention sur une grille et les implants sont connectés au système d’enregistrement via des fils souples qui laissent la souris libre de ses mouvements. L’enceinte d’enregistrement contient de la nourriture et un accès à de l’eau.
Impact sur les animaux
- Contention de l’animal suivie d’une injection intrapéritonéale, ce qui entraine en stress léger et une douleur légère et de courte durée. - Intervention chirurgicale intracérébrale sous anesthésie générale, ce qui peut entrainer une douleur modérée au réveil et pendant 1 jour ou 2. Le comportement des souris est observé pendant la semaine qui suit la chirurgie et tout comportement anormal ou signe physique anormal (perte de poids, prostration, poils ébouriffés…) entrainera une action vétérinaire appropriée (administration d’analgésiques, de serum physiologique, d’antibiotique). - Le modèle d’épilepsie utilisé dans ce projet déclenche des crises d’épilepsie dans une région particulière du cerveau (crise focale). Ces crises ne sont pas douloureuses mais génèrent un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort. Les organes, en particulier le cerveau, seront prélevés pour réaliser des études histologiques, moléculaires, cellulaires et physiologiques.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les relations entre différents types cellulaires du cerveau et du système immunitaire au cours des différentes phases de l'épilepsie. Ces cellules sont par nature très sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans l’épilepsie il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Les études récentes montrent que les propriétés morphologiques, moléculaires et physiologiques des cellules gliales du cerveau placées en culture diffèrent de façon substantielle de celles des cellules gliales in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent à terme identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant avoir un impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Pour définir statistiquement la taille des lots d’animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés ainsi que sur une évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris « tests/KO » avec les souris « contrôles » issues des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.
Raffinement
Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (abri, buchette, et coton pour le nid). Nous manipulerons les animaux régulièrement pour les habituer à notre présence. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et application d’analgésique. Tout au long de chaque procédure, les animaux seront surveillés (quotidiennement après les chirurgies puis de façon hebdomadaire). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer la santé des animaux et apporter les réponses adaptées. Nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité, décrit dans les points limites. Pour aider à la prise de décision, cette grille de score contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par euthanasie.
Choix des espèces
Les souris sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. Le modèle d’épilepsie du lobe temporal que nous utilisons pour ce projet reproduit assez fidèlement la pathologie humaine avec sclérose hippocampique. Nous utiliserons des souris adultes âgées entre 2 et 3 mois en début de procédure pour nous affranchir des effets liés au développement et à la sénescence. Nous utiliserons des souris contrôles et des souris transgéniques permettant d’invalider un gène ou d’en exprimer d’autres dans des cellules spécifiques. Ces lignées transgéniques n’ont pas de phénotype dommageable.
Etude de l?impact d?un perturbateur endocrinien de la famille des fluorofactants sur la d?my?linisation et la remy?linisation chez le mod?le murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées à l'acide perfluorooctanesulfonique dans leur eau de boisson du quinzième jour de gestation au vingt-et-unième jour après la naissance, des souris femelles transmettent ce polluant à leurs petits. Devenus adultes à 90 jours, une partie de ces souriceaux reçoit pendant six semaines une molécule mélangée à une nourriture en poudre pour détruire leur myéline, avec perte de poids, baisse d'activité et risque de défaut d'usure des dents, puis deux séances d'IRM d'une heure sous anesthésie générale. 276 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin pour les prélèvements de tissus, le porteur précisant que les mères ne peuvent pas être réutilisées "en raison de leur exposition à l'acide perfluorooctanesulfonique (PFOS)".
Objectifs
La scl?rose en plaques est une maladie du syst?me nerveux qui touche de plus en plus de personnes dans les pays d?velopp?s. Elle se caract?rise par une d?gradation progressive de la my?line, une substance qui entoure les fibres nerveuses et permet la transmission rapide des signaux dans le cerveau et la moelle ?pini?re. Si les causes exactes de cette maladie ne sont pas encore compl?tement connues, certains facteurs environnementaux pourraient jouer un r?le dans son apparition ou son aggravation. Ce projet vise ? ?tudier si une exposition pr?coce ? un type de polluants chimiques tr?s r?pandus dans notre quotidien, appel?s PFAS (utilis?s par exemple dans les rev?tements antiadh?sifs ou les textiles d?perlants), peut perturber la formation ou la r?paration de la my?line. Ces polluants, tr?s persistants dans l?environnement, s?accumulent facilement dans les tissus gras comme la my?line, ce qui pourrait en fragiliser la structure et nuire ? son bon fonctionnement. Nous chercherons d?abord ? comprendre si l?un de ces compos?s, le PFOS, influence la formation de la my?line chez le souriceau apr?s une exposition pendant la gestation et l?allaitement. Nous ?tudierons ensuite si cette exposition pr?coce entra?ne des effets durables ? l??ge adulte, en particulier sur la stabilit? de la my?line et sa capacit? ? se r?parer. Pour cela, nous analyserons si le PFOS s?accumule dans les r?gions riches en my?line dans le cerveau et si cela modifie sa composition, en utilisant des m?thodes de pointe bas?es sur la chimie analytique. Les r?sultats pourraient aider ? mieux comprendre comment certains polluants environnementaux influencent le d?veloppement c?r?bral et participent ? des maladies neurod?g?n?ratives comme la scl?rose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d?apporter de nouvelles connaissances sur les effets potentiels d?une exposition pr?coce ? certains polluants pr?sents dans notre environnement sur la sant? du cerveau. En particulier, il pourrait aider ? mieux comprendre si et comment une exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), pendant la grossesse et les premi?res semaines de vie, perturbe la formation et la stabilit? de la gaine de my?line, qui prot?ge les fibres nerveuses. Une telle alt?ration pourrait rendre le syst?me nerveux plus vuln?rable ? certaines maladies, comme la scl?rose en plaques. Les r?sultats attendus pourraient permettre de mieux identifier les m?canismes par lesquels ces substances chimiques peuvent affecter durablement le fonctionnement du cerveau. Le projet permettra aussi de d?terminer ? partir de quelle concentration ces effets apparaissent chez la souris, ce qui est important pour ?valuer les risques pour la sant? humaine. Enfin, ces travaux pourraient alimenter des recommandations de sant? publique concernant l?exposition des femmes enceintes et des jeunes enfants ? ce type de polluants, et contribuer ? la compr?hension des maladies li?es ? une alt?ration de la my?line.
Procédures
Les femelles gestantes expos?es recevront de l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) dans leur eau de boisson entre le quinzi?me jour de gestation et le vingt-et-uni?me jour post-natal. Une partie des souriceaux obtenus suite ? cette exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) recevra ? l??ge adulte et pendant 6 semaines une mol?cule dans leur nourriture afin d?induire une d?my?linisation. Une partie d?entre eux aura ensuite une imagerie par r?sonance magn?tique sous anesth?sie g?n?rale (60 minutes maximum, deux fois) pour suivre l??tendu des l?sions de la my?line.
Impact sur les animaux
Le mod?le de d?my?linisation pourra provoquer de mani?re temporaire une perte de poids ou une baisse d?activit? chez les animaux. La modification de la texture de l?alimentation (poudre) pourra induire un risque de d?faut d?usure des dents des animaux. L?anesth?sie g?n?rale n?cessaire pour la r?alisation de l?imagerie par r?sonance magn?tique sera associ?e ? des risques d?hypothermie, de s?cheresse oculaire et de difficult?s cardiaque et respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasi?s en fin de proc?dure d?une part parce que des pr?l?vements de tissus post-mortem et des analyses sont n?cessaires pour r?pondre ? notre question scientifique. D?autre part les femelles ne pourront pas ?tre r?utilis?es en raison de leur exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS).
