Système nerveux

Réattribués à une nouvelle procédure après validation vétérinaire, dix macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance commence par une mise à jeun depuis la veille, se poursuit sous anesthésie continue avec trois cathéters posés, et comporte jusqu'à trente prélèvements sanguins, dans la limite de 15 % du volume circulant de l'animal. Le porteur reconnaît que des prélèvements trop répétés peuvent provoquer une anémie, et que l'hébergement individuel imposé le temps de la décroissance du radioisotope, jusqu'à 72 heures, constitue un stress. Il justifie le recours au macaque par la taille de ses veines, par la ressemblance de son cerveau avec celui de l'humain, et par le fait que ces études pharmacologiques ne sont "souvent pas autorisées chez l'homme".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objectif de vérifier si certaines molécules d’intérêt médical peuvent se fixer de manière fiable à une cible biologique précise, susceptible d’être utilisée en diagnostic ou en thérapie. Pour cela, nous utilisons une technique d’imagerie non invasive appelée tomographie par émission de positons (TEP), qui permet de suivre le comportement de ces molécules dans l’organisme vivant. La première question posée est de savoir si le radiotraceur utilisé se lie réellement à la cible visée, et si cette liaison est suffisamment spécifique et sélective. Autrement dit, il s’agit de vérifier que le signal observé correspond bien à la cible d’intérêt et non à d’autres structures biologiques. Cette étape est étudiée en administrant une molécule compétitrice connue, capable de prendre la place du radiotraceur. La deuxième question porte sur la reproductibilité des mesures, c’est-à-dire les différences de distribution du radiotraceur entre différents individus et également chez un même individu (test-retest). La troisième question concerne le devenir des molécules d’intérêt dans le sang et les tissus : sa répartition entre le sang total et le plasma, sa liaison aux protéines sanguines, sa stabilité dans le temps et sa distribution dans les organes. Enfin, la quatrième question vise à évaluer l’exposition globale de l’organisme au radiotraceur, un paramètre clé pour anticiper une utilisation future chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront des résultats significatifs dans la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre des molécules d’intérêt médical et leurs cibles dans l’organisme. Ces connaissances contribueront à accélérer le développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. En définissant des critères clairs de sélection des molécules dès les premières étapes de la recherche, les résultats permettront de mieux orienter les efforts scientifiques vers les solutions les plus efficaces, tout en limitant le recours ultérieur à des études plus complexes et plus lourdes. Le projet produira également des données fiables sur la distribution des molécules dans le cerveau et dans l’ensemble du corps, informations essentielles pour comprendre leur mode d’action et leur devenir dans l’organisme. Ces résultats renforceront la qualité des évaluations pharmacologiques et faciliteront la comparaison entre différentes molécules candidates. À plus long terme, les données générées constitueront une base scientifique solide et réutilisable, pouvant servir à l’identification de biomarqueurs diagnostiques ou à la préparation d’évaluations thérapeutiques ciblant des pathologies spécifiques. Grâce à la forte proximité biologique du primate non humain avec l’être humain, les résultats obtenus permettront une meilleure transposition vers la clinique, augmentant les chances que les avancées issues de ce projet se traduisent en bénéfices concrets pour la santé humaine. L’optimisation des stratégies de recherche contribue aussi à une utilisation plus raisonnée des ressources expérimentales, au bénéfice d’autres espèces et de l’environnement.

Procédures

Avant l’imagerie les animaux sont mis à jeun depuis la veille au soir pour un examen d’imagerie réalisé le matin. Après l’induction de l’anesthésie, trois cathéters sont posés, l’un sert à administrer l’anesthésie de manière continue pendant l’imagerie, l’autre à administrer les ligands, et le troisième pour effectuer des prélèvements sanguins. Le volume sanguin total prélevé et le nombre de prélèvements (maximum 30) correspondra à moins de 15% du volume circulant de l’animal. L’hébergement individuel est limité à la durée de décroissance du radioisotope (min 4h, max 72h.

Impact sur les animaux

Chaque séance d’imagerie sur le PNH est un acte qui peut générer plusieurs nuisances ou effets indésirables : - L’anesthésie peut induire une hypothermie et perte de poids transitoire de l’animal : les animaux sont thermorégulés avec un suivi de la température corporelle. Au réveil, les animaux sont nourris avec quelques fruits ou légumes en plus de leur ratio de croquettes. - L’anesthésie peut induire une déshydratation de l’animal. - Des prélèvements sanguins trop répétés peuvent induire une anémie chez le PNH: le taux d’hémoglobuline est mesuré régulièrement et une période de repos est accordée aux animaux entre les examens. - L’hébergement temporaire en zone TEP lors de la décroissance est un stress pour l’animal : cette période est réduite à la période de décroissance réglementaire. - L’introduction des cathéters peuvent induire des hématomes et douleurs associées.

