Système nerveux
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Création et caractérisation d’un modèle de souris pour l’étude d’un syndrome de retard mental d’origine génétique EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 322 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La création de la lignée passe par deux générations d'accouplements, une biopsie d'identification sur chaque animal, une chirurgie de trente minutes sur quatorze femelles gestantes, et une chirurgie sans réveil sur jusqu'à 140 souriceaux pour préparer des tissus. Le porteur reconnaît ne pas savoir quelles atteintes attendre puisque la lignée n'existe pas encore, et avance comme hypothèses la mortalité embryonnaire ou périnatale, le retard de croissance et l'hydrocéphalie, l'électroporation des embryons pouvant à elle seule en tuer un dixième. Aucun calcul de puissance n'était possible pour la même raison, et le porteur conclut qu'un modèle murin est "nécessaire" pour compléter des expériences déjà menées en culture cellulaire et in silico.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Les TNDs sont très fortement influencées par la génétique, mais plusieurs centaines de gènes de prédisposition ont été identifiés, ce qui rend indispensable la compréhension de la fonction de ces gènes pour trouver les dénominateurs communs expliquant la symptomatologie et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet a pour finalité de créer des modèles de souris pour étudier une maladie causée par la mutation d'un gène qui a jusqu'à présent quasi exclusivement été étudié dans le contexte de son rôle dans la progression tumorale. Les fonctions de ce gène dans le développement du système nerveux et musculaire sont pour l’heure quasiment inconnues. L'objectif est de caractériser les fonctions de ce gène dans les neurones et les muscles pour comprendre la pathologie humaine. Pour cela, en collaboration avec une équipe américaine, nous allons générer une lignée de souris dite KO spécifique (uniquement dans les neurones) et caractériser cette lignée. Nous utiliserons également des souris pour des études cellulaires et pour des procédures chirurgicales pour étudier la connectivité cérébrale. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) où auront lieu respectivement l'élevage et la production des animaux, et le prélèvement de tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les causes du syndrome de retard mental en identifiant les fonctions du gène d'intérêt de l'étude, fonctions qui sont pour l’instant inconnues. Ces données permettront de mieux comprendre l’évolution de la maladie et d’améliorer le conseil génétique fourni aux familles de patients. Grâce au contact avec une association de patients, les connaissances issues de ce projet bénéficieront directement aux patients. De façon plus large, ce projet permettra de mieux comprendre les bases du développement cérébral et fournira des hypothèses pour d’autres maladies (retard mental etc...) causées par des mutations dans des gènes proches du gène d'intérêt.
Procédures
Le projet comprend la création d'une nouvelle lignée qui implique des accouplements pour créer les animaux (2 générations), puis des accouplements réguliers pour produire les animaux (nombre variable, étalé sur la durée du projet). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour des observations non invasives et pesées. Des animaux seront mis à mort pour du prélèvement de tissus. Des animaux (14 femelles au maximum) subiront une procédure chirurgicale, d'une durée de 30 minutes, une fois pendant le projet. Des animaux (140 souriceaux au maximum) subiront une procédure chirurgicale sans réveil pour la préparation de tissus pour l'histologie.
Impact sur les animaux
S’agissant de la création d’une nouvelle lignée, les nuisances sont inconnues. Sur la base de ce qui est connu du syndrome de retard mental chez l’homme, nous pouvons émettre l’hypothèse que les nuisances ci-après peuvent survenir : mortalité embryonnaire ou périnatale, retard de croissance, hydrocéphalie. Ces nuisances peuvent entraîner du stress lié à la compétition avec le reste de la portée pour l’accès à la nourriture. Les animaux subiront une biopsie dans le but de leur identification, qui entraîne une douleur temporaire. Les animaux seront manipulés régulièrement pour le suivi de la lignée et les accouplements, entraînant un stress léger. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une dystocie. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. La chirurgie peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). Dans l'EU1, les animaux seront produits et manipulés. Au moment de la mise à mort, les animaux seront transférés dans l'EU2, dont les locaux sont situés à un autre étage du même bâtiment (durée de transport 2 minutes).
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées et nous prédisons un phénotype dommageable. Nous ne pouvons donc pas replacer les animaux à l'issue de l'étude.
Remplacement
Ce projet est consécutif à des expériences in vitro du gène d'intérêt qui ont démontré son importance pour le développement des neurones. Les données in silico (études transcriptomiques) et les données de la littérature ont été croisées avec les données de patients. Il est à présent nécessaire de confirmer les fonctions de ce gène dans le développement cérébral en générant un modèle animal, qui permettra de reproduire les atteintes retrouvées chez les patients souffrant du syndrome. Ce modèle permettra à terme de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social. Par ailleurs, l’architecture cérébrale (développement et connectivité des neurones corticaux) ne peut pas être complètement reproduite à l’aide des cultures d’organoides, qui ne permettent notamment pas d’étudier la connectivité cérébrale. Par conséquent, la création d’un modèle murin est nécessaire pour compléter les études in vitro déjà réalisées.
Réduction
Ce projet vise à créer une nouvelle lignée, par conséquent il n'est pas possible de savoir à quoi s'attendre et de faire un test de puissance statistique préalable. Pour calculer un nombre d’animaux à inclure dans le projet, des hypothèses réalistes ont été émises sur la base notamment de l'expérience préalable avec d’autres lignées. Les calculs ont été optimisés pour utiliser le moins d'animaux possibles et maximiser les informations revueillies. Selon les données collectées, nous comparerons des proportions (génotypes), ou nous comparerons des valeurs moyennes (poids en fonction de l’âge), à l'aide de tests statistiques adaptés. Concernant la génération d’animaux en vue du prélèvement de tissus, le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir une quantité suffisante de tissus pour conduire les expériences tout au long du projet, sans avoir d’animaux surnuméraires. Pour certaines expériences, les souriceaux seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental et de ne pas réaliser de procédure inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. Les points limites sont basés sur les phénotypes attendus d’après la pathologie chez les patients, afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, l’équipe de recherche utilise des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information concernant les patterns de connectivité corticale. Le transport des souriceaux entre établissements utilisateurs est rapide puisque les deux sont situés dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport et mis dans un sac opaque, amenés dans l’EU2 (transport 2 minutes), où la mise à mort sera réalisée immédiatement afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Choix des espèces
La souris présente les avantages suivants : - un cerveau comparable au cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation du cortex cérébral, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - Une petite taille adaptée à des préparations histologiques, - la possibilité de modifier l’expression de gènes par croisement de lignées transgéniques déjà existantes. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique, et selon les phénotypes exprimés : jour embryonnaire E15.5 , jour postnatal P1, jour postnatal P10-P12, au moment du sevrage , et au jour P45 ou au-delà. Pour les expériences de culture de cellules musculaires, les animaux seront utilisés entre le jour postnatal P4 et P7.