Remplacement
Avant de recourir ? des exp?riences sur des animaux vivants, plusieurs ?tudes en laboratoire ont ?t? men?es sur des cellules en culture et des tissus isol?s du cerveau, ainsi que sur un mod?le animal alternatif, le t?tard de x?nope. Ces approches ont permis de d?montrer que l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) perturbe la formation et la r?paration de la my?line ? court terme. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire les conditions r?elles d?exposition, comme cela peut survenir pendant le d?veloppement chez un individu vivant. Ils ne permettent pas non plus d??tudier l?accumulation du polluant dans le cerveau ni ses effets ? long terme sur la structure de la my?line. Nous aurons donc recours ? la souris, une esp?ce chez laquelle la composition de la my?line est bien connue, ce qui permet de faire des analyses pr?cises et fiables. Ce choix s?appuie directement sur les limites identifi?es dans nos approches pr?c?dentes. Il s?agit d?un prolongement n?cessaire pour r?pondre ? une nouvelle question scientifique, en s?appuyant sur un mod?le physiologique complet. Le recours ? l?animal est donc justifi? ici puisque les autres mod?les ne permettent pas de r?pondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d?animaux par groupe a ?t? optimis? en s?appuyant sur nos exp?riences ant?rieures, avec un effectif r?duit mais suffisant pour obtenir des r?sultats robustes et tenir compte de la variabilit? biologique entre individus. Les groupes exp?rimentaux incluent ? chaque fois des m?les et des femelles, ce qui permet d??valuer les ?ventuelles diff?rences li?es au sexe sans multiplier le nombre d?animaux. Le protocole inclut une r?partition ?quilibr?e entre m?les et femelles, afin d??viter d?avoir ? multiplier les groupes dans des exp?riences distinctes. Au total, 276 souris seront utilis?es dans ce projet. Ce chiffre tient compte d?une l?g?re marge de s?curit? pour pallier la variabilit? naturelle du nombre de petits par port?e notamment. L?ensemble de ces choix refl?te un souci constant de limiter l?utilisation d?animaux tout en garantissant la qualit? scientifique des donn?es. Pour analyser nos r?sultats sans compromettre la pr?cision statistique, nous utiliserons une m?thode adapt?e aux petits ?chantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
Les animaux b?n?ficieront d?un enrichissement de leur environnement (carr? de coton, b?tonnets de bois ? ronger). Ils seront observ?s quotidiennement par l??quipe zootechnique et 2 fois par semaine minimum par notre ?quipe. En cas d'anomalie celle-ci sera g?r?e en collaboration entre notre ?quipe, la Structure charg?e du Bien Etre Animal (SBEA) et le v?t?rinaire afin de mettre en place une prise en charge adapt?e pour l?animal. Des points limites sont d?finis et seront respect?s pour ?viter toute souffrance animale. Les femelles gestantes et en lactation d?un m?me groupe de traitement seront plac?es en duo par cage, afin d??viter tout isolement social, favoriser les comportements naturels de nidification et permettre une entraide maternelle pendant la lactation. Apr?s deux jours d?acclimatation, valid?s par le SBEA, l?exposition d?butera au quinzi?me jour de gestation (jour embryonnaire 15, E15). Cette organisation permet de garantir la gestation des femelles tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires au projet. Ce sch?ma exp?rimental a d?j? ?t? utilis? sans effet d?l?t?re observ? chez les femelles gestantes ni sur le d?veloppement des port?es. Elles seront pes?es ? leur arriv?e puis 5 jours apr?s afin de suivre le bon d?roul? de la gestation mais ne seront pas plus manipul?es afin de r?duire au maximum le stress g?n?r? par les manipulations. A leur naissance, une v?rification visuelle des petits sera r?alis?e pour s?assurer de leur bonne prise en charge par leur m?re puis ils seront pes?s 1 ? 2 fois par semaine ? partir de 7 jours d??ge afin de nous assurer qu?ils ne pr?sentent pas de croissance anormale et, ou, difficult?s ? s?alimenter. A partir de leur sevrage ils seront peser et et surveiller hebdomadairement en plus de l?observation quotidienne. Pendant la d?my?linisation, l??tat g?n?ral et le poids des animaux seront surveill?s 1 fois par semaine minimum. Une transition alimentaire sera assur?e sur 48h pour que les animaux s?habituent ? la nourriture en poudre et un enrichissement suppl?mentaire sera ajout? dans la cage pour qu?ils puissent assurer leur comportement naturel de rongeur (ajout de b?tonnets de bois ? ronger suppl?mentaires). Lors des imageries, les animaux seront plac?s sous anesth?sie g?n?rale. Leur temp?rature corporelle sera maintenue pendant l'anesth?sie et un gel ophtalmique sera appliqu? pour ?viter toute s?cheresse oculaire. Nous v?rifierons la profondeur de l'anesth?sie et les surveillerons jusqu'? leur r?veil complet.
Choix des espèces
L?esp?ce choisie pour ce projet est la souris, qui est largement utilis?e en recherche scientifique. Ce mod?le pr?sente de nombreux avantages, tant sur le plan scientifique que pratique. Sur le plan scientifique, la souris est l?un des organismes les mieux connus : son g?nome a ?t? enti?rement s?quenc?, et de nombreux m?canismes li?s au d?veloppement du cerveau, ? la formation de la my?line et aux effets des substances polluantes ont ?t? d?crits. C?est ?galement l?esp?ce de r?f?rence pour l??tude des effets des perturbateurs endocriniens et pour l?analyse fine de la composition en lipides de la gaine de my?line. Enfin, elle est particuli?rement adapt?e pour l?utilisation du mod?le de d?my?linisation choisi ici et valid? pour ?tudier les m?canismes de perte et de r?paration de la my?line. Tous les protocoles que nous utilisons sont bien ma?tris?s pour cette esp?ce, ce qui r?duit les risques de complications et favorise son bien-?tre. Les animaux seront utilis?s ? diff?rents stades de d?veloppement, selon les objectifs de chaque exp?rience. Les femelles gestantes seront de jeunes adultes ?g?es d?environ trois mois afin d??tre sexuellement matures. L?exposition au PFOS sera faite ? partir du 15e jour de gestation jusqu?au 21e jour apr?s la naissance, ce qui correspond ? une p?riode particuli?rement sensible du d?veloppement c?r?bral. Pour les animaux expos?s pendant la gestation nous r?aliserons ensuite nos analyses ? diff?rents stades : tout d?abord 21 jours d??ge, un stade o? la formation de la my?line atteint un pic important chez la souris, cela permettant de mesurer pr?cis?ment l?accumulation du polluant et ses effets pr?coces. Puis dans un deuxi?me temps ? 90 jours d??ge, un stade adulte permettant d??valuer si les effets de l?exposition pr?coce persistent ? long terme, lorsque le cerveau a atteint un stade de maturit?. Pour le mod?le impliquant une d?my?linisation celle-ci sera r?alis?e ? partir de ce stade de 90 jours et pendant 6 semaines pour induire la perte de my?line, suivi d?une p?riode d?une semaine de r?cup?ration afin d??tudier les m?canismes de r?paration naturelle de cette gaine nerveuse.
Exploration de la plasticit? synaptique et de l?inflammation apr?s un AVC chez la souris adulte_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 souris âgées de 16 à 24 semaines subissent une chirurgie de 45 minutes sous anesthésie générale destinée à provoquer un accident vasculaire cérébral dans une région précise du cortex, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie, leur cerveau étant découpé en tranches pour analyse. Le projet est présenté comme une étude pilote : il s'agit de vérifier si un infarctus provoqué dans une zone donnée modifie aussi des régions qui ne lui sont pas directement connectées, une étude complète devant suivre si l'hypothèse se confirme. Le porteur écrit que cette méthode "typiquement ne s'accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale", tout en prévoyant douleur et perte de poids après la chirurgie, avec une évaluation quotidienne de la douleur pendant deux jours.
Objectifs
Les accidents vasculaires c?r?braux (AVC) sont une cause majeure de d?ficits moteurs ? long-terme et de d?ficits cognitifs. Certains sympt?mes se manifestent tardivement et ne sont pas forc?ment li?s ? la r?gion initialement l?s?e, sugg?rant qu?un AVC dans une r?gion sp?cifique peut aussi causer des modifications dans d?autres r?gions du cerveau. Des alt?rations dans des r?gions directement connect?es ? la zone infarcie ont d?j? ?t? corr?l?es ? l?apparition de troubles tardifs. Cependant, les r?gions associ?es aux fonctions impact?es (les fonctions de m?moire par exemple) ne sont pas toujours directement connect?es ? la r?gion l?s?e. Nous ?mettons donc l?hypoth?se que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux r?gions connect?es ? l?infarctus primaire mais s??tendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette ?tude pilote, nous voulons induire un AVC limit? ? une r?gion pr?cise du cerveau d?un mod?le murin afin d??tudier l?impact de la l?sion dans d?autres r?gions du cerveau, pas directement connect?es ? la zone infarcie. Si notre hypoth?se est confirm?e, nous aurions identifi? un des m?canismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de sympt?mes fonctionnellement li?s ? des zones non connect?es dans un mod?le murin.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider notre observation pr?liminaire qui vise ? mieux comprendre les m?canismes sous-tendant les troubles de m?moire qui se manifestent tardivement apr?s un AVC, m?me quand la r?gion initialement l?s?e n?est pas impliqu?e dans les fonctions mn?siques. Nous ?mettons l?hypoth?se que l?alt?ration d?un m?canisme cellulaire associ? ? la m?moire ainsi qu?un ?tat inflammatoire pourraient ?tre pr?sents dans des r?gions non directement connect?es ? la zone infarcie. Si notre hypoth?se est confirm?e, nous effectuerons une ?tude compl?te qui pourrait avoir des r?percussions positives sur la recherche pr?-clinique s?int?ressant aux troubles cognitifs post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis ? une chirurgie peu invasive pour induire l?AVC sous anesth?sie g?n?rale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis ? une perfusion intracardiaque toujours sous anesth?sie g?n?rale (20 minutes). Tous les animaux sont concern?s.