Devenir

A l’issue de la procédure, après validation par le vétérinaire, les primates non humains peuvent être attribués à une nouvelle procédure.

Remplacement

Avant toute utilisation d’animaux, les radiotraceurs font l’objet d’une stratégie de développement progressive visant à privilégier les méthodes de remplacement. Des approches in silico (modélisation numérique) sont d’abord mises en œuvre afin de sélectionner les candidats les plus pertinents. Ces candidats sont ensuite évalués par des méthodes in vitro (tests de liaison, de spécificité, de stabilité et de métabolisme sur systèmes cellulaires ou biochimiques) et, lorsque cela est possible, par des approches ex vivo. Ces étapes permettent un remplacement partiel de l’expérimentation animale et conduisent à l’élimination précoce des radiotraceurs ne répondant pas aux critères requis. La validation in vivo chez le rongeur constitue une étape intermédiaire indispensable pour étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et le signal d’imagerie dans un organisme vivant. Toutefois, pour certains ligands à visée clinique, les données obtenues chez le rongeur ne permettent pas d’obtenir des résultats suffisants, notamment en raison de différences physiologiques, anatomiques et métaboliques limitant la transposabilité à l’homme. Dans ces situations spécifiques, l’évaluation chez le primate non humain devient nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions cliniques humaines. À ce stade du développement, il n’existe pas d’alternative complète permettant de reproduire de manière intégrée l’ensemble des paramètres requis (biodistribution, métabolisme, cinétique du radiotraceur, passage de barrières biologiques et signal d’imagerie). Ces phénomènes ne peuvent pas être modélisés de façon fiable par des méthodes in silico, in vitro ou ex vivo seules. Seuls les radiotraceurs pour lesquels l’ensemble des approches alternatives et des modèles de rongeurs s’est révélé insuffisant sont testés chez le primate non humain, ce qui permet de limiter strictement le nombre d’animaux utilisés. L’imagerie TEP, méthode non invasive, autorise par ailleurs des études longitudinales chez un même animal, contribuant au raffinement des procédures et à la réduction globale de l’utilisation d’animaux.

Réduction

L’imagerie TEP est une technique d’imagerie peu invasive, ce qui permet de répéter l’examen chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les examens d’imagerie étant très bien tolérés par les animaux, nous faisons le choix de réduire le nombre d’animaux dans cette demande d’autorisation de projet et d’augmenter les répétitions. Si certaines informations sont déjà connues dans la littérature, ces expériences ne seront pas répétées.

Raffinement

L’examen se déroule sous anesthésie générale. Une assistance respiratoire est appliquée en cas d’arrêt respiratoire. Pendant l’examen, les paramètres physiologiques, tels que le rythme cardiaque, la pression artérielle et la fréquence respiratoire sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur de l’anesthésie. Avant chaque protocole, le taux d’hémoglobine est mesuré pour chaque primate non humain au début, et pendant toute la durée de la procédure. Pendant les examens, les animaux sont hydratés. Des points limites ont été identifié conduisant à l’arrêt de l’imagerie, suivi par le réveil, et une phase de récupération puis reprise normale du protocole ou prolongement période de repos.

Choix des espèces

Le primate non humain permet par sa taille d’effectuer des prélèvements sanguins simultanément à l’acquisition des images TEP, contrairement au rongeur. Ce projet utilise des jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que : - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters. Chez l’homme, le prélèvement sanguin artériel demande une logistique hospitalière importante, et est difficile voire impossible à mettre en œuvre chez certains patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par la ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à celui de l’homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions chez les patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par le fait que les études pharmacologiques ne sont souvent pas autorisées chez l’homme, car les pharmaceutiques utilisés dans ces études ne disposent pas toujours d’une autorisation de mise sur marché (AMM). Jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que: - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires pour la mesure temporelle de la concentration sanguine du radioligand, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters.

8 800 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expériences portent sur des larves, dont 150 subissent l'ablation au laser des prolongements nerveux sortant de la glande pinéale, puis sont maintenues huit jours au maximum avant d'être tuées, l'anxiété induite étant évaluée en observant si elles se collent aux parois de leur boîte. L'objectif déclaré est de comprendre la synchronisation des horloges circadiennes, avec pour retombée annoncée une meilleure connaissance de la mélatonine, molécule largement consommée par les humains. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucune stratégie sans animaux n'est "malheureusement" disponible aujourd'hui pour étudier les réseaux neuronaux du comportement locomoteur.