Évaluation thérapeutique du blocage des récepteurs de chimiokines sur la douleur cornéenne chronique dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La cornée abrasée sous anesthésie puis exposée à des molécules inflammatoires, ou les glandes lacrymales retirées en quinze minutes de chirurgie : 1 600 souris mâles subissent l'un de ces deux modèles de douleur oculaire. Toutes sont tuées pour prélèvements et analyses post-mortem, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 un niveau léger. Le porteur attend les mêmes sensations que chez les patients humains, picotements, démangeaisons, brûlures, impression de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière, et fait passer aux souris des tests de sensibilité cornéenne sur animal éveillé, une à quatre fois selon le modèle. L'effectif de 1 600 est présenté comme le fruit d'un calcul de puissance, sans que le nombre de groupes ni la répartition entre les deux modèles ne soient donnés, et rien n'indique combien de souris subissent l'ablation des glandes lacrymales.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous-jacents. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués est un des enjeux cruciaux pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice de ce projet est d’aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués, principalement inflammatoires et neurogènes, qui sont des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire.
Procédures
Deux modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle de douleur inflammatoire est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois -10 minutes) associé à l’instillation de molécule inflammatoires le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, d’imagerie de la cornée, avant, durant et après la mise en place des modèles mimant ces douleurs. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. Ils seront réalisés 2 fois chez les souris modèles de douleur inflammatoire, 4 fois chez les souris modèles de sécheresse oculaire. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile (pas d’anesthésie), durée du test : 1 minutes/session - Imagerie de la cornée par biomicroscopie : animal anesthésié, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3 minutes. - Imagerie de la cornée par imagerie confocale in vivo : animal anesthésié, durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une immobilisation complète de l’animal et qui seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie en vue des différents prélèvements pour analyses.
Impact sur les animaux
Des contentions de courtes durées et les injections sur animal vigile nécessaires aux anesthésies pourront être sources de stress ou d’inconfort pour l’animal. Les nuisances attendues dans les modèles de sécheresse oculaire sont celles observées chez l’Homme à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.
Remplacement
À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui est liée. La complexité et l’interaction du circuit mis en jeu (cornée, ganglions trigéminés et cerveau) et activité du système immunitaire inné ne peuvent également être étudiés et remplacés par un modèle vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiologiques mis en jeu dans cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1600 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux,) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ces effectifs ont été établis grâce à une calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à température règlementaire et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d'euthanasier l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Les tests d’imageries qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.
Choix des espèces
Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Ce projet nécessite l’utilisation de souris mâles adultes sauvages C57BL/6J, de souris mâles adultes issus des lignées transgéniques. Ces animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7 semaines (poids environs 20-25g) afin de respecter une semaine d’acclimatation et seront utilisés à l’âge de 8 semaines (âge de la maturité sexuel). Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 3 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 19 semaines en sortie de procédure.
Comparaison de trois méthodes d’administration d’une molécule permettant d’induire l’expression de modifications génétiques ciblées dans le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'âge de deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie d'oreille entre douze et quinze jours, puis une injection quotidienne pendant cinq jours, le porteur indiquant que le produit injecté peut provoquer une inflammation et que les points d'injection sont changés d'un jour sur l'autre. À deux mois, elles sont profondément anesthésiées pour une perfusion intracardiaque, tuées, puis leur cerveau est prélevé et leur corps disséqué pour repérer les effets secondaires aux sites d'injection. Comparer trois voies d'administration afin de retenir la moins traumatisante est présenté comme un raffinement, et le porteur écrit que l'usage d'animaux vivants y est "incontournable".
Objectifs
Les lignées de souris génétiquement modifiées constituent des modèles précieux pour comprendre le fonctionnement du cerveau chez les mammifères. Dans certaines de ces lignées, il est possible de choisir le stade de développement à partir duquel une modification génétique sera exprimée dans le cerveau. Ces modèles inductibles sont très utiles, par exemple pour modéliser des pathologies qui surviennent chez l'adulte, alors que le cerveau n'a pas eu de problème particulier au cours du développement. En pratique, l'induction de l'expression d'une mutation à un moment donné est souvent réalisée par injection d'un produit dans le ventre des souris. Plusieurs études ont montré que cette voie d'administration pouvait occasionner des dommages dans l'abdomen des souris. Récemment, plusieurs équipes ont testé l'administration de la même molécule par la voie sous-cutanée, a priori moins invasive. Des résultats très probants ont été obtenus pour induire l'expression de modifications génétiques dans divers organes tels que le foie, le rein et l'intestin. De plus, une équipe a également rapporté l'efficacité de l'administration de la même molécule par voie orale (ingestion spontanée par la souris d'un liquide présenté goutte à goutte). Dans un objectif de raffinement de nos pratiques expérimentales, nous souhaiterions tester les voies orale et sous-cutanée sur nos modèles. Cependant, il n'est pas démontré si ces voies administration sont efficaces pour induire l'expression de modifications génétiques spécifiquement dans le cerveau. Le cerveau est un organe très protégé de la circulation sanguine. Cette protection est utile contre les agressions (maladies notamment), mais elle pose souvent problème quand il s'agit de faire entrer des médicaments dans le cerveau. De fait, l'induction de l'expression de modifications génétiques à partir d'un moment choisi est beaucoup moins efficace dans le cerveau que dans les autres organes. Pour cette raison, il est primordial de vérifier que le choix de la voie sous-cutanée ou de la voie orale ne réduira pas l'efficacité de l'induction. Notre projet est donc de tester l'efficacité de ces deux voies d'administration pour induire l'expression d'une modification génétique dans le cerveau chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu concerne le raffinement des méthodes expérimentales : si les injections sous-cutanées ou l'administration par voie orale s'avèrent aussi efficaces et moins traumatisantes que les injections dans l'abdomen pour induire l'expression de mutations conditionnelles dans le cerveau, la méthode la moins traumatisante sera adoptée immédiatement par notre équipe. Les résultats seront divulgués à toute la communauté scientifique utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier le cerveau.