Impact sur les animaux
La m?thode utilis?e induit un infarctus cortical limit? et typiquement ne s?accompagne pas de sympt?mes majeurs, ce qui rend le mod?le facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite ? la proc?dure chirurgicale, une douleur ainsi qu?une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observ?s quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera ?valu?e jusqu?? J2 apr?s chirurgie selon une grille d??valuation, organis?e selon 5 grands crit?res : apparence physique, comportement non provoqu?, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l?aspect de la plaie. Si apr?s deux jours l?animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de d?t?rioration ou de souffrance animale, l?animal sera pris en charge par l?utilisateur ou par la v?t?rinaire.
Devenir
A l?issue de toutes les exp?riences, les animaux ne seront pas gard?s du fait des techniques/proc?dures subies et seront de ce fait mis ? mort.
Remplacement
L?AVC sera induit par la m?thode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd?hui ils n?existent pas des mod?les in vitro (cultures cellulaires, organo?des) pour ?tudier des cons?quences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les r?gions non l?s?es initialement et donc pas de m?thode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette ?tude n?cessite la complexit? et la connectivit? du cerveau adulte.
Réduction
Le nombre de souris a ?t? ?valu? sur la base de travaux pr?c?dents en tenant compte des divers probl?mes que nous pourrions rencontrer au cours des diff?rentes phases exp?rimentales (probl?mes au cours de la chirurgie, la perfusion,des exp?riences d??lectrophysiologie et d?immunohistochimie), ainsi que de la variabilit? des r?sultats. Le d?roulement des exp?riences est organis? afin de limiter au maximum le nombre d?animaux. Nous adapterons d?abord le protocole afin d?avoir une l?sion initiale reproductible, de taille maximale limit?e au cortex, et seulement ensuite les autres exp?riences seront r?alis?es.
Raffinement
Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la dur?e du projet. Les animaux seront h?berg?s au sein d'un ?tablissement utilisateur agr?? dans des conditions d?h?bergement favorisant leur bien-?tre. Ils seront plac?s dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabul?s dans une animalerie thermor?gul?e avec hygrom?trie. L?acc?s ? la nourriture et ? l?eau sera ad libitum et un changement de liti?re sera effectu? chaque semaine. Dans une ?tude pr?c?dente, le nombre d?animaux qui ont montr? des signes de souffrance d? ? l?induction de l?AVC ?tait tr?s limit? (moins de 3%). Nous nous attendons ? ce que la l?sion soit plus petite avec un temps d?illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de z?ro. Si l?animal pr?sente des signes de douleur au cours de l?exp?rimentation, l?animal sera pris en charge par l?exp?rimentateur. Si nous n?observons pas d?am?lioration de l??tat de l?animal, nous ferons intervenir la v?t?rinaire responsable.
Choix des espèces
Le mod?le envisag? a d?j? ?t? induit chez la souris et il a ?t? d?montr? que les AVC s?accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement l?s?es, mais connect? ? la r?gion infarcie. Ce mod?le permet de produire des tranches de cerveau pour r?aliser des ?tudes d??lectrophysiologie et d?immunohistochimie afin d?explorer des modifications dans d?autres r?gions du cerveau pas encore ?tudi?es. Nous utiliserons des souris ?g?es de 16-24 semaines. Cette tranche d??ge permet d??tudier les cons?quences d?un AVC chez un animal adulte et correspond ? un jeune adulte chez l?homme.
Imager les interactions claustro-corticales au cours des ?tats de conscience.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six examens d'imagerie de quatre heures au maximum, trois sur souris éveillée la tête fixée et trois sous anesthésie, après une à deux chirurgies crâniennes de quatre heures : 300 souris subissent ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que la contention de la tête peut provoquer des mouvements brusques, une locomotion anormale et une absence de toilettage, et que la chirurgie entraîne des douleurs modérées, une inflammation et une perte de poids pendant deux à trois jours. L'objectif est de mesurer en même temps l'activité d'une structure cérébrale profonde et celle des neurones du cortex, pendant l'éveil, le sommeil et l'anesthésie. La souris est retenue parce que le cortex y est conservé, alors qu'il est "absent ou très différent chez des organismes plus simples" comme C. elegans, la drosophile ou le poisson-zèbre.
Objectifs
Une petite structure profonde du cerveau projette vers de larges r?gions du cortex. Elle est impliqu?e dans des fonctions li?es ? l??veil, comme l?attention et la s?lection de l?information, et pourrait ?galement jouer un r?le dans les ?tats de conscience.Des travaux r?cents sugg?-rent qu?elle pourrait aussi intervenir dans la consolidation de la m?moire pendant le sommeil, en modulant l?activit? corticale lors du sommeil.Cependant, les interactions entre cette struc-ture et le cortex restent mal caract?ris?es. La plupart des ?tudes in vivo se limitent aux couches superficielles, sans prendre en compte les neurones des couches profondes. Or, des r?sultats r?cents sugg?rent l?existence de circuits parall?les reliant cette structure au cortex, avec des effets oppos?s selon la profondeur : inhibiteurs en surface et activateurs en profondeur.L?hypoth?se test?e est que ces circuits parall?les existent in vivo et permettent une modulation diff?renci?e de l?activit? corticale selon la couche et l??tat de vigilance.Gr?ce ? un microscope de pointe, l?activit? des projections de cette structure et celle des neurones corticaux seront mesur?es simultan?ment ? travers diff?rentes couches corticales, chez la souris, au cours de l??veil, du sommeil et de l?anesth?sie.Ce projet apportera une vision int?-gr?e des interactions entre cette structure et le cortex, ainsi que de leur r?le dans la dyna-mique corticale, avec des implications pour la compr?hension de la m?moire, de la cognition et des ?tats de conscience.
Bénéfices attendus
Ce projet fournira des donn?es in?dites sur la mani?re dont les noyaux c?r?braux profonds communiquent avec le cortex, et sur la fa?on dont ces ?changes ?voluent selon les ?tats de conscience : ?veil, sommeil et anesth?sie. Il permettra d'abord de cartographier pr?cis?ment les projections d'un de ces noyaux vers les diff?rentes couches corticales. Gr?ce ? l'optimisation d'une approche d'imagerie ? haute r?so-lution, il sera ensuite possible de suivre en temps r?el la dynamique de ces interactions noyau-cortex dans des conditions physiologiques. Au-del? de ces aspects m?thodologiques, l'?tude apportera des ?l?ments nouveaux sur le codage neuronal, en identifiant les conditions qui favorisent ou limitent la synchronisation entre ces structures. Ce m?canisme est susceptible de jouer un r?le dans la consolidation m?morielle et, plus largement, dans les fonctions cognitives. Enfin, en d?finissant pr?cis?ment comment ces noyaux influencent l'organisation de l'activit? corticale, ce projet posera les bases pour mieux comprendre - et ? terme peut-?tre mieux traiter- des troubles li?s ? la conscience ou ? la m?moire.
Procédures
Toutes les souris subiront une ? deux interventions chirurgicales sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie, permettant l?injection de marqueurs permettant d?identifier sp?cifiquement la struc-ture ?tudi?e (dur?e maximale : 4 heures par intervention). Chaque souris aura 3 examens d?imagerie en ?tant ?veill?e, 3 autres sous anesth?sie, d?une dur?e maximale de 4h, espac? entre 24 et 48h selon la dur?e de l?examen. Les souris seront ?galement occasionnellement expos?es ? une anesth?sie gazeuse de la m?me dur?e, ? r?cup?ration rapide, afin d?enregistrer l?activit? c?r?brale dans un ?tat de conscience alt?r?. Enfin, une chirurgie terminale sera r?alis?e sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie pour le pr?l?vement des tissus (dur?e maximale : 10 minutes).