Objectifs

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques gouvernant la mise en place et le fonctionnement du système nerveux central en utilisant le poisson zèbre comme organisme modèle. Nous procédons à des analyses histologiques sur des larves sauvages et transgéniques pour différents transgènes marqueurs de structures cérébrales. L’autre aspect de ce projet consiste en la réalisation de mesures d’activité locomotrice sur larves sauvages, mutantes ou enfin traitées avec un agent pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les mécanismes permettant la synchronisation des horloges circadiennes chez un animal diurne, le poisson zèbre. Il contribuera à une meilleure compréhension du fonctionnement de la mélatonine, une molécule largement consommée par la population humaine soit sous prescription ou sous forme de complément alimentaire.

Procédures

Un lot d'animaux (150 larves tests) sera soumis à une ablation des prolongements axonaux sortant de la pinéale par méthode au laser. Ces animaux seront ensuite conservés durant au maximum 8 jours avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucun des traitements n'induira de malformation ou létalité. Il est possible qu'une anxiété soit induite chez les larves traitées qui sera mesurée par thigmotaxie (rapport entre le temps passé au bord plutot qu'au centre de la boite).

Devenir

Toutes les larves utilisées seront mises à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L'étude des réseaux neuronaux sous tendant le comportement animal (locomotion) ne peut être effectué in silico, in vitro ou ex vivo en sorte qu'aucune stratégie de remplacement n'est malheureusement disponible aujourd'hui pour ce projet.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement au comportement des larves. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d’oeufs nécessaires à notre expérimentation. Pour obtenir des larves, ous utilisons des accouplements avec plusieurs mâles et femelles ce qui permet de diminuer le nombre d’expériences réalisées. Le fait d’analyser 96 larves simultanément et durant quatre jours permet de réduire le nombre de fondateurs nécessaires pour nos analyses. Les nombres de larves utilisées correspondent aux standards utilisés dans des études similaires pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes. Nous utilisons des stratégies génétiques (transgènes plutot que mutations) permettant de diminuer le nombre d'animaux utilisés au minimum possible.

Raffinement

Durant les procédures, les larves sont maintenues dans des conditions optimales de température (27 degrés). Nous utilisons une grille de scoring qui a été validée par l'établissement elle fait appel à des mesures de comportement effectuées durant les expériences et à des observations sur la morphologie des larves. En effet, les larves anxieuses ont tendance à recher la proximité des parois. Leur niveau d'anxiété peut donc être évalué de manière simple.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un animal diurne donc plus pertinent à étudier que les rongeurs pour les questions de rythme circadien. Les larves de poisson zèbre ont des rythmes locomoteurs très marqués, plus robustes que ceux des adultes. Un rythme locomoteur robuste est observé à 5 jours de développement. Nos analyses de locomotion démarrent donc à ce stade.

Opérés une première fois pour l'implantation d'un cathéter intraveineux, une seconde pour une chirurgie crânienne d'une heure, 520 rats enchaînent dix séances quotidiennes d'auto-administration de sucre de deux heures, puis dix séances de cocaïne de six heures. Suit une abstinence sous restriction alimentaire pouvant durer soixante-sept jours, en cage individuelle, l'isolement étant présenté comme le seul moyen de mesurer la consommation de chaque animal. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur ramène la restriction alimentaire à un "léger stress ou frustration alimentaire". Tous les rats seront tués pour le prélèvement de leur cerveau.