Procédures
Une biopsie d'oreille sera réalisée entre 12 et 15 jours d'âge dans le but de réaliser des analyses génétiques. Entre 21 et 25 jours d'âge, certaines souris recevront une injection chaque jour (durée de chaque injection < 10 secondes). A l'âge de deux mois, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.
Impact sur les animaux
La biopsie d'oreille induit une douleur temporaire. La contention des animaux pour l'administration des traitements entraîne un stress temporaire. Les injections répétées quotidiennement pendant 5 jours induisent une douleur temporaire au point d'injection. De plus, le produit injecté est susceptible d'induire une inflammation.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les souris de ce projet, car nous devrons prélever le cerveau pour pouvoir évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression de la modification génétique souhaitée. De plus, les corps des souris ayant reçu des injections seront disséqués pour évaluer les effets secondaires potentiels au niveau des sites d'injection (sous la peau et dans l'abdomen).
Remplacement
L'objectif de cette étude étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection, il n'est pas envisageable d'utiliser une méthode alternative. L'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour répondre à la question.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en fonction de notre connaissance du modèle, en tenant compte de la probabilité de transmission d'un transgène d'une génération à la suivante, ainsi que du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou problème lors des analyses post mortem). De plus, nous avons choisi la lignée de souris de manière à ce qu'une partie du matériel biologique collecté dans ce projet puisse être utilisé pour compléter une étude en cours dans le cadre d'un projet précédemment autorisé. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée de l'étude. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. La formulation du produit injecté aux souris a été récemment améliorée pour éviter tout dommage sur les souris. Afin de limiter la douleur, les points d'injection seront changés d'un jour sur l'autre, pour la série de 5 injections quotidiennes. A la fin de l'étude, les souris recevront un antalgique et seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée à la perfusion intracardiaque du produit permettant une bonne conservation du cerveau.
Choix des espèces
L'objectif du projet étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection d'un produit, il ne serait pas pertinent de réaliser cette étude sur une autre espèce. Les souris seront incluses dans ce protocole dès l'âge de 7 jours, car il sera nécessaire de connaître leur génotype précocément. Le produit permettant d'induire l'expression d'une modification génétique sera administré pendant la 4ème semaine d'âge et les souris seront mises à mort à l'âge de 2 mois, lorsque le cerveau aura acquis ses caractéristiques adultes, car les travaux que nous menons actuellement portent sur le développement du cerveau après la 3ème semaine de vie.
Rôles de l’interleukine-1beta (IL-1β) en conditions physiopathologiques.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Perte de poids continue, prostration, poils ébouriffés, arrêt de l'alimentation : ces seuils déclenchent la mise à mort des souris qui les atteignent. 8 704 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélever leurs organes, 3 456 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 5 248 un niveau modéré. Elles reçoivent des injections, subissent des chirurgies d'environ quarante minutes, passent une demi-heure en imagerie et enchaînent des tests comportementaux quotidiens de cinq minutes pendant une semaine, certains composés provoquant des crises de type épileptique que le porteur décrit comme douloureuses. Dans la partie du projet consacrée à l'inflammation, il écrit qu'il n'est pas possible d'administrer des analgésiques sans modifier les résultats expérimentaux.
Objectifs
I'interleukine (IL1) est une molécule essentielle dans l’initiation de l’inflammation suite à une infection ou une lésion. Cette molécule est en outre impliquée dans le développement de nombreuses pathologies comme l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type 2 et contribue au développement de maladies de type auto-inflammatoire. De nombreuses études suggèrent également que cette molécule modulerait de nombreux processus physiologiques ou pathologiques comme la mémoire ou la douleur. Cependant, en l’absence d’outils pertinents permettant d’étudier cette cytokine dans le temps et dans l’espace, les rôles précis de l'IL1 secrétée par différents types cellulaires selon le contexte physiopathologique ne sont pas connus ou controversés. Notre équipe a récemment développé un modèle de souris exprimant un capteur de l’IL1 qui émet de la lumière. Cette souris ‘2 en 1’ permet 1/soit de visualiser chez l’animal de façon spatiale et temporelle la production d’IL1 par mesure de la luminescence, 2/ soit d’inactiver spécifiquement la synthèse de l’IL1 dans un type cellulaire donné. Basé sur ce modèle murin innovant, ce projet a pour but de déterminer précisément le rôle de l’IL1 et les voies de signalisation cellulaire gouvernant sa libération, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. A terme, ce projet devrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de différentes pathologies impliquant l’IL1. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices espérés du projet sont multiples : Il est attendu une meilleure compréhension du rôle de l’ IL1 dans divers contextes physiopatholoqiues et ainsi proposer de nouvelles pistes therapeutiques ciblant l’inflammation. Plus précisément, grâce à l’utilisation d’animaux exprimant un capteur de l’ IL1, nous pourrons définir précisément la provenance de cette molécule et la signalisation cellulaire associée à sa libération. De plus, l’invalidation génique de l’IL1 dans un type cellulaire donné nous permettra d’évaluer spécifiquement la contribution de l’ IL1 dans le développement de l’inflammation, des douleurs associées et des comorbidités anxio-dépressives.