Impact sur les animaux
D'une mani?re g?n?rale, les effets ind?sirables principaux attendus d?coulent de la chirurgie qui peut engendrer des douleurs mod?r?es, une inflammation et une perte de poids pendant 2-3 jours. Le mod?le de t?te fix?e peut induire un stress chez l'animal, qui pourraient se manifester par des mouvements brusques, une locomotion anormale et/ou une absence de toilettage.
Devenir
Tous les animaux sont mis ? mort pour pr?l?vement de tissus et analyse
Remplacement
Cette ?tude vise ? caract?riser in vivo les dynamiques complexes des r?seaux neuronaux, en particulier la connectivit? fonctionnelle entre une structure c?r?brale profonde et le cortex, ? travers les diff?rentes couches corticales et selon les ?tats de vigilance. Des travaux ant?rieurs in vitro sugg?rent l?existence d?une organisation fonctionnelle d?pendante de la couche, mais ces r?sultats n?ont pas encore ?t? valid?s in vivo, notamment dans les couches profondes. Le recours ? des approches alternatives ne permet pas de r?pondre ? ces questions. Les mod?les in vitro, bien qu?informatifs, ne reproduisent ni l?int?grit? des circuits ? longue dis-tance ni leur modulation par des ?tats c?r?braux globaux tels que l??veil, le sommeil ou l?anesth?sie. De m?me, les approches in silico ne permettent pas encore de simuler de ma-ni?re fiable la dynamique multi-?chelle d?un r?seau complet de ce type, en raison du manque de donn?es exp?rimentales contraignant ces mod?les. Dans ce contexte, l?utilisation d?un mod?le animal appara?t indispensable. Le mod?le murin permet de pr?server l?int?grit? anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux, tout en donnant acc?s ? l?enregistrement de leur activit? en temps r?el dans des conditions physiologiques et comportementales pertinentes.
Réduction
Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? ? l?aide de calculs statistiques afin de garantir la robustesse des r?sultats tout en limitant leur nombre. Une approche s?quentielle sera mise en ?uvre, s?appuyant sur les r?sultats obtenus au cours des premi?res proc?dures pour ajuster et optimiser les suivantes, ?vitant ainsi l?utilisation d?animaux dans des conditions exp?rimentales non adapt?es. Par ailleurs, des enregistrements longitudinaux seront r?alis?s sur plusieurs sessions chez un m?me animal, permettant de maximiser la quantit? de donn?es recueillies et de r?duire le nombre total d?animaux n?cessaires. Les tissus seront syst?matiquement r?utilis?s pour des analyses anatomiques compl?mentaires, et le partage des donn?es brutes avec d?autres ?quipes sera encourag? afin de limiter le recours ? des exp?rimentations suppl?mentaires.
Raffinement
Si les animaux proviennent d?un ?tablissement agr?? ext?rieur, 2 semaines d?acclimatation aux nouvelles conditions d?animaleries sont pr?vues. Les souris sont h?berg?es en groupes sociaux dans des cages enrichies (mat?riel de nidifica-tion, b?tons ? ronger, tunnels) et font l?objet de suivis r?guliers de leur ?tat de sant?.Le change des cages se fait ? l?aide des tunnels. Les interventions invasives (chirurgies) sont r?alis?es sous anesth?sie profonde et analg?sie. La temp?rature corporelle des animaux est maintenue ? l?aide d?un tapis chauffant thermosta-t?. Apr?s chaque intervention, une p?riode de r?cup?ration post-op?ratoire est pr?vue, avec un suivi quotidien de l??tat de sant? ? l?aide de grille de score o? sont indiqu? des points limites pr?dictifs adapt?s permettant d?arr?ter la proc?dure d?s que n?cessaire. Pour les exp?riences impliquant un mod?le restreignant partiellement leurs mouvements, les animaux sont progressivement habitu?s ? l?exp?rimentateur et au site d?enregistrement afin de r?duire le stress li? ? cette posture. La dur?e de r?cup?ration post-session est adapt?e ? la dur?e de l?exp?rimentation : au moins 12 heures pour une session de moins d?une heure, 24 heures pour une session de deux heures, et 48 heures pour une session de plus de trois heures.
Choix des espèces
L?esp?ce animale choisie est la souris. La question scientifique ?tudi?e n?cessite un mod?le pr?sentant une structure neuroanatomique et des m?canismes physiologiques comparables ? ceux du cerveau humain. En particulier, le cortex, cible principale de la structure ?tudi?e, est conserv? chez la souris, mais absent ou tr?s diff?rent chez des organismes plus simples tels que C. elegans, la drosophile ou le poisson-z?bre. Le mod?le murin permet ainsi une approche cibl?e et pr?cise, tout en offrant une extrapolation possible ? d?autres esp?ces de mammif?res. L?ensemble des animaux sera utilis? ? un stade correspondant ? celui de ? jeunes adultes ?, avec des proc?dures d?butant entre 7 et 13 semaines. ? cet ?ge, le syst?me nerveux central est pleinement d?velopp?, garantissant la pertinence des observations exp?rimentales.
Identification et neurostimulation de réseaux cérébraux impliqués dans le développement de la dépression majeure suite à une douleur chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Une chirurgie sous anesthésie leur installe une douleur chronique censée produire un état anxio-dépressif, suivie de cinq examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer deux heures quarante, d'un test de douleur, de quatre tests d'anxio-dépression que le porteur ne nomme pas, d'un jeûne de vingt-quatre heures et d'un isolement de même durée en cage individuelle. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype anxio-dépressif "sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Il juge "indispensable" de travailler sur un "modèle animal, social, entier" et qualifie la souris adulte d'"incontournable dans la recherche en neurosciences".
Objectifs
La dépression majeure est une maladie fréquente qui touche environ 5 à 10 % de la population mondiale. Elle représente aujourd’hui l’une des principales causes d’invalidité et constitue un enjeu majeur de santé publique, avec un impact social et économique très important en Europe. Malgré les nombreux travaux de recherche menés dans ce domaine, le diagnostic repose encore principalement sur l’évaluation clinique des symptômes, car aucun biomarqueur fiable de la maladie n’a encore été identifié. Une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression est donc nécessaire afin d’identifier de nouveaux outils diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques. La douleur chronique est un facteur important dans le développement de la dépression : environ la moitié des patients dépressifs présentent également des douleurs chroniques. Des études d’imagerie cérébrale ont montré que ces troubles sont associés à des modifications de l’organisation et du fonctionnement de certains réseaux cérébraux. Cependant, les altérations spécifiques liées à l’association entre douleur chronique et dépression restent encore mal comprises. Ce projet vise à étudier ces mécanismes à l’aide d’un modèle murin de douleur chronique associé à un état anxio-dépressif. L’objectif est d’analyser l’évolution des connexions entre différentes régions du cerveau au cours du temps, ainsi que l’effet potentiel de stimulations cérébrales ciblées sur ces réseaux. Les protocoles de stimulation utilisés s’inspirent directement d’approches de neuromodulation actuellement étudiées chez l’humain et l’étude des modifications cérébrales sera réalisée grâce à l’imagerie par résonance magnétique, une technique non invasive largement utilisée en recherche clinique, ce qui favorisera la comparaison entre les résultats obtenus chez l’animal et ceux observés chez les patients. À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux comprendre les bases biologiques de ces troubles et à développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels associés.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier des biomarqueurs cérébraux caractéristiques du développement de la comorbidité douleur - dépression, ainsi que d’approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques. L’identification de ces biomarqueurs et la caractérisation des effets de ces protocoles de neurostimulation permettra, in fine, d’optimiser l’efficacité thérapeutique et d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h -Les animaux sont soumis à un maximum de 5 examens IRM sous anesthésie d’une durée maximale de 2h40. - Les animaux subissent un test évaluant la douleur de 15 minutes en moyenne. – Les animaux subissent une stimulation courte de maximum 20 secondes, et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). Les tests répétables seront effectués un maximum de deux fois. - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental. -Les animaux seront mis en cage individuelle pour une période de 24h maximum au cours de l’un des tests comportementaux. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aiguë, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation fonctionnelle et comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité des réponses individuelles des animaux.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines après leur arrivée pour s’habituer aux nouvelles conditions environnementales. Ils seront hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences
Imagerie photoacoustique et de fluorescence de l’activité neuronale dans le systeme nerveux central chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 65
Ouverture du crâne pendant trente minutes à deux heures quinze, pose d'une fenêtre crânienne, injections de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau au moyen d'un cadre stéréotaxique : 194 souris et 65 rats, 259 individus au total, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Certains enchaînent des séances d'imagerie répétées pendant quelques semaines à plusieurs mois, jusqu'à ce que la qualité des données ne permette plus de poursuivre. L'objectif est de mettre au point l'imagerie photoacoustique, une technique dont les applications médicales sont renvoyées au long terme. Le porteur indique que l'effectif n'a pas été calculé statistiquement, les informations requises manquant encore pour cette technologie, et l'avoir fixé d'après son expérience et celle d'autres équipes.