Objectifs

La consommation chronique de cocaïne est associée à des modifications du poids corporel et à des habitudes alimentaires déséquilibrées. Contrairement à l’idée d’une simple baisse de l’appétit, les personnes dépendantes consomment souvent une alimentation riche en calories mais pauvrement équilibrée, et ces perturbations persistent fréquemment après l’arrêt de la drogue. Cela suggère une altération durable des mécanismes cérébraux qui régulent la faim, les choix alimentaires et le plaisir lié à la nourriture. Ce projet a pour objectif d’étudier les effets à long terme de l’exposition chronique à la cocaïne sur le comportement alimentaire, la régulation énergétique et le poids corporel pendant une période d’abstinence. L’étude repose sur un modèle expérimental chez le rat, dans lequel les animaux s’auto-administrent de la cocaïne. Nous faisons l’hypothèse que la cocaïne induit des changements durables des préférences alimentaires et de l’attrait pour les aliments plaisants, notamment sucrés ou riches en énergie, pouvant conduire à une augmentation de la consommation alimentaire et à une prise de poids après l’arrêt de la drogue. Le projet vise également à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces perturbations, afin d’identifier des pistes thérapeutiques pour améliorer la régulation alimentaire après le sevrage.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes comportementaux et métaboliques qui lient la consommation chronique de cocaïne et la dérégulation du métabolisme énergétique, notamment la prise de poids et les altérations du comportement alimentaire observées après l’arrêt de la drogue. Ces recherches sont essentielles pour identifier les bases physiologiques des troubles observés chez les patients en rémission et ainsi anticiper de nouvelles approches thérapeutiques. En recourant au modèle animal, il est possible d’explorer finement les interactions entre circuits neuronaux, métabolisme énergétique et comportements alimentaires, ce qui ne peut être réalisé directement en clinique. Les connaissances obtenues contribueront à améliorer la prise en charge future des personnes dépendantes, en offrant des pistes concrètes pour limiter les complications métaboliques et favoriser un rétablissement durable.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale pour permettre l’étude de l’activité neuronale : 1 fois (1 heure par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections sous d’antalgiques par animaux - 10 sessions d’auto-administration de sucre (1 session / jour, 2 heures par session). - 10 sessions d’auto-administration de cocaïne ou injection de saline (1 session / jour, 6 heures par session). -2 Mesures maximum de l’activité neuronale (1 session / jour ; 1 heure / session) - Restriction alimentaire pendant 67 jours maximum - Prélèvements sanguins pour étude et suivi du métabolisme (6 prélèvements par animal)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, et douleurs post-opératoire minorée par des antalgiques -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience -Auto-administration de cocaïne : stress transitoire chez certains rats -Période d’abstinence : léger stress -Isolement : stress modéré mais nécessaire pour pouvoir évaluer la consommation alimentaire individuelle -Restriction alimentaire : léger stress ou frustration alimentaire, mais sans perte de poids significative -Prélèvements sanguins : inconfort transitoire, stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Ce type de recherche vise à comprendre les bases d'un processus psychobiologique et peut être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques de la prise alimentaire dans le cadre de l’addiction. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été soigneusement calculé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Les effectifs sont déterminés de manière à obtenir des résultats fiables, en tenant compte des différences naturelles entre les individus, sans recourir à un nombre excessif d’animaux. L’étude est organisée de façon progressive : chaque étape est analysée avant de passer à la suivante. Cette stratégie permet d’adapter le nombre d’animaux en fonction des résultats obtenus et d’éviter la réalisation de certaines procédures si elles ne sont pas nécessaires. Par exemple, certaines expériences ne seront pas menées si aucune différence n’est observée entre les groupes étudiés. Les animaux sont répartis de manière équilibrée entre mâles et femelles afin de limiter les répétitions inutiles et de maximiser les informations obtenues à partir d’un même effectif. Un petit nombre d’animaux supplémentaires est prévu uniquement pour compenser d’éventuelles pertes liées aux interventions chirurgicales ou techniques, afin d’éviter de relancer de nouvelles expériences. Au total, le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés est plafonné, mais le nombre réel devrait être nettement inférieur, grâce à cette approche graduée et conditionnelle. Cette organisation permet de garantir une utilisation raisonnée des animaux, conforme au principe de réduction, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Raffinement

Le bien-être animal est pris en compte à chaque étape du protocole, avec une attention particulière portée à la limitation du stress, de la douleur et de toute souffrance inutile. Une surveillance régulière de l’état de santé des animaux est assurée à l’aide d’une grille de suivi du bien-être, permettant d’identifier précocement l’atteinte éventuelle de points limites gradés (perte de poids, apparence générale, comportement). Ces points limites sont associés à une grille de score et à un arbre décisionnel définissant clairement les critères d’intervention et d’arrêt. Tout animal atteignant un point limite nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Les rats seront hébergés en cages ventilées, avec contrôle de la température et de l’humidité, et bénéficieront d’un enrichissement standard (objets à ronger). L’eau sera disponible ad libitum. Lorsque requis par le protocole, une restriction alimentaire limitée dans le temps sera mise en place et ajustée afin de maintenir un poids stable sans altérer l’état de santé des animaux. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation à l’animalerie d’au moins 10 jours, incluant une habituation progressive à la manipulation par l’expérimentateur. Les animaux soumis à une restriction alimentaire seront pesés au moins trois fois par semaine, tandis que les rats engagés dans les protocoles d’auto-administration seront pesés au minimum une fois par semaine, avec des pesées supplémentaires réalisées en cas de besoin. La manipulation quotidienne permet également une évaluation continue de l’état général des animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, complétée par une anesthésie locale, avec maintien de la température corporelle à l’aide d’un tapis chauffant. Une analgésie systématique sera administrée en pré- et post-opératoire pendant au moins 72 heures, associée à une surveillance clinique rigoureuse afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de complication.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne. Le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements addictifs reproductibles, ce qui n’est pas le cas d'autres espèces. Ceci en fait un modèle de choix pour étudier l’addiction et les rechutes. Dans cette étude, nous utiliserons des rats de 8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

Aux stades avancés de la maladie, les rats peuvent ne plus accéder à la nourriture ni à l'eau, et ceux dont l'état général se dégrade sont tués par anticipation. 30 rats porteurs d'une mutation du gène Mfn2, qui reproduit la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À six semaines, trois mois et cinq mois, ils passent une mesure de force d'agrippement, une analyse de la marche et un test du faisceau rétréci, de cinq à dix minutes chacun. Tous seront tués pour peser leurs muscles et mesurer les propriétés contractiles de muscles isolés, le projet ne visant pas à les soigner mais à repérer des paramètres de suivi utilisables dans de futurs essais thérapeutiques.