Procédures
L'ensemble des animaux recevront des injections, des chirurgies et feront des tests comportementaux. Dans l'EU1, les expériences d'injection, de chirurgies et de tests comportementaux seront réalisés. Dans l'EU2, l'imagerie des animaux sera réalisée ainsi que des injections. Les tests comportementaux permettront de déterminer les troubles des fonctions motrices et cérébrales. Les animaux seront gardés en vie deux mois, le reste des animaux sera gardé en vie au maximum 15 jours après l'induction de l'inflammation. Les test comportementaux ont une durée de 5 minutes quotidiennes, pendant une semaine. Les chirurgies ont une durée d'environ 40 minutes. L'imagerie des animaux dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Des douleurs légères des injections par piqure, des douleurs à prendre en charge pendant et après des chirurgies. Des composés vont induire des crises de type épilepsie qui sont douloureuses pour les animaux. Les tests de comportement vont induire un stress modéré dans certaines conditions.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur l’utilisation d’un modèle murin unique et innovant permettant de suivre précisément dans le temps et dans tout l’organisme l’expression d’une molécule pro-inflammatoire. Il permettra également de ne plus avoir l'expression, spécifiquement dans un type cellulaire donné, de cette interleukine afin de definir de nouvelles pistes therapeutiques. Il n’est donc pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. Enfin, notre projet s’appuie sur différents tests comportementaux chez l’animal ainsi que l’obtention d’organes pour en étudier les caractéristiques histologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinents. L’avantage de notre souris exprimant le capteur de l’IL1 est la réutilisation possible d’un même animal pour un suivi longitudinal, notamment lors de la mesure de bioluminescence in vivo à différents temps, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans les mécanismes inflammatoires. Les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Les tests comportementaux et l’analyse des tissus seront effectués sur les mêmes animaux afin d‘en réduire le nombre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation du logiciel G Power (ver 3.4.10) approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La taille de chacun des lots d’animaux à générer pour ce projet a été calculée sur la base de tests paramétriques permettant de détecter une différence significative sur la base d’un risque d’erreur α fixé à 5% et une puissance de 0.80.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive; prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement (adminstration d’antalgiques ou analgesiques) s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l'euthanasie de l’animal. Dans la partie de notre projet s’intéressant à l’inflammation dans différents contextes inflammatoires, il n’est pas possible d’utiliser des analgésiques ou des antalgiques afin de ne pas modifier les résultats expérimentaux. Pour le transport des animaux, nous suivrons la procédure validée par le réseau des animaleries de Montpellier, après demande d'autorisation auprès du vétérinaire et de la direction départementale de la protection des populations. Nous ajoutons à la litière des frisottis et/ou des buchettes en bois, des aliments et du gel hydrique.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu dans la caractérisation des mécanismes sous-tendant l’inflammation. Ce modèle permet également l'utilisation de souris invalidées pour nos cibles d'intérêt ou exprimant des biosenseurs, ce qui permet de facilement considérer les rôles et fonctions de différentes protéines. De plus, les études précédentes de référence ont été réalisées sur des souris, ce qui permet de se baser et de comparer directement les résultats qui seront obtenus Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 2 et 6 mois), ce qui permet de s’affranchir des effets développementaux et de senescence.
Caractérisation du mécanisme pathologique des synucléinopathies par microscopie à fluorescence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
968 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 744 tuées sous anesthésie sans jamais se réveiller pour prélever des tissus destinés aux cultures de neurones et aux coupes de cerveau, et 224 soumises à un génotypage et à un tatouage à l'âge de sept jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les cultures sont préparées à partir d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à dix jours, pour suivre au microscope l'agrégation d'une protéine rendue fluorescente. Une vingtaine de souris seront replacées en élevage pour préserver la lignée dans un projet suivant, le reste étant tué à la fin du projet. Le porteur présente la culture de cellules neuronales comme un modèle qui "remplace les expériences sur des animaux vivants", tout en précisant que cette culture exige le maintien d'une colonie de souris et le prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Dans plusieurs maladies dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la démence à corps de Lewy, des agrégats d’une protéine appelée synucléine entrainent la mort des cellules neuronales du cerveau. La perte de ces cellules est responsable des symptômes que l’on observe chez les patients aux stades avancés de la maladie. Pour trouver un éventuel traitement il est essentiel de comprendre les premières étapes de ces maladies qui se produisent souvent plusieurs années avant les symptômes cliniques. Par contre, la plupart des recherches précédentes sur la maladie de Parkinson a étudié la formation d’agrégats dans des tubes à essai ou en utilisant des modèles expérimentaux très simples tels que les cellules de levure. Pour arriver à comprendre la maladie dans l’homme, il est pourtant nécessaire d’utiliser un modèle expérimental adapté, tel que le cerveaux de souris. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la formation des agrégats des protéines dans des cultures de cellules neuronales de souris. Le projet devrait ainsi permettre de mieux comprendre la mort des cellules du cerveau dans la maladie de Parkinson et d'autres maladies dégénératives, et d'apporter des nouvelles pistes pour un traitement.
Bénéfices attendus
Pour ce projet, nous avons développé un nouveau modèle de souris dans lequel la protéine synucléine est fluorescente. Ceci permet de suivre son agrégation dans les cellules et tissus neuronaux à l'aide de la microscopie à fluorescence de pointe. Deux séries d’expériences sont prévues. Premièrement, nous allons cultiver des cellules neuronales prélevées des embryons, ce qui nous permet de regarder les cellules sous un microscope et de tester différents traitements pharmacologiques. Deuxièmement, nous allons étudier la présence de la synucléine dans des coupes de cerveau, pour identifier les régions du cerveau les plus affectés par la maladie. Ainsi, le projet ouvre des nouvelles pistes pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie de Parkinson et d'autres maladies similaires. De plus, le modèle développé dans le cadre de ce projet représente un système expérimental puissant dans lesquels des approches thérapeutiques peuvent être testées, par exemple en utilisant des substances qui empêchent l'agrégation des protéines.
Procédures
En total 224 souris seront génotypés pour le maintien de la lignée et la sélection des animaux pour l’expérimentation. Cette procédure consiste à prélever un échantillon de tissu pour l’analyse de l’ADN des souris âgées de sept jours qui sont identifiées par tatouage réalisé en même temps. Pour les deux gestes, les souris sont tenues pendant environ 20 secondes, au cours desquelles un échantillon est prélevé (1 seconde) et le doigt tatoué (3 secondes), avant d'être replacées dans la cage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement et le tatouage pour le génotypage sont des gestes rapides (dégrée de sévérité légère), réalisés uniquement sur certains animaux. Une légère contusion et stress associé peuvent se produire lorsque l’animal est tenu pendant cette procédure.