Objectifs
Les techniques actuelles de microscopie permettent d’observer l’activité des neurones dans le cerveau avec une très grande précision. Cependant, la lumière utilisée pour ces observations ne pénètre que sur une faible profondeur, de l’ordre d’un millimètre. L’étude de régions cérébrales plus profondes nécessite alors des interventions chirurgicales invasives pouvant altérer les tissus observés. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à des profondeurs plus importantes tout en limitant ces contraintes. Cette technique utilise la lumière pour stimuler les tissus et les ultrasons pour recueillir l’information. Elle pourrait ainsi permettre d’accéder à des régions du cerveau aujourd’hui difficiles à étudier. L’objectif de ce projet est de développer et d’optimiser cette technologie afin de la rendre utilisable pour l’étude de l’activité neuronale. Les travaux porteront sur trois aspects complémentaires : l’amélioration des performances de l’instrument d’imagerie, le développement de fenêtres crâniennes adaptées permettant le passage de la lumière et des ultrasons, et l’identification des marqueurs biologiques les plus adaptés à cette nouvelle méthode. Une première phase d’optimisation sera réalisée sur des échantillons de tissu nerveux, avant une phase d’évaluation chez l’animal vivant. À terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles approches d’imagerie cérébrale permettant d’étudier le fonctionnement du cerveau de façon moins invasive et à plus grande profondeur que les techniques actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La compréhension du fonctionnement du cerveau repose sur la capacité à observer l’activité des neurones dans des conditions aussi proches que possible de leur état naturel. Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre de nombreuses maladies neurologiques, psychiatriques ou neurodégénératives et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles méthodes de diagnostic ou de traitement. Les techniques actuelles d’imagerie permettent déjà d’observer l’activité cérébrale avec une très grande précision, mais elles sont principalement limitées aux régions superficielles du cerveau. L’étude de structures plus profondes nécessite souvent des interventions invasives susceptibles de perturber les tissus observés. L’imagerie photoacoustique constitue une approche prometteuse pour dépasser cette limitation. Elle pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à plusieurs millimètres de profondeur, voire davantage, tout en limitant les perturbations induites par la mesure elle-même. À terme, cette technologie pourrait permettre l’étude de structures cérébrales profondes impliquées dans la mémoire, le mouvement, les émotions ou certaines pathologies neurologiques. Le projet vise ainsi à développer et optimiser une nouvelle méthode d’imagerie fonctionnelle du cerveau, capable de fournir des informations plus détaillées et moins invasives que celles actuellement accessibles pour les régions profondes du système nerveux central. Les connaissances acquises bénéficieront principalement à la recherche fondamentale en neurosciences, mais elles pourraient également contribuer, à plus long terme, à l’amélioration de la compréhension et de la prise en charge de nombreuses maladies du cerveau.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions réalisées sous anesthésie générale : * Injection de faibles volumes de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau à l’aide d’un dispositif stéréotaxique. Cette intervention dure généralement entre 1 heure 15 minutes et 1 heure 45 minutes et est suivie d’une période de récupération post-opératoire. * Réalisation d’une ouverture limitée de l’os du crâne (craniotomie) afin de permettre l’accès aux structures cérébrales d’intérêt et, selon les procédures, la mise en place d’une fenêtre crânienne destinée à l’imagerie. Selon la procédure, la durée de l’intervention est comprise entre 30 minutes et 2 heures 15 minutes. Les animaux récupèrent ensuite de l’anesthésie et bénéficient d’un suivi post-opératoire adapté. * Séances d’imagerie réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie générale selon la procédure considérée. Ces séances permettent d’enregistrer l’activité cérébrale sans provoquer de douleur supplémentaire. * Dans les procédures où la dernière intervention est terminale, les animaux sont placés sous anesthésie profonde et ne sont pas réveillés. Selon les objectifs scientifiques, cette intervention se termine soit par une perfusion intracardiaque, soit par l'administration d'un agent euthanasiant. Ces procédures terminales durent généralement une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont liées aux interventions chirurgicales nécessaires à la réalisation du projet, notamment les injections ciblées dans le cerveau et la mise en place de fenêtres crâniennes permettant l’imagerie. Comme pour toute intervention chirurgicale, ces procédures peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire après l’opération ainsi qu’une perte de poids temporaire pendant la phase de récupération. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale et bénéficient d’une prise en charge antalgique avant, pendant et après la chirurgie afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux font également l’objet d’un suivi post-opératoire rapproché permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Dans un faible nombre de cas, des irritations locales, une inflammation ou une infection peuvent apparaître au niveau de la zone opérée ou autour de la fenêtre crânienne. Si nécessaire, des traitements adaptés (anti-inflammatoires, analgésiques ou traitements locaux) sont mis en œuvre et des points limites prédéfinis permettent d'interrompre la procédure et de procéder à une euthanasie anticipée si le bien-être de l’animal est compromis. Les séances d’imagerie elles-mêmes sont non invasives. Elles sont réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie selon les procédures et ne devraient pas entraîner de douleur supplémentaire pour les animaux.
Devenir
À l'issue de toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sont mis à mort. Les procédures 1 et 2 se terminent par une perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale profonde. Cette intervention terminale est nécessaire à la préparation, à la conservation et à l'analyse des tissus nerveux dans le cadre du projet. Dans les procédures 3, 4 et 5, les animaux participent à des séances répétées d'imagerie cérébrale pendant une période pouvant aller de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la qualité et de l'intérêt scientifique des données recueillies. Lorsque les objectifs scientifiques du projet sont atteints ou que la qualité des données ne permet plus de poursuivre les acquisitions dans des conditions satisfaisantes, les animaux sont euthanasiés. En outre, tout animal atteignant l'un des points limites prédéfinis garantissant son bien-être est immédiatement retiré de l'étude et mis à mort. La dernière phase de la procédure 6 est réalisée sous anesthésie terminale. Les animaux ne sont pas réveillés après la séance d'imagerie et sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde à l'issue de celle-ci. Aucun animal ne peut être replacé ou réutilisé à l'issue des procédures, en raison des interventions chirurgicales réalisées, de la présence d'implants crâniens, des injections intracérébrales effectuées et, selon les procédures, de la nécessité de prélever ou de préserver les tissus dans des conditions compatibles avec les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les cultures cellulaires et les autres méthodes réalisées en dehors de l’organisme vivant constituent des outils précieux pour réduire le recours aux animaux et sont utilisées dans ce projet chaque fois qu’elles permettent de répondre à une question scientifique. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du cerveau ou de la moelle épinière, qui reposent sur les interactions entre de très nombreuses cellules organisées en réseaux et en communication permanente avec le reste de l’organisme. Les préparations de tissu nerveux (tranches) préservent une partie de ces connexions et seront utilisées lors de la phase initiale d’optimisation du projet. Elles permettent d’obtenir des informations importantes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, elles ne reproduisent qu’imparfaitement le fonctionnement du système nerveux dans un organisme vivant. L’objectif principal du projet étant de développer une méthode permettant d’observer l’activité cérébrale dans des conditions physiologiques, certaines questions scientifiques nécessitent l’étude du cerveau chez l’animal vivant. À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir l’ensemble des informations recherchées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux sont hébergés dans des conditions contrôlées, conformes aux bonnes pratiques, afin de limiter le stress et les problèmes sanitaires susceptibles d'influencer les résultats. Cette standardisation permet d'obtenir des données plus fiables et de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Habituellement, le nombre d'animaux utilisé dans une étude est déterminé à l'aide de méthodes statistiques. Toutefois, le présent projet vise à développer et optimiser une nouvelle technologie d'imagerie, pour laquelle les informations nécessaires à ce type de calcul ne sont pas encore disponibles. Les effectifs ont donc été définis à partir de notre expérience et de celle d'autres équipes utilisant des approches similaires. Plusieurs mesures sont mises en œuvre pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs expériences sont réalisées sur un même animal. Pour les procédures où cela est pertinent, une première phase d'optimisation technique, conduite sur un nombre limité d'animaux, permet d'identifier les meilleures conditions expérimentales avant le lancement des expériences principales. Cette stratégie réduit les échecs d'origine technique et contribue ainsi à limiter l'utilisation d'animaux. Enfin, les expériences sont réalisées chez des animaux des deux sexes afin d'éviter la production d'animaux non utilisés et de garantir que les résultats obtenus soient représentatifs des femelles comme des mâles.