Objectifs

La neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2 (correspondant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A ou CMT2A) est une affection génétique du système nerveux périphérique caractérisée par une dégénérescence progressive des axones, entraînant des déficits moteurs et sensitifs prédominant aux extrémités des membres. Malgré une compréhension partielle des mécanismes physiopathologiques impliqués, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de caractériser de manière fonctionnelle les atteintes neuromusculaires dans un modèle de rat CMT2A, porteur de cette mutation. Cette étude vise à décrire l’installation et la progression des déficits moteurs et musculaires par une approche intégrée combinant des évaluations in vivo longitudinales et des analyses in vitro à des temps clés. Elle a pour finalité d’identifier des paramètres fonctionnels pertinents et robustes, en lien avec la physiopathologie de la maladie, pouvant servir de critères de suivi de la progression et d’outils d’évaluation dans un contexte de développement thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des atteintes neuromusculaires associées aux neuropathies périphériques axonales liées au gène Mfn2, en documentant leur installation et leur progression dans un modèle préclinique pertinent. L’identification de paramètres fonctionnels robustes et reproductibles contribuera à définir des critères objectifs de suivi de la maladie. Ces éléments constituent un prérequis essentiel au développement et à l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques, en facilitant la mise en place d’études précliniques et en renforçant la transposabilité des résultats vers la clinique.

Procédures

Au cours de la période de suivi, les animaux seront soumis à des tests non invasifs d’exploration fonctionnelle réalisés sur animaux vigiles, incluant des évaluations de la force musculaire, de la marche et de la coordination motrice. Chaque test a une durée comprise entre 5 et 10 minutes. Ces évaluations seront réalisées à trois reprises au cours du projet, aux âges de 6 semaines, 3 mois et 5 mois. En fin d’étude, les animaux seront soumis à une procédure terminale comprenant une anesthésie suivie d’une euthanasie conforme à la réglementation, puis à des prélèvements tissulaires (muscles squelettiques et cœur) réalisés après confirmation de la mort.

Impact sur les animaux

Les tests fonctionnels non invasifs (mesure de la force d’agrippement, analyse de la marche, test du faisceau rétréci) peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux et à leur isolement temporaire. La répétition des mesures au cours du suivi longitudinal peut également entraîner une fatigue passagère. L’évolution de la pathologie elle-même peut entraîner une altération progressive de l’état général, se traduisant notamment par des troubles locomoteurs, une diminution de la force musculaire et, potentiellement, des difficultés d’accès à la nourriture ou à l’eau aux stades avancés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure expérimentale afin de permettre la réalisation d’analyses terminales indispensables à la caractérisation du phénotype neuromusculaire. Ces analyses incluent notamment la mesure de la masse de différents muscles ainsi que l’étude des propriétés contractiles de muscles isolés, qui ne peuvent être réalisées que sur des tissus prélevés post-mortem.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini au strict minimum nécessaire pour garantir la validité scientifique des résultats, tout en respectant le principe de réduction. Sur la base de données issues de la littérature et d’expériences antérieures sur des modèles similaires, un effectif de 15 animaux par groupe a été retenu.Ce nombre est nécessaire pour mettre en évidence de manière fiable les différences attendues entre les animaux porteurs de la mutation et les animaux témoins sains. Afin de limiter la variabilité expérimentale, les groupes seront constitués d’animaux issus de plusieurs portées, avec inclusion d’animaux mutés et témoins issus des mêmes portées lorsque cela est possible. Cette stratégie permet de contrôler les effets liés à la portée tout en optimisant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, une approche longitudinale sera mise en œuvre, permettant le suivi répété des mêmes animaux au cours du temps, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, les différentes analyses (fonctionnelles in vivo et ex vivo) seront réalisées sur les mêmes individus afin de maximiser les informations obtenues par animal et d’éviter toute utilisation supplémentaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément à la réglementation en vigueur, avec un enrichissement du milieu adapté. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de détecter précocement tout signe de gêne, de douleur ou d’altération de l’état de santé, notamment en lien avec la progression de la pathologie (troubles locomoteurs). Des critères d’arrêt anticipé, définis à partir de grilles de suivi du bien-être animal et des recommandations en vigueur, seront appliqués. En cas d’apparition de signes cliniques sévères ou d’une dégradation importante de l’état général, le responsable de l’étude et le responsable de la structure de bien-être animal (SBEA) seront informés et une euthanasie sera réalisée sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les signes observés seront évalués en tenant compte de leur persistance et de leur impact sur l’état général de l’animal. L’ensemble des évaluations fonctionnelles, validées et non invasives, sera réalisé sur animaux vigiles. Afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux procédures expérimentales, les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation préalable à la salle d’expérimentation, aux dispositifs et à l’expérimentateur. Les tests seront réalisés dans un environnement dédié, distinct de la salle d’hébergement, et des mesures de renforcement positif (récompense après les essais) seront mises en place. L’organisation et la fréquence des tests seront optimisées afin de limiter la fatigue et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi. Les animaux seront suivis à partir du stade juvénile, dès le sevrage (3–4 semaines), et jusqu’à l’âge adulte (jusqu’à 5 mois). Les évaluations in vivo neuromusculaires seront réalisées à 6 semaines, 3 mois et 5 mois d’âge permettent ainsi de caractériser précocement les premiers signes fonctionnels, puis leur évolution au cours du temps.