Devenir
Les animaux génotypés sont principalement utilisés pour des prélèvements de tissu pour l’expérimentation (cultures neuronales, immunohistochimie). Ils seront euthanasiés par une technique légale selon leur âge avant le prélèvement. Les souris génotypés qui ne sont pas utilisés dans des expériences seront euthanasiés à la fin du projet, sauf une vingtaine de souris qui pourront être replacés en élevage pour la préservation de la lignée dans le cadre d’un nouveau projet.
Remplacement
La majorité des expériences seront réalisées dans des cellules neuronales en culture ou des prélèvements de tissu. Ce modèle remplace les expériences sur des animaux vivants. Étant donné que la synucléine est fortement exprimée dans des cellules neuronales, d'autres modèles expérimentaux ne peuvent pas substituer l'utilisation du modèle animal. Cependant, la mise en culture des neurones implique le maintien d’une colonie de souris ainsi que le prélèvement de tissu après l’euthanasie des animaux.
Réduction
La lignée de souris qui contient la protéine synucléine fluorescente sera maintenue dans une forme pure (dite homozygote) dans la mesure du possible, permettant de réduire de plus de la moitié le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant de données expérimentales. Les expériences préliminaires pour la mise au point des techniques d'imagerie seront réalisées sur d'autres modèles cellulaires établis afin de réduire l'utilisation d'animaux le plus possible.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de température et humidité contrôlées. Elles ont accès libre à la nourriture et l'eau. Au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant la première semaine et leur consommation est vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu dont la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont régulièrement surveillés, en tenant compte de leur comportement (pas de difficulté de déplacement, isolation, signes de stress) et de l'absence de blessures.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour étudier les pathologies du cerveau, et largement utilisé dans la recherche biomédicale. Un marquage par fluorescence permet la visualisation de ces processus sous le microscope, ce qui demande la préparation des cultures neuronales à partir de tissu prélevé d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à un âge de 10 jours. A ce stade de développement les cellules neuronales prélevés peuvent être mis en culture, ce qui permet de faire des expériences dans des cellules vivantes. L'analyse microscopique de la synucléine dans des coupes de cerveau fixé s'effectuera avec du tissu prélevé d’animaux adultes.
L’altération de l’activité dopaminergique dans le système olfactif comme biomarqueur de vulnérabilité aux propriétés addictives de la e-cigarette et des e-liquides aromatisés ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans le cerveau et parfois équipées de fibres optiques lors d'une chirurgie d'une heure, 768 souris enchaînent jusqu'à vingt et une sessions de tests de trente minutes : vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. 192 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 576 autres un niveau modéré, et des séances de restriction hydrique complètent le dispositif. Le porteur affirme que la vaporisation de e-liquide "n'a pas d'effets nuisibles", alors que le projet vise précisément à mesurer l'imprégnation en nicotine et la vulnérabilité aux propriétés addictives des arômes. Toutes les souris sont tuées à l'issue de leur procédure, une partie après un transport vers un second établissement pour une dernière mesure électrophysiologique.
Objectifs
La nicotine possède la caractéristique étonnante de n’avoir que peu d’effets euphorisants comparée à la cocaïne ou le cannabis. Pourtant, elle induit très vite une consommation soutenue et abusive malgré les conséquences négatives. La spécificité des fumeurs est d’être hypersensibles aux stimuli sensoriels associés au tabac (l’odeur ou encore le goût de la fumée, le contexte environnemental) car ceux-ci acquièrent une forte valeur attractive à force d’associations. Les fumeurs sont attachés à « leur » marque de cigarette. L’importance des stimuli olfactifs dans les effets addictifs des produits du tabac est particulièrement soulignée dans le contexte récent avec l’explosion du vapotage, utilisant des e-cigarettes (e-cig) et e-liquides avec de multiples arômes développés pour rendre le produit attrayant et spécifique. Dans ce contexte, est faite la proposition de développer un projet de recherche préclinique ambitieux qui repose sur une combinaison d'interventions cérébrales dans un modèle comportemental in vivo innovant d'addiction au vapotage avec des investigations anatomiques et fonctionnelles du système olfactif mis en jeu lors du vapotage. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
D’un point de vue santé publique, les objectifs de ce projet apporteront de nouveaux éléments essentiels pour la réflexion sur l’innocuité supposée de l’usage de la e-cigarette et des e-liquides aromatisés. Ces informations sont cruciales dans le contexte où, spontanément, la e-cigarette est conseillée dans l’optique d’une réduction des risques et les usagers la considèrent comme moins nocive que la cigarette conventionnelle sans connaitre le risque addictif lié à l’usage chronique (Déclaration haut conseil scientifique).
Procédures
Selon les procédures, les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales (injection intracérébrale +/- implantation de fibres, 1h), et à divers tests comportementaux (maximum 21 sessions de 30 minutes environ selon les groupes) : test de vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. Pour une partie des animaux une procédure chirurgicale et des mesures électrophysiologiques seront réalisées dans un autre Etablissement Utilisateur.
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquelles des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place. Les animaux sont également soumis à la vaporisation de e-liquide qui permet une imprégnation en nicotine, mais cela n'a pas d'effets nuisibles et les chambres de conditionnement sont ventilées en temps réel pour permettre l'évacuation de la vaporisation en quelques secondes. Certains animaux seront soumis à des injections de façon quotidienne durant la durée des tests comportementaux. Le transport des animaux d’un établissement à un autre peut être source de stress. La contention des animaux lors de la connection/déconnection des fibres peut être source de stress, même si les animaux sont au préalable habitués au geste. Les séances de restriction hydriques peuvent également engendrer un stress.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés. Une partie des animaux sera transportée dans un autre établissement afin de réaliser une dernière procédure avant euthanasie.