Raffinement
Le projet a été conçu de manière à réduire autant que possible la douleur, la souffrance, l’angoisse et les contraintes imposées aux animaux. Les animaux sont hébergés en groupes afin de préserver leurs interactions sociales (2 à 5 souris ou 2 à 3 rats par cage). Leur environnement est enrichi à l’aide de matériaux de nidification, d’abris et d’objets à explorer ou à ronger. Ces enrichissements sont régulièrement renouvelés afin de favoriser l’expression de comportements naturels et d’améliorer leur bien-être. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale. L’anesthésie par inhalation est privilégiée car elle permet un endormissement et un réveil rapides ainsi qu’un meilleur contrôle de la profondeur anesthésique. Des traitements antalgiques sont administrés avant et après les interventions afin de prévenir et limiter la douleur. Une analgésie locale est également réalisée au niveau de la zone opérée. Pendant les interventions, la température corporelle des animaux est maintenue à l’aide d’une couverture chauffante et un gel ophtalmique est appliqué afin de protéger les yeux. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opératoire est désinfectée afin de limiter les risques d’infection. Après les interventions, les animaux bénéficient d’un suivi renforcé permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de complication. Leur état général, leur poids et leur comportement sont évalués à l’aide d’une grille de suivi standardisée. Si des signes de douleur ou d’altération du bien-être sont observés, des traitements adaptés sont administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, des points limites prédéfinis conduisent à une euthanasie anticipée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Notre expérience montre que les interventions prévues dans ce projet sont généralement bien tolérées lorsque ces mesures de prise en charge et de suivi sont appliquées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche en neurosciences. Leur système nerveux présente de nombreuses similitudes d’organisation et de fonctionnement avec celui des autres mammifères, ce qui en fait des modèles particulièrement adaptés pour développer et évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie du cerveau. Le projet utilise à la fois des souris et des rats, car ces deux espèces présentent des avantages complémentaires. Les souris permettent notamment de tirer parti des nombreuses ressources génétiques disponibles, en particulier des lignées transgéniques exprimant des marqueurs biologiques d’intérêt pour l’étude de l’activité neuronale. Des souris sauvages et transgéniques adaptées aux objectifs du projet seront utilisées. Les rats seront principalement utilisés lors des expériences d’imagerie chez l’animal vivant. Leur taille plus importante est mieux adaptée aux caractéristiques techniques du système d’imagerie photoacoustique utilisé dans ce projet et facilite l’étude de structures cérébrales plus profondes. Certaines souches de rats, notamment les rats Long-Evans, pourront être privilégiées lorsque leurs caractéristiques sont particulièrement adaptées aux procédures prévues. Le projet nécessite l’utilisation d’animaux à différents stades de développement. Les expériences réalisées sur des échantillons de tissu nerveux utilisent préférentiellement de jeunes animaux, car leurs tissus sont mieux adaptés à la préparation de tranches destinées aux études préliminaires. Les expériences d’imagerie chez l’animal vivant sont réalisées chez des animaux plus âgés, dont le système nerveux est suffisamment développé pour répondre aux objectifs du projet.
Signalisation astrocytaire en physiopathologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 80 d'entre elles subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau pouvant durer quatre heures, et 80 huit séances d'imagerie de soixante minutes maintenues sous contention. Jusqu'à 332 souris reçoivent en plus des substances par gavage cinq jours de suite ou par voie orale huit fois. Le projet cherche à localiser un facteur de transcription dans les prolongements des astrocytes qui touchent les vaisseaux du cerveau, après induction d'une inflammation périphérique, les retombées annoncées pour la maladie d'Alzheimer ou l'accident vasculaire cérébral restant à l'état de perspectives. Toutes sont mises à mort pour prélever leur cerveau, analysé en biochimie et en histologie.
Objectifs
Les astrocytes sont des cellules importantes dans le cerveau. Elles remplissent des fonctions clés notamment au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux, qu’elles contactent par des structures spécialisées appelées prolongements périvasculaires. En conditions pathologiques, les astrocytes subissent d’important changements, sous l’influence notamment de voies de signalisation qui activent l’expression de gènes cibles dans le noyau des astrocytes, via des facteurs de transcription. Des données préliminaires montrent que certains facteurs de transcription sont aussi présents dans les prolongements périvasculaires des astrocytes, près des vaisseaux. Nous émettons l’hypothèse qu’un facteur de transcription cible a un rôle spécifique au niveau des prolongements périvasculaires, où il pourrait détecter les signaux physiopathologiques venant de la périphérie et réguler efficacement la fonction des astrocytes. Nous utiliserons une nouvelle souris transgénique dans laquelle ce facteur de transcription est marqué par une protéine fluorescente seulement dans les astrocytes, qui ne s’exprimera qu’après traitement au tamoxifène. Nous pourrons alors visualiser directement sa localisation et ses mouvements dans les prolongements périvasculaires par imagerie biphotonique. Nous pourrons aussi identifier les partenaires de ce facteur de transcription dans les prolongements périvasculaires, grâce à des analyses protéomiques en conditions physiologiques et après induction d’une inflammation périphérique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le fonctionnement des astrocytes à l’interface avec le système vasculaire en conditions normales et inflammatoires. Ceci ouvre des perspectives thérapeutiques pour mieux cibler des potentielles altérations pathologiques au niveau vasculaire qui se produisent dans de nombreuses pathologies du cerveau (maladie d’Alzheimer, inflammation, accident vasculaire cérébral…).
Procédures
Injection sur souris vigile ou anesthésiée : 10 sec, 1 fois. (196 souris) Administration de substance par gavage sur souris vigile : 10 secondes, 5 fois sur 5 jours (maximum 332 souris) ou par voie orale sur souris vigile : 1 min, 8 fois au total (1 fois/jour) (maximum 332 souris) Chirurgie avec injection dans le cerveau sur souris anesthésiée : 4h maximum, 1 fois (80 souris) Injection d’une substance sur souris anesthésiée, 30 secondes, 5 fois sur 5 jours (40 souris) Imagerie sur souris vigile après habituation à la contention : 8 sessions de 60 min maximum sur 5 jours. (80 souris)
Impact sur les animaux
Des douleurs post-opératoires modérées et de courte durée sont possibles. Certaines injections peuvent induire un inconfort de type « état grippal » : provoquant des douleurs légères à modérées pendant maximum 72h. Stress et inconfort liés à la contention nécessaire pour l’acquisition d’images. Stress léger lors de l’administartion par gavage et douleur légère et de courte durée liées à certaines injections.
Devenir
Les souris de chaque procédure seront mises à mort par une méthode validée, pour récupérer leur cerveau qui sera analysé par différentes méthodes complémentaires (biochimie, histologie)
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes, mais aussi avec les vaisseaux sanguins, objets de cette étude. Ces interactions cellulaires complexes ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles de lignées cellulaires ou cultures dérivées de cellules induites à la pluripotence ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. Les modèles animaux permettent d’étudier les neurones, les astrocytes et les cellules vasculaires dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 568 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris grâce à des approches de protéomique et d’analyses histologiques. De même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir mettre à mort des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant l’imagerie permet de réduire le stress des souris. Enfin, nous évaluerons l’administration de substance par prise volontaire pour éviter le stress de la contention lors du gavage.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones, astrocytes et cellules vasculaires. Les organismes modèles simples (C Elegans, D Melanogaster) possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère et pas de véritable système vasculaire. Seul le modèle souris que nous allons utiliser dans ce projet permet d’identifier notre protéine d’intérêt seulement dans les astrocytes grâce à sa fusion à une protéine fluorescente i) détectable par microcopie biphotonique et en histologie et ii) purifiable par des techniques de biochimie. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et vasculaire mature. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et avasculaire mature.