300 animaux sur 3 990 pourront être gardés en vie et renvoyés en hébergement hors étude après avis vétérinaire, les autres seront tués pour le prélèvement d'organes et de fluides. 3 300 rats et 690 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets de candidats-médicaments commandés par des donneurs d'ordre. Certains reçoivent un cathéter intraveineux implanté à demeure sous anesthésie, portent une veste à capteurs jusqu'à dix-neuf heures, passent jusqu'à sept heures trente dans une enceinte respiratoire ou jusqu'à six heures dans une enceinte à diurèse sans eau ni nourriture, et subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par séance. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet de mesurer ces effets sur un "organisme entier" et revendique la "nécessité" d'accéder à l'animal dans son entièreté.

Objectifs

Les études de pharmacologie de sécurité chez les rongeurs visent à évaluer les effets d'un candidat-médicament en développement sur les grandes fonctions physiologiques et sont des prérequis réglementaires précliniques permettant à un donneur d’ordre d'initier des études cliniques pour un candidat-médicament destiné à l'Homme. Selon le candidat-médicament, l’établissement utilisateur évalue la procédure à effectuer, sachant que plusieurs procédures peuvent être combinées au sein d’une même étude (par exemple : étude combinant l’évaluation des fonctions respiratoire et neurologiques). Chaque animal est traité par un placebo ou une dose de candidat-médicament selon la voie d'administration prévue chez l'Homme. Les effets du candidat-médicament sont évalués sur une fonction physiologique données (neurologique, respiratoire, gastro-intestinale, rénale ou cardiovasculaire) à l'aide de capteurs et de logiciels enregistrant, en continu, le signal physiologique (fonctions respiratoire et cardiovasculaire), de tests spécifiques (fonctions neurologiques) ou de prélèvements d'organes/fluides biologiques (fonctions gastro-intestinale et rénale) effectués à un ou plusieurs temps après traitement, et dont l'analyse génère des valeurs quantitatives caractérisant la fonction étudiée. Les valeurs des paramètres mesurés à chaque dose de candidat-médicament sont ensuite comparées à celles mesurées en placebo et permettent ainsi d'évaluer l'impact du candidat-médicament sur la fonction étudiée. Pendant la durée de la procédure, de la réception des animaux à leur sortie d'étude, leur état de santé est suivi quotidiennement a minima, leur poids est mesuré périodiquement et l'atteinte de points limites est étroitement surveillée, avec prise de décision vétérinaire rapide et appropriée en cas d'altération du bien-être animal. Des dispositions, compatibles avec l'atteinte des objectifs de l'étude, sont prises pour limiter tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile, par l'utilisation d'habituation à l'environnement expérimental et aux dispositifs d'enregistrement des fonctions physiologiques, de protocoles anesthésiques et analgésiques appropriés, ou par décision vétérinaire d'appliquer des soins, de diminuer les doses de candidat-médicament ou d'arrêter le traitement. En fin de procédure, selon les prérequis du protocole d'étude, les animaux peuvent être gardé en vie ou euthanasiés.