Remplacement
Nous utilisons le modèle animal pour modéliser la pathologie humaine de l'addiction au vapotage. Notre projet repose ainsi sur une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal et impliquant le fonctionnement du système nerveux dans son intégrité. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser le nombre minimal de souris nécessaires pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'expérience, plusieurs tests sur les mêmes souris.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collectives (10/cage maximum) dans un milieu enrichi (litière de cellulose, carrés de cellulose et papier ouaté). La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement par le zootechnicien. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable du projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites fixés. Avant toute procédure, les animaux connaissent une période d’acclimatation de minimum 7 jours, durant laquelle ils sont délicatement manipulés (handling) de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé conformément à la charte de transport établit par l’Université de Bordeaux (distance de 50m, cages de transport adaptées et opaques, mesures d’hygiène respectées).
Choix des espèces
Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. Nos travaux considèrent la souris in vivo, et mettent à profit différents protocoles comportementaux irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain, ce qui permet de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre des comportements spécifiques liés à la toxicomanie. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 56 jours, soit l’âge adulte. Nous choississons ce stade dévelopemental qui correspond à une maturation complète du cerveau.
L’axe cerveau-intestin comme voie d’élimination des protéines toxiques de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour vérifier si une voie de communication entre le cerveau et l'intestin élimine les déchets cérébraux, 485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 115 d'entre elles sans jamais se réveiller et 370 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie de quinze minutes, un prélèvement sanguin, une heure d'imagerie sous anesthésie et une injection dans l'abdomen pratiquée sur animal vigile. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer une douleur post-opératoire, une perte de poids et une accumulation de liquide dans le cerveau. Le bénéfice annoncé se limite à de nouvelles perspectives de diagnostic précoce, et le choix de l'espèce repose sur des souris transgéniques exprimant les protéines toxiques de la maladie d'Alzheimer, auxquelles s'ajoutent des souris rendues déficientes pour l'élimination des déchets du cerveau.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la principale cause de démence chez l’Homme. Elle résulte d'une dégénérescence irréversible des neurones responsable d’un déclin progressif des principales fonctions d'apprentissage et de mémorisation dû à une accumulation cérébrale de protéines toxiques. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Une nouvelle voie de communication entre le cerveau et l’intestin a été identifiée, celle-ci pourrait être impliquée dans l’élimination des déchets du cerveau. Ce projet a pour but de confirmer cette hypothèse afin de développer de nouvelles méthodes de diagnostics de la maladie et donc d’augmenter l’efficacité des traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence une nouvelle voie d'élimination des protéines toxiques impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Ce nouveau mécanisme pourrait donner de nouvelles perspectives de diagnostic précoce de la maladie.
Procédures
Les animaux subiront une neurochirurgie (15 minutes), un prélèvement sanguin (moins de 10 minutes), un examen d'imagerie médicale (1 heure) et une injection dans l'abdomen (moins de 5 minutes). Seule l'injection dans l'abdomen se déroulera sur des animaux vigiles. La neurochirurgie, le prélèvement sanguin et l'examen d'imagerie médicale se dérouleront sous anesthésie.
Impact sur les animaux
La neurochirurgie et l'injection dans l'abdomen peuvent induire une douleur légère post-opératoire ainsi qu'une perte de poids. L'effet indésirable serait l'apparition d'une accumulation de liquide dans le cerveau. L'examen d'imagerie médicale peut induire une légère hypothermie.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des examens sur les tissus prélevés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants permettant cette étude. Ce projet porte sur un mécanisme d’interaction indirecte entre le cerveau et l’intestin nécessitant la mise en place de réseaux qu’il n’est pas possible de reproduire par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, le modèle souris permet d’avoir accès à des lignées génétiquement modifiées, modèles de la pathologie humaine.
Réduction
Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Les mises au point seront réalisées sur de petits groupes d’animaux.
Raffinement
Pour les animaux recevant des injections dans le cerveau, leur état de santé sera suivi tout au long de l’expérience. Des médicaments anti-douleur généraux et locaux seront injecté en sous-cutané en pré et post-opératoire afin de prévenir le développement de douleurs. Ces chirurgies se feront sous anesthésie. Les yeux seront protégés durant l’anesthésie avec un protecteur oculaire. Les animaux seront disposés sur une couverture chauffante à température contrôlée afin d’éviter l’hypothermie. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Aussi, des critères d'arrêt des souffrances seront clairement identifés afin de limiter les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans ce projet, l'existence de modèles transgéniques rongeurs exprimant des protéines toxiques impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie permet de mimer la maladie d’Alzheimer. De plus, des souris démontrant une déficience dans l'élimination des déchets du cerveaux seront également utilisées. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle de cette espèce en fait un modèle de choix pour cette étude. Les animaux seront utilisés à l’âge de 3 mois ou 9 mois afin d’étudier différents stades de la pathologie.