Organisation et plasticité du microenvironnement hypothalamique : contribution de la matrice extracellulaire, des tanycytes et des signalisations neuro-immunes au contrôle des fonctions métaboliques et reproductives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
14 038 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à quatre heures d'anesthésie pour une chirurgie crânienne, une ablation des ovaires ou des testicules de quinze à vingt minutes, des prélèvements sanguins répétés et douze semaines de régime gras ou sucré. Les protocoles s'étalent de deux à soixante-douze semaines, avec des jeûnes allant jusqu'à seize heures et des isolements de deux semaines répétés deux fois, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. L'objet déclaré porte sur la communication entre l'hypothalamus, les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, avec un espoir formulé au conditionnel d'améliorer des traitements de l'obésité. Le porteur justifie la mise à mort de toutes par "la nécessité de récupérer les organes et tissus à l'issue des expériences".
Objectifs
Le fonctionnement de l’organisme repose sur une communication constante entre le cerveau et les organes périphériques. Ce dialogue permet de réguler des fonctions essentielles telles que l’équilibre énergétique, qui contrôle la prise alimentaire et la dépense d’énergie, ainsi que la reproduction. Une partie clé de cette régulation se déroule dans l’hypothalamus, une région du cerveau spécialisée dans l’intégration des signaux provenant du reste du corps. Au sein de l’hypothalamus, le noyau arqué joue un rôle central. Cette structure reçoit en permanence des informations issues de la circulation sanguine, notamment sous forme d’hormones, qui renseignent sur l’état physiologique de l’organisme. Ces signaux doivent ensuite être transmis aux neurones pour déclencher des réponses adaptées. Plusieurs types de cellules participent à cette communication. Les cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins, régulent le passage des molécules depuis le sang vers le tissu cérébral. Les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), localisés à l’interface entre le cerveau et le liquide cérébrospinal, contribuent également au transfert et à la distribution de ces signaux. En parallèle, l’environnement extracellulaire, c’est-à-dire l’espace situé entre les cellules, constitue un milieu de diffusion essentiel pour les molécules avant qu’elles n’atteignent leurs cibles neuronales. L’ensemble de ces éléments forme un système dynamique dans lequel les interactions cellulaires et moléculaires permettent d’assurer une communication fine entre la périphérie et le cerveau. Certaines composantes de cet environnement, comme la matrice extracellulaire, pourraient jouer un rôle actif dans la distribution et l’efficacité des signaux. De plus, des échanges étroits entre les tanycytes et les cellules vasculaires semblent contribuer à coordonner le passage de l’information. Enfin, des liens existent entre ces mécanismes de régulation et le système immunitaire, suggérant que cette région du cerveau est également sensible aux signaux liés à l’inflammation ou à l’état immunitaire de l’organisme. Mieux comprendre ces interactions représente un enjeu important pour décrypter les mécanismes qui contrôlent les grandes fonctions physiologiques et leurs dérèglements.
Bénéfices attendus
L’hypothalamus médio-basal est une petite région du cerveau qui joue un rôle essentiel dans la régulation de fonctions vitales comme le métabolisme (équilibre énergétique et pondéral) et la reproduction. Ce projet de recherche s’intéresse à l’environnement qui entoure les cellules de cette région cérébrale, ainsi qu’aux échanges entre différents types de cellules, notamment les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), les vaisseaux sanguins et le système immunitaire. L’un des objectifs est de mieux comprendre le rôle de la matrice extracellulaire, c’est-à-dire le réseau de molécules qui entoure les cellules. Cette structure pourrait influencer la manière dont le cerveau répond à certaines hormones impliquées dans le métabolisme, y compris celles utilisées actuellement pour traiter l’obésité. En améliorant ces connaissances, il serait possible d’optimiser les traitements existants ou de développer de nouvelles approches pour lutter contre les maladies métaboliques qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Le projet cherche également à identifier de nouveaux mécanismes de communication entre les tanycytes et les vaisseaux sanguins. Ces interactions sont importantes pour maintenir des barrières protectrices entre le sang et le cerveau. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait permettre, à terme, de contrôler temporairement ces barrières afin de faciliter l’entrée de médicaments dans le cerveau, ce qui constitue aujourd’hui un défi important pour de nombreuses thérapies. Enfin, cette étude vise à identifier pour la première fois les cellules immunitaires présentes dans cette région du cerveau et à comprendre leur rôle potentiel dans la régulation du métabolisme et de la reproduction. Jusqu’à présent, ces cellules ont été peu étudiées dans ce contexte. Elles pourraient pourtant représenter de nouvelles cibles pour développer des traitements innovants.
Procédures
Selon les procédures, des traitements pourront être administrés de différentes manières : par voie orale (1min), par injection (1min) ou via un implant sous cutané (durée maximale 20 minutes) selon les volumes et fréquences maximales recommandées pour le bien être de l’animal et dans le respect de la réglementation en vigueur. Dans certains groupes, après une anesthésie par voie gazeuse ou par injection, des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’administrer des traitements par injection au niveau du cerveau (durée anesthésie : 1h, intervention : 30 à 45 min) ou de mettre en place des dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (durée intervention/anesthésie : 2 à 4h). Afin d’étudier les fonctions reproductrices, des ablations des ovaires ou des testicules pourront être réalisées (Durée intervention : 15-20 min. Durée anesthésie maximum 1h). Afin d’étudier les effets des différents traitements sur les animaux, certains groupes pourront : - Subir des prélèvements sanguins unique ou répétés (5 à 20 minutes) - Être isolés physiquement de leurs congénères (pas d’isolement olfactif ou visuel) (maximum 2 semaines, répété 2 fois) - Subir des traitements complémentaires par injection (1 min) - Être pesés plusieurs fois par semaine (1min) Les animaux impliqués dans l’études du métabolisme pourront avoir un régime alimentaire modifié, tel que des régimes riches en graisses ou en sucre (durée maximale 12 semaines), ou une mise à jeun (durée maximale 16h). La prise en charge de la douleur impliquera également des injections d’anti-douleur (1min). Les animaux seront suivis pendant 2 à 72 semaines en fonction des protocoles avec des temps d’acclimatation et de récupération suffisants entre chaque intervention.
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie, d’injections ou de prélèvements de sang peuvent provoquer des douleurs à court-terme qui seront limitées par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure si nécessaire. Afin d’évaluer l’impact du métabolisme ou des rythmes naturels, il sera parfois nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant deux semaines (pour l’analyse en cages métaboliques par exemple). Cet isolement reste limité puisque les animaux seront maintenus dans des cages transparentes adjacentes, permettant un contact visuel entre congénères.
Devenir
La nécessité de récupérer les organes et tissus à l’issue des expériences implique la mise à mort de l’ensemble des animaux de ce projet
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous privilégions des approches sur cellules et réalisées par ordinateur pour atteindre les trois objectifs de ce projet. Ces méthodes incluent : 1) l’analyse des interactions matrice/récepteur par modélisation informatique, 2) l’étude des voies de signalisation cellulaire et 3) la culture en laboratoire de cellules spécifiques. Cependant, pour obtenir une compréhension globale et intégrée de l’hypothalamus médio-basal et de ses mécanismes physiopathologiques, l’approche animale reste indispensable. En effet, les modèles n’utilisant pas d’animaux présentent des limites majeures : 1) Ils ne permettent pas d’étudier les interactions dynamiques entre les cellules et leur matrice extracellulaire, essentielles pour comprendre la plasticité tissulaire, 2) Ils ne reproduisent pas les dialogues complexes entre les cellules spécialisées et les vaisseaux sanguins, cruciaux pour le contrôle de la perméabilité de la barrière entre les vaisseaux et le cerveau, 3) Ils ne capturent pas les interactions entre les cellules immunitaires et le système neuroendocrine, qui jouent un rôle clé dans la régulation métabolique et reproductive. Seule l’approche animale permet d’appréhender ces processus dans leur ensemble, en tenant compte de la complexité des réseaux neuronaux, vasculaires et endocriniens qui régissent cette région cérébrale, essentielle au contrôle du métabolisme et de la reproduction.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour extraire un maximum de données de chaque groupe d’animaux, en intégrant des mesures multiples et des suivis longitudinaux. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines parties sont partagées entre les trois objectifs principaux du projet, évitant ainsi une utilisation excessive d’animaux. La taille des groupes a été définie par une analyse de statistique spécifique, fondée sur : 1) les effets biologiques attendus, estimés à partir de nos précédents travaux et 2) les données issues de la littérature pour des modèles similaires.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard et réglementaire d’hébergement. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un enrichissement est ajouté dans la cage pour stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. Les périodes d’isolement sont limitées et justifiées. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement afin de limiter tout stress, angoisse ou douleur. Une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long du projet. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, sera mis à mort.