Bénéfices attendus

L'évaluation des effets fonctionnels d'un candidat-médicament en développement par un donneur d'ordre dans les études de pharmacologie de sécurité chez le rongeur est conduite selon des recommandations ("lignes directrices") internationales, et constitue une étape réglementaire avant la conduite d'essais cliniques avec ce candidat-médicament chez des volontaires sains ou des patients. Ces études visent à définir le profil des effets pharmaco-toxicologiques de candidats-médicaments sur certaines fonctions physiologiques (incluant les fonctions vitales) qui surviennent généralement dans les heures à jours suivant leur administration. L'identification des fonctions modifiées par le candidat-médicament - s'il est considéré par le donneur d'ordre comme pouvant progresser dans les phases cliniques - permettra la mise en place de procédures de suivi de ces mêmes fonctions ("monitoring") chez l'Homme (ex.: mesure de l'électrocardiogramme, de la tension artérielle ou de la fréquence respiratoire; examens neurologiques) et donc, de rendre les essais cliniques plus sûrs pour les volontaires ou les patients y participant. En relation avec les données collectées dans les études de toxicologie réglementaire, celles issues des études de pharmacologie de sécurité permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Au final, ce projet contribuera au développement de nouvelles solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques sûres pour les patients. Il est envisagé que, sur une durée de 3 ans, entre 25 et 35 candidats-médicaments pourront être évalués.

Procédures

Ces études consistent généralement en une administration unique du candidat-médicament, pendant une durée de quelques secondes pour des administrations par les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse rapide, ou de quelques minutes pour les administrations par la voie intraveineuse dites en "bolus lent". Certaines administrations par voie intraveineuse peuvent également durer plusieurs dizaines de minutes à quelques heures, et nécessitent l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale gazeuse profonde et avec un protocole analgésique péri-opératoire adapté, d'un cathéter laissé en place de manière permanente dans une veine périphérique. Ce cathéter est relié à un dispositif externe de perfusion adapté aux rongeurs, permettant de connecter la seringue délivrant le candidat-médicament, tout en laissant l'animal libre de ses mouvements. Ce dispositif de perfusion intraveineuse est implanté sous anesthésie générale profonde, à une seule occasion, pendant la période d'acclimatation. Les administrations de candidats-médicaments sont suivies d’évaluation de leurs effets sur les paramètres neurologiques (évalués individuellement pendant un maximum de 15 minutes, à différentes heures après traitement), respiratoires (avec placement de chaque animal dans une enceinte dédiée jusqu'à 7,5 heures), urinaires (avec placement de chaque animal dans une enceinte à diurèse jusqu'à 6 heures). Les animaux dont la fonction cardiovasculaire est évaluée portent une veste avec capteurs intégrés jusqu'à 19 heures. Si requis par le protocole d'étude, un ou plusieurs prélèvements sanguins seront effectués, par ponction d'une veine superficielle chez l'animal vigile, suivant des modalités et un nombre définis par les besoins de l'étude (jusqu'à 2 occasions par étude, avec un maximum de 8 prélèvements par occasion), tout en respectant les recommandations éthiques de l'établissement utilisateur. Si le protocole d'étude requiert un prélèvement sanguin unique d'un volume dépassant ces recommandations, ce prélèvement est effectué chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié. Si requis par le protocole d'étude, une ponction de liquide céphalo rachidien unique est effectuée chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent inclure (variables selon les individus) : Stress, inconfort ou douleur brève (quelques minutes) lors des administrations, prélèvements sanguins ou euthanasie au gaz carbonique. Les injections intraveineuses lentes peuvent nécessiter une contention en tube, après une période d'habituation. Sensation de chaleur et stress lors du placement en enceinte chauffante utilisée pour prélèvements de sang ou injections intraveineuses ne nécessitant pas de pose de cathéter à demeure. Anesthésie de quelques minutes - avec risque d’incoordination motrice au réveil - , pour prélèvements de sang ou autres fluides biologiques. Anesthésie suivie d’une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la pose de cathéters intraveineux à demeure. Port d’un harnais ou d’un bouton métallique permettant la perfusion prolongée par voie intraveineuse sans contention, pouvant provoquer gêne à l'ambulation et au toilettage, grattage et/ou frottements. Connexion à un dispositif de "joint tournant" lors des perfusions intraveineuses de 30 min à 24 heures/jour, pouvant limiter les déplacements dans la cage d'hébergement. Restriction d’espace et absence d’aliment (eau disponible) dans l'enceinte dédiée aux mesures respiratoires jusqu’à 7,5 heures. Restriction d’espace sans accès à l’eau ni à l’aliment dans les enceintes pour collectes urinaires (jusqu’à 6 heures) ou les arènes d’observations comportementales (jusqu’à 10 min). Stress lié à l’hébergement individuel, notamment chez les souris mâles et les animaux porteurs de dispositifs de perfusion intraveineuse implantés à demeure. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés des candidats-médicaments.