Genotypage invasif des lignees transgéniques
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Une biopsie de l'oreille ou du bout de la queue, moins d'une minute de contention, moins de 5 mm de tissu prélevé : l'acte est bref et il concerne 100 000 souris. Toutes sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, 10 000 sont annoncées comme réutilisées, les autres sont tuées, à l'issue d'un projet autorisé ou dès le génotypage quand elles ne portent pas le génotype recherché. Le porteur indique qu'au moins la moitié des souris nées dans son animalerie ne portent pas ce génotype, qu'un quart est utilisé pour des prélèvements de tissus et un quart pour des projets validés par le ministère. Le chiffre de 100 000 n'est adossé à aucun calcul dans le résumé, ni à un nombre de lignées, ni à une durée.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Il est nécessaire d'identifier tous les individus génétiquement modifiés dans le cadre de la gestion d’élevage afin de répérer les animaux d'intérêt pour les différents projets scientifiques.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
L’effet indésirable qui peut survenir est une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive à la queue ou à l’oreille, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par reproduction nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter la consanguinité, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie à l’oreille ou à la queue) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie à l’oreille prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 10 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées modifiées génétiquement permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. 5 à 10% des animaux sont utilisés après sevrage (entre 21 et 30 jours après la naissance) lorsqu'un génotypage précoce n'est pas nécessaire. Pour minimiser le stress, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris sont utilisées dans ce second établissement du projet, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées et leur cerveau prélevé pour des études ultérieures. Injections répétées d'amphétamine ou d'un bloqueur du transporteur de la dopamine, contentions, isolement, six à huit tests comportementaux passés une fois chacun. Le projet vise l'acquisition par le laboratoire de méthodes d'étude de la phase maniaque du trouble bipolaire, aucun traitement n'étant évalué à ce stade. Le porteur écrit que le stress chez l'animal "comme modèle de pathologie psychiatrique humaine" repose sur l'observation du comportement, et qu'aucune méthode in vitro n'y répond.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mettre au point des tests comportementaux dont le laboratoire déclare ne pas disposer mobilise 400 souris, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Cinq à sept injections intrapéritonéales d'amphétamine ou d'un stimulant du transporteur de la dopamine précèdent six à huit tests comportementaux, dont le test de préférence au sucrose sur cinq jours et le test du nid sur vingt-quatre heures. Le porteur indique que les stimulants peuvent provoquer de l'anxiété par leurs effets aigus, et des phénotypes anxio-dépressifs au sevrage. La mise à mort intervient en l'absence d'amélioration au bout d'une semaine, seule limite temporelle que le résumé oppose à la souffrance sévère déclarée pour 320 souris.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Investigation du rôle des systèmes neuromodulateurs dans l’alignement de l’axe vertébral du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 012 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 188 un niveau sévère. Une partie est exposée vingt heures par jour pendant quatre jours à un composé pharmacologique qui déforme la colonne vertébrale, avec une mortalité attendue jusqu'à 40 % chez les larves traitées. D'autres subissent une biopsie de la nageoire caudale, une immobilisation en gel d'agarose, une injection intramusculaire paralysante, puis jusqu'à quarante-cinq minutes d'illumination laser des tissus. Le porteur écrit que cette étude "ne peut donc être soumise au principe de remplacement", au motif que seules des espèces pourvues d'une colonne vertébrale permettraient d'étudier la scoliose.
Objectifs
Les déformations de la colonne vertébrale regroupent des pathologies de l’alignement du rachis qui surviennent autour de la période de forte croissance chez l’adolescent. Parmi elles, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la plus fréquente : elle consiste en des désalignements des vertèbres qui touchent 1 à 4% de la population. La correction de ces déformations spontanées, détectées principalement chez les filles, se base sur le port prolongé de corsets et sur des chirurgies invasives de fusions vertébrales dont le but est de recouvrer une posture correcte et d’atténuer les douleurs thoraciques associées. A ce jour, aucun traitement non invasif n’existe pour traiter la SIA, faisant de la compréhension de ses causes un enjeu majeur pour son traitement mais aussi pour sa détection précoce. L’étiologie de la SIA est restée longtemps peu comprise, principalement à cause de l’absence de modèles intégrant la complexité spatiale, temporelle et moléculaire, impliquée dans le développement et la consolidation du squelette vertébral. Récemment, le poisson zèbre a émergé comme un modèle puissant pour cette pathologie. Des travaux récents ont montré que le système nerveux est à l’origine de voies importantes, mais encore mal comprises, dans l’établissement de l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire. La finalité de ce projet est donc de comprendre, en utilisant le poisson zèbre comme modèle animal, par quels mécanismes le système nerveux influence l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux. Du point de vue scientifique, il permettra à court terme (pendant la durée du projet) de faire progresser les connaissances liées à l’influence du système nerveux sur l’alignement de la colonne vertébrale ainsi que sur les mécanismes sous-jacents qui se mettent en place au cours du développement post-embryonnaire et de la croissance de l’organisme. Du point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux marqueurs de progression ou de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles permettant d’infléchir l’évolution de la scoliose idiopathique de l’adolescent.
Procédures
Les signes cliniques attendus dans nos modèles de scoliose consistent en des déformations de la colonne vertébrale, sans troubles visibles attendus en termes de douleur, de nage, de comportement, ou d’alimentation (durée attendue des signes cliniques allant de 2 à 32 semaines en fonction des lots). Des animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques délivrés directement dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose (un traitement par animal 20h par jour avec 4h de récupération, pendant 4 jours ; durée attendue des signes cliniques de 8 jours). Les animaux, sous anesthésie profonde, seront soumis soit à une biopsie de la nageoire caudale (biopsie de 1-2 mm, une fois par animal, 30 secondes), soit à des immobilisations en gel d’agarose (indolore, 1 fois par animal, durée : 10 à 15 minutes) suivies d’injections intramusculaires (une fois par animal, 2 secondes) suivies de d’enregistrements non invasifs d’images en fluorescence à des stades du développement où ils sont transparents et optiquement accessibles (une fois par animal, 30 à 45 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La première catégorie d’effets indésirables attendus est liée à l’apparition de déformations de l’axe du corps chez des animaux mutants et chez des animaux exposés à des traitements pharmacologiques permettant établir notre modèle. Ce signe clinique apparait spontanément chez les mutants étudiés (à environ 2 semaines d’âge) et sera effectif jusqu’à la fin des procédures expérimentales associées. Il sera induit pharmacologiquement chez les animaux traités pendant une durée de 7 jours. Les observations reportées dans la littérature et nos observations préliminaires n’indiquent aucun impact détectable de ce signe clinique sur l’alimentation des animaux, leur comportement de nage en milieu aquatique, et leurs interactions en groupe social, suggérant des conséquences modérées en termes de stress, de douleur ou de mobilité. La deuxième catégorie d’effets indésirables attendus est liée aux actes expérimentaux nécessaires pour effectuer des expériences d’imagerie. Elle comprend le prélèvement des animaux de leur aquarium avec une épuisette, l’anesthésie, l’immobilisation d’animaux profondément sédatés, la paralysie par injection intramusculaire, et l’illumination des tissus avec un laser. Les effets indésirables prévus pour ces animaux couvrent donc le stress induit par la manipulation jusqu’à la sédation, leur immobilisation après une sédation profonde, la douleur causée par une aiguille permettant de procéder à une injection intramusculaire et l’illumination des tissus sous un microscope à fluorescence, couvrant une durée ne dépassant pas 60 minutes par animal. La troisième catégorie d’effets indésirables concerne la toxicité du composé pharmacologique délivré dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose, auquel les animaux seront exposés et qui nécessitera une modification des conditions d’hébergement (modification du cycle jour-nuit), pouvant générer un stress, et diminuera leur taux de survie pendant la période d’exposition. Enfin l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale chez des adultes sous anesthésie générale afin d’identifier leur statut génétique constitue la dernière catégorie de nuisance pour les animaux étudiés.