Choix des espèces
Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à élucider les interactions entre le cerveau et les organes périphériques, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies métaboliques et reproductives, telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé dans ce type de recherche, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. Par ailleurs, la disponibilité de nombreux modèles murins génétiquement modifiés offre la possibilité de concevoir des approches ciblées, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les variations expérimentales. Tous les animaux de ce projet sont utilisés au stade adulte entre 6 semaines et 24 mois selon les objectifs.
Etude des effets de nouveaux composés dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un peptide est injecté directement dans le cerveau de 9 360 souris sous anesthésie gazeuse pour y induire des symptômes de la maladie d'Alzheimer, suivi d'injections quotidiennes pendant un à sept jours. Ces souris passent ensuite dix-huit jours de tests de mémoire, dont un ou deux tests d'évitement passif reposant sur une stimulation électrique appliquée aux pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le cerveau et procéder à des analyses biochimiques. Le résumé décrit pourtant ces souris comme ayant "des pertes de mémoire mais qui n'impactent pas la qualité de vie des animaux dans leur lieu d'hébergement".
Objectifs
La mise au point d’un traitement contre la maladie d’Alzheimer constitue aujourd’hui un enjeu majeur. Toutefois, en raison de la complexité de cette pathologie, il est largement admis qu’une approche thérapeutique ciblant un seul mécanisme ne suffira pas. Dans ce contexte, nous nous attachons à identifier de nouvelles molécules présentant un fort potentiel neuroprotecteur. Il est donc essentiel d’évaluer l’efficacité de ces molécules dans un modèle in vivo de la maladie d’Alzheimer, en vue d’une future application clinique. Pour ce faire, un modèle murin pharmacologique sera utilisé : les animaux recevront les molécules, seules ou en association, pendant une durée de sept jours. Leur mémoire sera ensuite analysée à l’aide de tests comportementaux adaptés.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur un modèle aigu prédictif de la MA, avant de plus longues expérimentations sur un modèle transgénique, pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules de nouvelle génération active seule ou en combinaison pour une action modifiant de façon durable le décours de la maladie.
Procédures
Les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection intracérébroventriculaire du peptide. Cette procédure dure environ 7 minutes entre le début de l’anesthésie et la fin de l’injection. Pendant une durée de 1 à 7 jours, les animaux recevront ensuite une administration quotidienne des molécules à tester par injection intrapéritonéale ou par voie orale. À l’issue du traitement, les fonctions de mémoire seront évaluées au moyen de tests comportementaux (10 jours). Les animaux réaliseront notamment 1 à 2 tests d’évitement passif, d’une durée de 5 minutes maximum chacun. D’autres tests comportementaux complémentaires pourront également être réalisés afin d’évaluer la mémoire à court et long terme (18 jours au total).
Impact sur les animaux
Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer (MA). Cette procédure sera suivie par une ou plusieurs injections systémiques, ce qui pourra engendrer du stress chez l'animal. Par ailleurs, le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'une stimulation électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris. Ces animaux ont des pertes de mémoire mais qui n'impactent pas la qualité de vie des animaux dans leur lieu d'hébergement. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés pour prélèvement des tissus d'intérêt.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.
Remplacement
Les molécules sont d'abord testées (et donc sélectionnées) in vitro sur des modèles de culture cellulaire ou sur des larves de poisson zèbre. Seules les moléculesayant montré une efficacité sont ensuite sélectionnées pourune évaluation in vivo. L’utilisation de modèles murins de la Maladie d'Alzheimer reste néanmoins indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la maladie dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.
Réduction
Les molécules sont testées sur une gamme limitée de doses définie selon les résultats antérieurs du laboratoire pour chaque type de composé. Les animaux passent plusieurs tests comportementaux afin d’évaluer différentes formes de mémoire chez un même individu . Les tests sont organisés du plus simples au plus contraignant. Les analyses statistiques validées par un logiciel de calcul de puissance sont ajustées pour limiter le nombre d’animaux, avec en général 12 souris par groupe.
Raffinement
Nous procéderons à un enrichissement limité du milieu, car un enrichissement trop important peut interférer avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront uniquement accès à des copeaux de carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la construction d’un nid. Les animaux seront également manipulés quotidiennement afin de favoriser leur habituation à la présence de l’expérimentateur et de diminuer le stress lié aux manipulations. Leur état de santé et leur bien-être feront l’objet d’un suivi quotidien tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Le modèle utilisé chez la souris permet de reproduire rapidement certains troubles de la mémoire observés dans la maladie d’Alzheimer et d’obtenir des résultats préliminaires utiles avant des études plus approfondies sur d’autres modèles de recherche. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, âge auquel les troubles de la mémoire et les modifications biologiques recherchées sont les mieux caractérisés dans ce modèle.
MODIFICATION Etude des mécanismes de sensibilisation nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de substance détruisant les neurones dopaminergiques est pratiquée sur des souriceaux de cinq jours : 6 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques. S'y ajoutent une chirurgie d'implantation de deux heures, cinq jours de restriction calorique à partir du 49e jour, puis trois à cinq heures d'imagerie et d'enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière au 53e jour. Le porteur attend une perte de poids et une hypothermie liées à l'injection, un risque d'infection lié aux implants, et un stress social qu'il rattache à l'hébergement individuel. Il situe l'âge adulte de la souris à 21 jours dans la description des procédures, et à plus de cinq semaines dans sa justification du choix de l'espèce.
Objectifs
Nous nous intéressons à la régulation de la nociception dans le cerveau et à ses effets sur l’intégration sensorielle dans la moelle épinière. La nociception est une douleur déclenchée par une agression de l'organisme elle est ensuite intégré par le système nerveux central et périphérique dont la moelle épinière. Nous étudions en particulier les dysfonctionnements cérébraux qui caractérisent certaines pathologies émotionnelles et psychiatriques et qui sont aussi responsables de douleurs. A ce titre, nous nous intéressons aux anomalies sensorielles fréquemment décrites en clinique dans des conditions d’anxiété pathologique, ou dans les troubles de l’attention et de l’hyperactivité, avec ou sans impulsivité (TDAH). Plus précisément, nous cherchons à comprendre le rôle de différents systèmes moléculaires dans l'activité de certaines régions corticales et dans le développement de la douleur et des symptômes du TDAH. Dans ce but, nous combinons des approches méthodologiques variées pour étudier les comportements et pour analyser l’activité des populations neuronales impliquées
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent le traitement de la douleur, et en particulier des douleurs associées à des pathologies anxieuses ou au TDAH. Au-delà d'un inconfort temporaire. la sensibilisation chronique à la douleur provoque une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Cette sensibilisation amplifie à son tour les symptômes du TDAH et de l'anxiété et contribue à la mise en place d'un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Nos études permettront de développer des traitements efficaces car ils empêcheront les interactions entre ces pathologies et les douleurs, et bloqueront l'aggravation mutuelle des symptômes. L’innovation consiste à étudier des circuits, ou des systèmes moléculaires, qui interviennent à la fois dans ces pathologies neuropsychiatriques et dans la douleur. Ce sont les mécanismes moléculaires partiellement communs aux douleurs et aux troubles neuropsychiatriques associés qui seront la cible des traitements à développer.
Procédures
Chirurgie et implantation à l’âge adulte à 21 jours (2heures), injection cérébrale et injection de substance qui induit la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souriceaux à 5 jours (30minutes), restriction calorique à 49 jours (pendant 5 jours), imagerie et enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière à la fin de la procédure à 53 jours (3-5heures),
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants et la CFA 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental 4/ un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection de la 6-OHDA. 5/ STRESS SOCIAL SUITE A L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus pour les analyses histologiques et la vérification des coorodonées des injections et l'histologie des tissus
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur. AFIN DE DIMINUER L’IMPACT DU STRESS SOCIAL SUITE À L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL, UN ENRICHISSEMENT ENVIRONNEMENTAL RICHE EST MIS EN PLACE. UN SUIVI COMPORTEMENTAL RENFORCÉ SERA AUSSI ASSURÉ POUR DÉTECTER PRÉCOCEMENT TOUT SIGNE DE DÉTRESSE. CE SUIVI INCLUT UNE OBSERVATION CLINIQUE SYSTÉMATIQUE TOUS LES JOURS(ACTIVITÉ, POSTURE, PELAGE, RÉACTIVITÉ). AUSSI DES MANIPULATIONS, RÉALISÉES DE MANIÈRE DOUCE ET RÉGULIÈRE POUR MAINTENIR LE CONTACT TACTILE ET OLFACTIF
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 semaines. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.