Devenir

Si le protocole d'étude prévoit des prélèvements de tissus et d'organes pour analyses métaboliques, de biologie moléculaire, d'évaluations histopathologiques ou de prélèvements terminaux de fluides biologiques, une fraction ou la totalité des animaux nécessaire à ces analyses sera euthanasiée. Si le protocole d'étude ne prévoit pas de prélèvements nécessitant l'euthanasie des animaux, ceux-ci pourront être gardé en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la nature et l'amplitude des effets pharmacologiques de candidats-médicaments sur un organisme entier. Dans les études de pharmacologie de sécurité visant essentiellement à évaluer les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques interdépendantes (en particulier, les fonctions vitales (neurologique, respiratoire et cardiovasculaire), il est nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices édictées dans des recommandations réglementaires internationales.

Réduction

Lorsque la pharmacocinétique et/ou le mécanisme d'action du candidat-médicament le permet, les mêmes animaux peuvent être utilisés dans une même étude, dans le but d'évaluer, soit simultanément, soit séquentiellement, plusieurs fonctions physiologiques. Dans le cadre d'application de procédures de manière séquentielles, l'inclusion des animaux dans la seconde procédure suivant la première sera effectuée après un temps d'élimination du candidat-médicament de l'organisme suite à l'administration au cours de la première procédure, et après un examen clinique confirmant la capacité des animaux inclus dans la première procédure, à être inclus dans la seconde. Si l'étude requiert des prélèvements sanguins sur animal vigile et que la méthode analytique le permet, des microprélèvements de quelques dizaines de microlitres seront effectués chez les animaux en exploration fonctionnelle, évitant ainsi l'utilisation d'animaux satellites. S'il n'est pas attendu de différences pharmacologiques ou pharmacocinétiques notable entre mâles et femelles, et sauf avis contraire du protocole d'étude, ou justification d'une indication thérapeutique limitée à un seul sexe chez l'Homme, les études de pharmacologie de sécurité sont effectuées chez des mâles.

Raffinement

Rats mâles et femelles et souris femelles sont hébergés en groupes sociaux (sauf incompatibilité comportementale ou avec la procédure expérimentale) en cage sur litière, avec enrichissement adapté, augmenté en cas d’hébergement individuel. Les techniques limitant stress et inconfort seront privilégiées; les actes pouvant les engendrer seront réduits en nombre et durée au minimum nécessaire et réalisés sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Les rongeurs sont observés au moins une fois par jour pour rapidement détecter des signes cliniques et limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas d'atteinte du bien-être, un vétérinaire prendra des mesures rapides et appropriées (soins, arrêt momentané ou définitif du traitement…). Le stress de la manipulation est réduit par la procédure de gestion de faible stress. Etudes d'évaluation de la respiration par pléthysmographie: une habituation à l'enceinte de mesure en Plexiglas transparent (permettant aux animaux de voir et d'entendre leurs congénères et leur environnement) est effectuée par placement des animaux pendant 1 à 2 heures avant traitement (et en période de prétraitement, si requis au protocole d'étude). Etudes d'évaluation cardiovasculaire par veste connectée: en prétraitement, un fragment du tissu de la veste est déposé dans la cage d'hébergement pendant au moins 24 heures, puis les rats sont équipés de la veste seule (sans capteurs) jusqu'à 5 heures. Administration IV lente > 5 minutes: l'habituation au tube de contention est faite au moins 2 fois avant le premier traitement. Administration par voie orale et prélèvement sanguin en veine jugulaire chez rongeurs âgés ou peu manipulés: l'habituation à la manipulation est mise en place avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Si compatibles avec les objectifs de l'étude, des microprélèvements sanguins seront effectués, limitant ainsi le stress et facilitant la récupération. Le design de chaque étude sera détaillé dans le protocole d’étude et une évaluation éthique sera réalisée avant le démarrage. Le pH et l'osmolarité seront mesurés (ou communiqués par le donneur d'ordre) avant toute première administration par voie parentérale. Enfin, les volumes d'administration et de prélèvement de sang ont été établis selon des recommandations internes, elles-mêmes basées sur des recommandations éthiques (Diehl et al. (2001); J. Appl. Toxicol.).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animale dans les études visant à étudier les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques est basé sur les recommandations réglementaires édictées dans des lignes directrices internationales, les informations concernant la distribution et l'élimination des candidats-médicaments dans l'organisme, leur mécanisme d'action après liaison à leur cible biologique, les données de la bibliographie scientifique, et les analogies des fonctions physiologiques entre l’animal et l'Homme. Selon les fonctions physiologiques susceptibles d'être modifiées par le candidat-médicament et de la population concernée par celui-ci, l’âge le plus adéquat sera sélectionné, cet âge pouvant varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge de maturité sexuelle. Ce choix de l'âge répond à l’ensemble des études réglementaires conduites chez l'animal et nécessaires à la conduite des essais cliniques avec un candidat-médicament chez l’Homme.