Devenir
Pour toutes les procédures de ce projet, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de nous permettre de réaliser les analyses prévues post-mortem. Elles comprennent des analyses de l’alignement vertébral, d’histologie, d’anatomie, et de prélèvement de tissus post-mortem qui seront utilisés pour des analyses de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal.
Remplacement
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale qui apparaît spontanément chez l’adolescent au cours de la puberté. L’étude des origines génétiques ainsi que des mécanismes biologiques qui la sous-tendent ne peut donc être réalisée que chez espèces pourvues de colonnes vertébrales. Aucune alternative non animale n’existe à ce jour permettant d’étudier ces questions, notamment le rôle du système nerveux dans l’alignement vertébral, ni de sonder les conséquences induites par la manipulation de ce système sur leurs cibles en aval. Cette étude ne peut donc être soumise au principe de remplacement.
Réduction
2012 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux prévus dans notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure en se basant sur : (i) l’identification de lots déterminés par les stades développementaux clés pour mener nos investigations et tester nos hypothèses de travail, (ii) une estimation de l’échantillonnage nécessaire pour détecter les effets biologiques testés, basée sur une comparaison statistique, (iii) la prise en compte d’une comparaison de groupes expérimentaux liée à l’identité génétique de frères et sœurs dont la distribution est connue, (iv) un taux de survie estimé à 80 pour cent pour les alevins mis élevage, (v) une mortalité maximale estimée à 40 pour cent pour les larves exposées au traitement pharmacologique permettant de mettre en place notre modèle, (vi) la prise en compte d’un échantillonnage équivalent de mâles et de femelles. Pour chaque quantification effectuée, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés dans nos procédures. Certains animaux seront utilisés pour mener des investigations post-mortem et répondre à plusieurs questions scientifiques. Pour chacune des procédures conçues, un nombre d’animaux inférieur à celui prévu sera utilisé si nos résultats sont statistiquement fiables avant l’utilisation de l’ensemble des animaux envisagés. En particulier, nous tenterons de développer une technique de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant leur mise en élevage. Si cette implémentation s’avère fructueuse, un nombre moins important d’animaux sera effectivement utilisé, notamment pour les groupes témoins, pour atteindre des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée, où les paramètres environnementaux sont vérifiés, contrôlés et adaptés si nécessaire (qualité et température de l’eau, cycle lumineux, etc.). Les animaux seront nourris 1 à 2 fois par jour avec une alimentation adaptée à leur stade physiologique. Les mesures spécifiques de raffinement qui seront prises incluent : (i) une surveillance accrue des mutants étudiés et des animaux soumis aux traitements pharmacologiques permettant d’induire des scolioses, afin de détecter et limiter les signes de mal-être liés à leur désalignement axial ou à l’exposition au composé pharmacologique utilisé à cet effet, (ii) l’hébergement des animaux par groupes de phénotypes semblables dès que possible au cours du développement post-embryonnaire afin de limiter un accès compétitif à la nourriture si cela est pertinent, (iii) l’utilisation d’une grille de score standardisée au sein de la structure d’hébergement, permettant d’évaluer les signes de mal-être, de douleur ou de souffrance et permettant une prise en charge rapide et optimale par l’utilisateur en coordination avec la structure chargée du bien-être animal et l’équipe vétérinaire, (iv) l’identification de points limites pour chacune des procédures permettant une prise en charge rapide et optimisée en fonction des procédures expérimentales, (v) l’utilisation d’un composé non aversif et à induction rapide pour l’anesthésie et l’euthanasie, (vi) le choix de manipulations douces des animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère), (vii) la mise en place d’une habituation des animaux à un changement environnemental lorsque cela est pertinent, (viii) l’optimisation d’une technique de biologie moléculaire permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant sa mise en élevage afin de permettre l’hébergement d’animaux qui auront des signes cliniques comparables, avant que ces derniers ne se déclarent ; (ix) une technique de biopsie sur animaux adultes sous anesthésie générale à induction rapide incluant des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec des outils désinfectés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude de la scoliose idiopathique de l’adolescent. En effet, sa colonne vertébrale partage les mêmes caractéristiques morphoanatomiques que celles de l’homme. Elle est soumise, du fait qu’il évolue en milieu dense, à des forces biomécaniques similaires à celles des espèces bipèdes, contrairement aux quadrupèdes dont le rachis subit des sollicitations influencées par une perception différente de la gravité. Le poisson zèbre possède un génome conservé à 70 pour cent avec celui de l’homme, permettant des analyses étiologiques poussées. Il présente enfin l’avantage de se reproduire en milieu externe et de rester optiquement transparent pendant une large partie de son développement post-embryonnaire, permettant d’implémenter des méthodes non invasives basées sur la microscopie in vivo afin de mener les investigations appropriées sans induire de dommages durables. Chez le poisson zèbre, des animaux âgés de 4 à 29 jours post fertilisation sont considérés comme des larves, des animaux âgés entre 30 et 89 jours post fertilisation sont considérés comme des juvéniles, et au-delà de 90 jours post fertilisation comme des adultes. Dans ce projet, 1556 animaux seront utilisés au stade larvaire (7 jours à 4 semaines post fertilisation), 52 animaux au stade juvénile (6 semaines post fertilisation) et 404 animaux au stade adulte (12 et 32 semaines post fertilisation) afin de répondre aux questions scientifiques testées.
Etude de la vulnérabilité aux maladies psychiatriques chez un modèle murin hypocholinergique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.
Procédures
Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.
Choix des espèces
Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.